使用基於細胞的免疫螢光法使用合成校正粒子自動測定免疫螢光灶點的方法和系統的製作方法

2023-10-04 21:42:49 1

使用基於細胞的免疫螢光法使用合成校正粒子自動測定免疫螢光灶點的方法和系統的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種通過使用合成校正粒子的免疫螢光法自動測定免疫螢光灶點的方法，以及實施該方法的系統和試劑盒。在一個優選實施方案中，該方法特徵在於免疫螢光灶點是γH2Ax灶點。
【專利說明】使用基於細胞的免疫螢光法使用合成校正粒子自動測定免疫螢光灶點的方法和系統
[0001]描述
[0002]本發明涉及用免疫螢光法自動測定細胞免疫螢光灶點的方法，所述方法包括提供待分析的細胞和合成校正粒子的混合物，藉以細胞和粒子固定至固相，檢測合成校正粒子，隨後基於對合成校正粒子的檢測校正並對焦螢光顯微裝置和自動評價系統，將所述混合物與一種或多種結合於細胞的靶底物的抗體溫育，通過所述螢光顯微裝置檢測與所述底物結合的抗體，並且使用所述自動評價系統由所述螢光顯微裝置產生的圖像數據測定免疫螢光灶點。在一個優選實施方案中，該方法特徵在於免疫螢光灶點是Y H2Ax灶點。
【背景技術】
[0003]使用不同免疫螢光設備和方法的不同實驗室之間的免疫螢光分析的標準化和自動化代表生物測定和診斷領域中的一項重大挑戰。高度敏感及選擇性地檢測和評價螢光信號，特別在基於細胞的測定中，已經導致作為用於生物分析和診斷中的最重要檢測方法的一些方法的螢光測定法的研發。螢光檢測，例如使用螢光顯微術的優點涉及檢測的高靈敏度、使用細胞中的靶物體的螢光標記的相對簡單的方法以及憑藉使用具有不同標記的不同靶物體的多重標記進行多個參數的平行分析的可能性。因此這種方法替代更複雜的方法如吸收測量法和複雜且有問題的放射測量法。
[0004]然而，間接免疫螢光試驗(IIF)的手工測定和評價受各種主觀因素影響並且額外地受專用裝置技術參數影響。除常使用的細胞底物和試劑之外，顯微鏡技術還包括螢光濾光片、物鏡、光源和待研究的螢光圖像的分析，因而這些因素的每一種均需要標準化，以便提供可靠和可比較的結果，尤其當考慮在採用不同顯微設備和方法的不同實驗室之間比較時。
[0005]對於健康產業而言顯示強大分析前景，但是在不同實驗室之間缺少足夠標準化和/或自動化的免疫螢光法的一個例子是通過檢測DNA雙鏈斷裂(DSB)分析DNA損傷，其中Y H2Ax是檢測DNA雙鏈斷裂的已知標記。
[0006]DNA代表包含單核苷酸的聚合物，所述單核苷酸自身包含鹼基、脫氧核糖和磷酸基。核DNA是遺傳信息的通用載體。在細胞核中，DNA與組蛋白形成複雜的結構，所述結構以核小體的形式存在，這使得控制多種核過程成為可能，原因在於染色質的結構布置。例如，在細胞分裂期間，在染色質中出現特定形態學變化，所述形態學變化允許形成固縮的染色體，所述固縮的染色體隨後對於染色體可靠地分離進入子代細胞是必需的。DNA複製和轉錄受複雜的酶系統調節，所述酶系統也必須與染色質相互作用，以便執行它們的功能，這代表維持細胞代謝的基礎。重要的是DNA分子本身和其內部所編碼的信息在各種細胞過程和核過程(例如，僅列舉幾例，轉錄、複製和細胞分裂)期間自始至終保持穩定。
[0007]細胞的DNA總是受各種代謝過程的直接或間接影響，所述代謝過程可以潛在地修飾DNA的分子結構。DNA結構的某些變化對維持或執行DNA功能是必需的，例如在產生抗體的細胞發育期間或當單個鹼基甲基化時在複製後立即出現短暫的鏈斷裂。[0008]然而，並不將壓倒性數量的此類變化(例如DSB)視作重要的或預期的事件，反而將其視為對完整生物潛在危險的突變的原因。除內源過程，例如因代謝產物諸如自由基之外，DNA損傷可以因外源過程，例如因電離、紫外輻射或致突變化學品而發生。
[0009]電離輻射可能導致許多人類的損害作用，而DNA DSB是最重要之一(1-3)。活組織的電離輻射作用是基於能量轉移到細胞上，因而細胞損傷的程度取決於多種因素。最重要的是放射核素的輻射物理特性、吸收劑量、暴露持續期、生物系統的輻射敏感性、局部能量沉積以及輻射的能量密度(線性能量轉移，LET) (4-7)。細胞的存活取決於其DNA的完整性，因而惡性細胞的根除可以因DNA的大量損傷而發生。作為物理過程的結果，DNA發生許多化學變化，這導致DNA損傷並因此導致突變和細胞可能死亡(8，9)。在這個意義上，生物上最相關的損傷涉及DNA的DSB和單鏈斷口(SSB)。
[0010]在真核細胞中，DNA是高度濃縮的並定位於染色質結構內，因而染色質的基礎元件是核小體，其包含圍繞蛋白質核芯(組蛋白八聚物)纏繞1.7圈的146個DNA鹼基對。核小體的蛋白質核芯由八聚物組成，所述八聚物包含以下每種組蛋白的兩個:組蛋白H2A、H2B、H3和H4。每種核小體進一步與Hl組蛋白結合,所述Hl組蛋白結合連接相鄰的核小體的DNA0組蛋白的修飾，如乙醯化、脫乙醯化或磷酸化，調節局部染色質結構並且因此在調控各種核功能，如複製、轉錄或DNA修複方面發揮作用。
[0011]在DSB後組蛋白修飾的一個例子是組蛋白H2Ax的絲氨酸139的磷酸化。絲氨酸139已經磷酸化的H2Ax常稱作Y H2Ax。H2Ax佔染色質中的H2A群體大致10%並且似乎均勻分布。如果DSB出現，則在數分鐘內H2Ax蛋白被磷酸化以形成yH2Ax。這種磷酸化藉助蛋白激酶(毛細血管擴張性共濟失調突變蛋白(ATM)、DNA依賴性蛋白激酶(DNA-PK)、毛細血管擴張性共濟失調及RAD3相關蛋白(ATR)發生(10-12)。磷酸化在DSB的最近接的區域內啟動並且從那裡擴展開來，從而最終H2Ax分子由DSB本身多達數百萬鹼基被磷酸化。可以作為灶點被檢測到的核複合體涉及由Y H2Ax、修復蛋白和作為細胞周期的檢查點控制蛋白發揮作用的蛋白質組成的蛋白複合物。
[0012]DNA雙鏈斷裂可以使用許多方法定量，如脈衝場凝膠電泳、彗星測定法或Tunnel測定法。然而全部這些方法均顯示相對低的靈敏度，這允許測定僅數個DSB/細胞。就彗星測定法而言，DSB可以與背景可靠區分的閾值是大約4Gy的輻射劑量。在這種輻射劑量，存在大約160個記錄到的DNA DSB。
[0013]通過免疫化學研究，已經顯示可以使用免疫螢光法，通過測量YH2Ax灶點定量DNA DSB (13)。使用這種方法，用重離子輻射後和電離的光子輻射輻射後可檢測灶點的數目與DNA DSB的預期數目和預期位置成正比。這種定量DNA DSB的方法足夠靈敏，從而可以在微Gy範圍內測量DNA DSB。使用免疫螢光法，通過絲氨酸139磷酸化的組蛋白H2Ax(YH2Ax)的染色來定量灶點，代表了相對新且靈敏的對電離輻射作用後大量DNA DSB定量的方法。
[0014]涉及使用Y H2Ax檢測DSB的全部實驗的大多數涉及使用螢光顯微術的免疫細胞化學實驗和評價和/或分析。通過這種方法，除源自實驗細胞系的細胞之外，來自患者的人單核細胞也已經在暴露於電離輻射後被測試。然而，該方法或使用免疫螢光顯微術測定H2Ax灶點仍是相對地費時的，易受使用者偏好和技術設備的差異影響並且總體上是一種主觀分析方法(14)。對於檢測YH2Ax灶點，先前僅使用手工顯微方法。[0015]使用智能軟體算法的YH2Ax灶點的模式識別的描述目前限於一些學術研究(14，15)。這些研究展示了自動檢測和評價YH2Ax灶點的可能性。然而，目前不存在適於用商用設置自動評價YH2Ax灶點的算法的證據。必須計數細胞中的灶點(光點)(從0至40)並且通過測試細胞中的有效數字驗證結果(100個細胞/載玻片)。免疫螢光篩選方面的發展現狀趨向於可以單獨配置的模塊化、靈活和緊湊系統，這使得測量標準化。自動化判讀系統，如AKLIDES，代表了可以按靈敏和有意義方式檢測螢光信號的螢光光學測量系統。這類系統包括機動倒置螢光顯微鏡、數位照相機、機動xy_平臺和具有合適的用於評價和分析的軟體的計算機。可以使用數字圖像處理算法以標準化方式自動地識別並描述待檢測的物體，如珠或細胞結構。
[0016]直至現在，關於是否可以使用自動檢測系統獲得YH2Ax灶點的模式識別，仍沒有令人滿意的經驗或報告(16)。除了通過這類分析法產生的複雜的免疫螢光模式之外，圍繞YH2Ax灶點自動模式識別的複雜化還涉及基於細胞的測定法的複雜結構。另外，沒有闡明對方法的標準化而言非常重要的校正。迫切需要適宜的校正試劑，所述校正試劑使得使用自動化解釋系統測定和分析H2Ax灶點成為可能。
[0017]校正Y H2Ax檢測法的技術問題在於用於定量信號的免疫螢光圖像的多樣性。明顯重要性是在單獨的H2Ax灶點之間存在重疊和疊掩(layover)。這些效應可以在定量時產生嚴重問題。另外，用來分析Y H2Ax灶點的系統中基於細胞試驗的各種和不同特性代表針對程序標準化的嚴重挑戰(17，18)。
[0018]自動顯微解釋系統可以使用分析系統的技術組件，如流通細胞測定術中常使用的校正劑(例如合成性微粒)標準化。
[0019]用於這類自動標準化的智能算法由測定提供該算法的指導原則限定(19-21)。通過排除主觀影響因素，自動化客觀方法充分適合這類標準化。在這個意義上，乍一看來，自學習系統似乎是技術上合適的。然而，在仔細檢驗後，表明自學習系統實際上不適於YH2Ax灶點分析的標準化。具有自學習軟體(尤其可以修改已知模式並且還從使用者接收關於新模式的輸入的軟體)裝置的世界範圍分布將改善每個獨立實驗的獨立分類成功率。然而，現狀是每種獨立自學習系統傾向於彼此獨立開發，從而學習過程傾向於向越來越遠離系統中提供的原始數據而推進(20，21)。這種情況的結果是自學習系統提供局部(特定實驗室)改善，而不是增強共同的實驗室間標準化。
[0020]因此，用統計學上定義的使用標準分析參比試劑(如微粒)的方法，YH2AX灶點的世界範圍分類標準才能校正該方法，那麼這為自動化光學解釋提供基礎。
[0021]發明簡述
[0022]通過併入標準化試劑和方法，可以建立與遍及世界的不同技術設置相容的分析平臺。技術設置的差異涉及不同顯微鏡設置、產生螢光的不同方法或用於檢測螢光灶點的不同軟體設置。標準化方法克服這些差異並且最終使精確和可靠地測量生物樣品中的螢光灶點成為可能。在本發明的一個方面，這隨後可能增強疾病診斷的準確度，諸如由改變的免疫螢光灶點數目，例如DNA雙鏈斷裂數目增加所代表的疾病診斷。當螢光灶點的測量作為標記表示疾病並且標準化方法大規模用於研究這類標記時，分析和診斷的可靠性大幅度地增力口。另外，可以隨時間推移彙編數據，導致可獲得巨大數據集以用於進一步診斷。僅通過標準化方法，可以在準確度方面改善自動化診斷，這需要可以在不同顯微設置上可靠地用於定量，獲得相同的可量化結果的新方法。在目前，現有技術中沒有記載用於螢光灶點數標準化評估，適於分析如本文所述的生物樣品的可靠方法。
[0023]根據現有技術，本發明基礎下的技術問題是提供用免疫螢光法客觀地自動測定免疫螢光灶點的方法。
[0024]這個問題由獨立權利要求的特徵解決。本發明的優選實施方案由從屬權利要求提供。
[0025]因此，本發明的一個目的提供用免疫螢光法自動測定細胞免疫螢光灶點的方法，所述方法包括:
[0026]a.提供待分析的細胞和合成校正粒子的混合物，藉以將細胞和粒子固定至固相，
[0027]b.檢測合成校正粒子，隨後基於合成校正粒子的檢測將螢光顯微裝置和自動化評價系統校正並對焦，
[0028]c.將所述混合物與一種或多種結合至細胞的靶底物的抗體溫育，
[0029]d.通過所述螢光顯微裝置檢測與所述底物結合的抗體，以及
[0030]e.使用所述自動化評價系統由所述螢光顯微裝置產生的圖像數據中測定免疫螢光灶點。
[0031]本發明可以用於自動測定螢光顯微術中出現的任何免疫螢光灶點。在一個優選實施方案中，該方法特徵在於所述免疫螢光灶點是YH2Ax灶點。H2Ax灶點特別適於採用本發明方法分析和/或測定，原因在於它們在細胞核內部的尺寸和其他視覺特徵和物理特徵。鑑於胞核內簇集空間分布的灶點的潛在重疊，由於H2Ax灶點的尺寸，定量可能變得非常困難。本發明解決了該問題並且使得可靠自動化定量分析H2Ax灶點成為可能，這代表與那些先前已知方法相比令人驚訝和有利的進步。
[0032]在一個優選實施方案中，該方法特徵在於所述合成校正粒子是微粒，優選地具有1-1OOiim之間的直徑。直徑範圍1-1OOiim的粒子包括直徑為大約1、10、20、30、40、50、60、70、80、90或10011111和落在該範圍內任何值的粒子。然而，粒子可以具有任何尺寸，只要所述粒子適於對焦和校正所述顯微系統。這種特定尺寸(直徑1-100 ym)的粒子令人驚訝地有利，因為它們為顯微裝置提供適宜的校正而與待分析的灶點尺寸無關。可以使用以這種尺寸的粒子校正過的系統可靠地分析H2Ax灶點，以及更大或更小的灶點。
[0033]在一個實施方案中，該方法特徵在於使用螢光標記特異性標記所述合成校正粒子和/或抗體。在一個優選實施方案中，在啟動該方法或系統之前，已經用突光試劑標記粒子。粒子也可以使用螢光標記的抗體或其他這類手段進行標記，以便可以為校正而檢測並且測量粒子。如果需要，結合粒子或與灶點相對應的細胞底物的獨立抗體(每個均顯示不同的螢光標記)可以在校正之前與固相表面上的細胞和粒子共溫育。粒子的物理或其他特徵也可以用於檢測粒子和後續校正，如形狀、顏色或反射特性，從而顯微裝置的校正和對焦不依賴於螢光，而依賴於使用任何合適的方法檢測粒子。
[0034]在一個優選實施方案中，該方法特徵在於所述抗體涉及一種或多種與細胞的靶底物結合的第一抗體，和一種或多種經螢光標記並且與第一抗體結合的第二抗體，從而促進作為免疫螢光灶點的結合底物的檢測。
[0035]在一個優選實施方案中，該方法特徵在於所述細胞選自單核細胞血細胞，如淋巴細胞、單核細胞和/或巨噬細胞，體外培養的細胞如成纖維細胞，或來自實驗細胞系的細胞。分析從血液獲得的細胞或本文所述的其他細胞提供了預料不到的優點:細胞可以容易地和可靠地迅速固定至固相用於分析，從而結合所述粒子，待分析的物體處於固定的位置，因此使得可靠定量成為可能。
[0036]在一個優選實施方案中，該方法特徵在於:步驟b )中的所述校正或步驟e )中的所述測定包括通過檢測染色或標記的細胞核，優選地通過檢測DAPI染色的細胞核，額外地檢測並定位細胞。其他染色法可以用於檢測DNA並因此測定細胞核位置，如Hoechst染色法或其他結合或鑑定DNA的試劑。在一個優選實施方案中，該方法特徵在於所述測定提供每個細胞的灶點數的測定。每個細胞的灶點的計算結果最終在允許與其他數據集比較的自動化分析中提供信息。這種定量可以用於診斷與灶點數量變相關的任何給定疾病。
[0037]在一個優選實施方案中，該方法特徵在於:步驟e)的所述自動化評價系統包括具有將可執行指令作為軟體儲存的計算機可讀存儲器的計算裝置，所述計算裝置由模塊組成，當由計算機執行時，所述模塊執行自動對焦控制、自動化圖像採集、自動化圖像分析和/或自動化模式識別的功能。評價系統允許基於顯微裝置產生的圖像數據分析和計算灶點數。為了實施灶點數的這種評價和測定，就各個灶點的形狀、尺寸和強度自動地分析圖像。因此鑑定灶點的規則體現在在評價系統的計算裝置上運行的電腦程式中。
[0038]在一個實施方案中，該方法特徵在於藉助顯微圖像的動態自動對焦發生突光顯微裝置和自動化評價系統的對焦。
[0039]本發明還涉及如本文所述的方法用於測定細胞和/或細胞群體中DNA雙鏈斷裂的數目的用途，其中YH2Ax灶點的數目與DNA雙鏈斷裂的數目成正比。如上文所述的，了解了在DNA損傷的背景下作為形成H2Ax的基礎的關係和生物學機制。然而，仍不可獲得用於可靠地自動定量這類灶點的方法。
[0040]本發明進一步涉及如本文所述的用途，其用於測定細胞和/或細胞群體中的DNA損傷，藉以
[0041]a.將測試細胞中Y H2Ax灶點的數目與對照細胞中Y H2Ax灶點的數目比較,並且
[0042]b.與對照細胞相比，測試細胞中每個細胞的H2Ax灶點數目更多表示測試細胞中DNA損傷增加。
[0043]在一個優選實施方案中，如本文所述的方法適用於測定細胞和/或細胞群體對電離或任何其他類型輻射或任何其他DNA損傷性物質或治療的輻射暴露。使用如本文所述的方法，獲得關於已經在細胞或細胞群體中出現的DNA損傷的定量性信息，因而深入了解作為疾病基礎的機制或鑑定疾病，例如在鑑定癌症患者或癌症風險患者的診斷性應用中使用該方法時。
[0044]使用YH2Ax檢測以測定DSB誘導的程度可能有助於檢測癌前期細胞、癌症分級、檢測癌症療法的有效性和開發新抗癌藥物。
[0045]本發明還涉及通過根據如本文中所述方法的用免疫螢光法自動測定免疫螢光灶點的系統，所述系統包括
[0046]a.待分析的細胞和合成校正粒子的混合物，藉以將細胞和粒子固定至固相，
[0047]b.螢光顯微裝置，包含帶有照相機、機動掃描臺和多通道發光二極體(LED)的螢光顯微鏡，和
[0048]c.自動化評價系統，包括具有將可執行指令作為軟體儲存的計算機可讀存儲器的計算裝置，所述計算裝置由模塊組成，當由計算機執行時，所述模塊執行自動對焦控制、自動化圖像採集、自動化圖像分析和/或自動化模式識別的功能，藉以分析兩個以上顏色通道，每個通道對應於合成校正粒子或靶底物相關的免疫螢光灶點。
[0049]專門開發本發明的系統用於實施如本文所述的方法。該系統包含直接並且特別地與該方法相關的組件，因而構成統一的發明。該系統的內容物和在如所述方法中應用的那些試劑代表對現有技術的獨特貢獻，因此證明本發明的單一性。本發明也涉及試劑盒，其被明確地開發以用於實施本發明的方法。就該系統而言，試劑盒包含針對本發明所定製的內容物(例如具有固定粒子的載玻片)，因此代表統一的發明的一個方面。
[0050]本發明因此還涉及用於實施根據如本文中所述方法的用免疫螢光法自動測定免疫螢光灶點的方法的試劑盒，所述試劑盒包含
[0051]a.一種或多種固相，包含固定至所述固相表面的合成校正粒子，待分析的細胞將固定在所述固相表面上，
[0052]b.一種或多種偶合物，包含與螢光標記物偶聯，優選地用作第二抗體的免疫球蛋白特異性抗體，和任選地
[0053]c.洗滌緩衝液、蓋玻片、覆蓋介質和/或用於合成校正粒子、第一抗體和/或第二抗體的螢光標記物。
[0054]發明詳述
[0055]合成校正粒子涉及任何物質或材料(例如本領域已知的適用於本發明方法的那些)的微粒、珠或載體，例如，由天然或人工聚合物、瓊脂糖凝膠、纖維素、玻璃或金屬氧化物組成的微粒、粒子或珠。校正粒子能夠用螢光標記標記或優選地是已經具有螢光的，從而不需要額外的螢光標記物。螢光標記物可以指本領域共知的那些，如螢光蛋白如GFP，或羅丹明、螢光素或其衍生物如FITC、TRITC或任何種類的合適螢光團。
[0056]待檢測的靶底物涉及在細胞內部和/或在細胞上空間分布的細胞結構，在抗體結合和/或檢測後，所述細胞結構導致免疫螢光灶點形成。
[0057]因此,本發明的細胞免疫螢光灶點是對於作為任何直徑或形狀的免疫螢光點的檢測而言足夠清晰的任何免疫螢光圖像物體，所述細胞免疫螢光灶點的特徵在於它與圖像的背景可區分。灶點尺寸、形狀或其他視覺特徵也可以測量並且併入本發明方法的分析結果中。
[0058]術語「自動化」涉及一種某種程度、優選地巨大程度或完全在沒有使用者直接介入的情況下實施的過程，因而減輕系統和/或方法受使用者的主觀影響。
[0059]免疫螢光法是涉及抗體與目的底物結合或相互作用或抗體樣分子(如抗體片段或非抗體肽)與目的底物結合併隨後基於螢光檢測所述相互作用的任何測定法。
[0060]待分析的細胞和合成校正粒子的混合物涉及以任何比例的混合物。校正粒子的數目僅必須是足夠的以便顯微鏡可以檢測它們並且執行校正和對焦。粒子可以比細胞多或細胞比固相表面上的粒子多。
[0061]術語「固定」或「固定化」涉及使細胞與固相結合或連接的任何方法。原則上，固定涉及對粒子和細胞的物理約束，因而可以進行可靠的定量，即便顯微鏡穿過固相的多個區域拍攝各種圖像。
[0062]術語「固相」優選地涉及載玻片，但是可以涉及提供表面用於分析粒子和細胞的任何固相。可以使用玻璃或合成材料(如塑料)的顯微鏡載玻片，也可以使用任何微量滴定平板或可以進行微粒和細胞固定的其他孔樣結構。術語「固相、載玻片或分析表面」可以在本申請通篇範圍內互換使用。
[0063]合成校正粒子的「檢測」主要涉及測量粒子的尺寸、形狀或其光強度或螢光強度。粒子的任何特性可以用於檢測和後續校正和對焦，只要該特性允許使用本發明的顯微裝置檢測。
[0064]顯微裝置和/或評價系統的校正涉及對裝置設置的任何必要調整，如被認為對最佳圖像採集必需的。這類校正測量是顯微術領域技術人員已知的。
[0065]顯微裝置的對焦涉及如本領域技術人員所理解的對焦，以便獲得清晰圖像。如下文實施例中所用，一個例子是通過樣品的微粒的去卷積計算點擴散函數(PSF)，並且該PSF隨後用於分析灶點。
[0066]螢光顯微裝置和自動評價系統一般如本領域和基於計算機的評價系統中常用的顯微裝置，其中所述評價系統能夠實施用於檢測和分析圖像數據的基於軟體的算法。下文提供實施例。
[0067]附圖
[0068]本發明由附圖進一步描述。這些圖不意在限制本發明範圍。
[0069]附圖簡述
[0070]圖1:在具有校正微粒的載玻片上的被輻射的固定細胞中YH2Ax灶點的免疫螢光圖像捕獲。
[0071]圖2:使用標準化微粒時自動化Y H2Ax測量的示意圖。
[0072]圖3:考慮檢測器中所測量的螢光強度的複雜的依存關係時微粒的強度測量的原理。
[0073]圖4:對暴露於0和IGy188Re後30分鐘的PC C13細胞系中IR引起的灶點，針對磷酸化的組蛋白H2AX ( YH2Ax灶點)的免疫螢光法染色。對照(小圖A-C)和用IGy輻射後(小圖D-F)的代表性圖像的例子。通過自動化系統AKLIDES以60x放大率拍攝照片。DAPI核染色(A，D)、對照的背景Y H2Ax灶點(B)和被輻射的細胞的yH2Ax灶點(E)以及合併的螢光圖像(C，F)。小圖G顯示捕獲細胞(圓圈)的圖像，伴以數字式計數灶點的結果(點)。
[0074]圖5:通過數字評定數據(AKLIDES)，對採用多種劑量188Re輻射的PC C13細胞所獲得的劑量響應曲線(平均灶點數目/細胞土SD)。
實施例
[0075]本發明由以下實施例進一步描述。這些圖不意在限制本發明範圍。本文所述的方法用於實施如實施例中所展示的本發明中。它們意在通過實用實施例進一步描述本發明並且不代表本發明的限制說明。 [0076]實施例 1:例證本文所述的使用合成校正粒子藉助免疫螢光法自動測定免疫螢光灶點的方法:
[0077]校IH微粒在載玻片上的固定
[0078]玻璃載片的每個施加點用10 U I聚賴氨酸(Sigma，5 U g/ml)包被並且在溼潤的烘箱中溫育4小時。在使用PBS從載玻片衝洗掉未結合的聚賴氨酸後，將IOiU校正微粒懸液(每個施加點6000個校正微粒)吸至溼潤的施加點。這種懸液隨後在無菌櫃下乾燥並且使其停留在載玻片上過夜。
[0079]製備淋巴細胞懸液用於檢測外周單核血細胞中的DSB
[0080]將試驗對象的血液樣品顛倒兩次。將3ml未凝固的血液(比率1:1)吸到離心管的分離膜上並隨後在室溫以IOOOXg在不制動的情況下離心10分鐘。使用1000Ul移液器，將單核血細胞帶小心地取出，並隨後轉移至新的離心管並放置在冰上。
[0081]全部其他步驟均在冰上進行或離心在4°C進行。將單核血細胞與相同體積的PBS混合，並將管顛倒3-4次以便混合溶液。隨後將混合物以300Xg (1400轉/分鐘)離心10分鐘。使用真空泵和移液器吸頭移除上清液。隨後將沉澱物使用9ml蒸餾水重懸，室溫溫育12秒並隨後與Iml冷10XPBS緩衝液混合。整個過程重複2次。
[0082]將細胞固定到具有固定的校IH微粒的載玻片
[0083]在測定純化的細胞懸液中細胞的數目後(通過計數板),將150，000個細胞接種到載玻片的每個施加點上，所述載玻片包含固定的校正微粒。將相應體積的細胞懸液吸到高壓滅菌的玻璃皿上並且用培養基填充至必需體積。隨後轉移50 u I混合的懸液至在室溫下溫育I小時的載玻片的施加點。
[0084]為了接種事先已經用放射性物質(例如188Re-高錸酸鹽)處理的來自實驗細胞系的細胞，每個施加點使用70，000個細胞。在提供相應體積的懸液後，使載玻片上的細胞在細胞離心機中以250U/分鐘沉降3分鐘。
[0085]在室溫下在含有1%甲醛的染色託盤中進行細胞固定15分鐘。在固定後，將載玻片在PBS浴中洗滌3次持續5分鐘，同時溫和地振搖。為透化固定的細胞，將載玻片與l%triton-X100/PBS溶液溫育3次持續5分鐘。隨後，將載玻片在PBS浴中洗滌3次，同時溫和地振搖。為封閉游離結合位點，將載玻片置於培養箱中並隨後乾燥。在乾燥後，將25 Ul的1%PBS-BSA-溶液施加至每個施加點並溫育30分鐘。
[0086]免疫螢光染色
[0087]將細胞覆蓋的載玻片置於培養箱中，並將25ii I第一抗體施加至每個施加點(在PBS/BSA1%中1:1000稀釋)並且在室溫下溫育I小時。隨後，使用含有PBS溶液的淋洗瓶小心地淋洗載玻片，並此後在PBS中洗滌3次持續5分鐘，伴隨溫和振搖。此後，將25 ill螢光標記的第二抗體(在PBS/BSA1%中1:1000稀釋)吸至施加點並覆蓋。載玻片隨後在室溫下溫育I小時。在溫育後再次洗滌載玻片。為了在AKLIDES系統上自動解釋載玻片，將覆蓋介質施加至每個施加點並且小心地封裝蓋玻片。關於實施例圖像，見圖1。
[0088]使用AKLIDES系統通過校lH微粒自動標準化解釋細胞
[0089]AKLIDES系統的技術基礎涉及倒置機動螢光顯微鏡1X81 (Olympus，日本)，其中可以通過AKLIDES軟體完全控制所述螢光顯微鏡。通過機動Xy臺(M120, Marzhauser,Wetzlar)、用於突光圖像的靈敏灰階照相機(PS4, Kappa, Gleiche)和作為光源的可控發光二極體(LED) (PrecisExcite, CoolLed, UK)的組合，螢光檢驗的自動化捕獲和處理成為可能。可以使用多種載玻片或平板作為樣品載體，除微量滴定平板(24、48、96、384、1532孔)之夕卜，所述載玻片由各種樣式組成(1、6、12，18孔)。專門開發的軟體控制各部件的相互作用並且接管試驗的自動對焦和質量控制。隨後在測量間，使用圖像分析算法直接評價捕獲的圖像數據。使用不同規格的物鏡(從1.25x至60x)和高透射螢光濾光片(光譜為350-700nm)，可以分析和/或組合龐大數目的試驗和螢光對象。
[0090]自動化Y H2Ax測量的示意圖，見圖2。
[0091]在開始測量時，具有標準化尺寸和亮度(單位:等同可溶性螢光物質的MESF分子，來源:Schwartz2004)的微粒用於對焦。
[0092]微粒用於對焦的用途代表與所用細胞系無關的極高對焦質量。可以鑑定人為現象並從分析結果中 輕易排除。另外，檢測波長中的整個光路被校正。通過樣品的微粒的去卷積計算點擴散函數(PSF)，並且該PSF隨後用於分析H2Ax灶點。通過這個校正步驟增加測量的精度，因為通過知曉PSF可以計算出焦平面外部的光。
[0093]在第二檢測通道中進行灶點的測量，在所述第二檢測通道中粒子用於強度和尺寸校正。圖3顯示檢測原理和強度的計算。微粒因它們的尺寸和形狀特徵而被檢測並且從微粒的中心測量微粒的強度。在製備時，直接通過參照測量的灶點尺寸和強度對YH2Ax灶點進行標準化分析是可能的。通過這種方案，使用如本文所述的校正微粒，可以比較多種光學檢測方法和光學分解。
[0094]實施例2:例證如本文所述的方法用於測定細胞中DNA雙鏈斷裂數目、用於測定DNA損傷或用於測定細胞和/或細胞群體對電離或任何其他類型輻射的輻射暴露的用途
[0095]放射性核素
[0096]通過洗脫40GBq氧化鋁基188W/188Re發生器(ITG，Munchen,德國)獲得188Re-高錸酸鹽(188ReX 188Re的物理特徵:物理半衰期16.9小時，最大^能量2.1MeV, y發射155keV(15%豐度)。該發生器用5ml0.9%鹽水洗脫以獲得約1.0GBq/ml無載體188Re的放射性濃度。
[0097]細朐培養
[0098]甲狀腺大鼠細胞系PC C13 (核醫學臨床合作單位，DKFZ, Heidel-berg,德國)是在美國典型培養物保藏中心(ATCC)中可獲得的FRTL5細胞系的鈉碘共轉運蛋白(NIS)陽性株。該細胞在Ham’sF12培養基中常規培育為貼壁單層(Gibco InvitrogenGmbH, Darmstadt,德國),所述培養基補充有5%胎牛血清、胰島素(10 u g/ml)、氫化可的松(10nM)、轉鐵蛋白(5 ii g/ml),生長抑素(10ng/ml)、甘氨酸-組氨酸-賴氨酸(10ng/mL)和TSH (10mU/ml)。使用Accutase (PAA實驗室GmbH C61be，德國)，將指數生長的細胞每3日常規地分瓶。培養物維持在37°C、增溼的5%C02、空氣氣氛下。每2-3日以及在應用放射性之前更換培養基。
[0099]輻射實驗
[0100]對於實驗，將0.5xl06個細胞/孔的等分試樣以每孔2ml無活度標準培養基的體積接種在六孔組織培養平板中並且在輻射之前預培養2天。為抑制由NIS介導的放射性核素主動轉運，將細胞與充當188Re的競爭性抑制劑的0.4mM終濃度的高氯酸鈉(NaClO4)預溫育
(23)。在與NaClO4溫育10分鐘後，將188Re溶液添加至細胞，每個計量點使用一個孔。使用
5.7-57MBq/2ml 188Re的放射性濃度，其對應於0.5_5Gy的胞外劑量(使用劑量點核函數計算)(23，24 )。在37 °C進行輻射I小時。在暴露於188Re後，細胞用PBS洗滌並通過添加Accutase(PAA，Coelbe，德國)收穫細胞。所產生的細胞懸液在1.5ml培養基中含有約0.5X IO6個細胞。在輻射後立即進一步處理細胞用於YH2Ax灶點評價。
[0101]免疫組織化學和灶點分析
[0102]對於免疫染色，通過細胞離心塗片機(Hettich Universal30RF, HettichGmbH, Tuttlingen，德國)，250轉/分鐘，3分鐘，將輻射的細胞離心到玻璃載片上，每個點約70，OOO個細胞。隨後，將細胞在室溫下在4%福馬林中固定15分鐘。在固定後，用PBS洗滌細胞3次。為滲透細胞膜，添加0.l%Triton XlOO並溫育5分鐘3次，隨後用PBS洗滌三次。
[0103]與PBS中的1%牛血清白蛋白(BSA/PBS)溫育30分鐘後，BSA/PBS中1:800稀釋的抗-磷醯-組蛋白H2A.X (Serl39)，克隆JBW301 (小鼠，單克隆IgGl，MilliporeGmbH, Schwalbach，德國)在室溫下溫育I小時。在三個洗滌步驟後，將1:800稀釋的與Alexa Fluor488 (Invitrogen,卡爾斯魯厄,德國)偶聯的抗小鼠IgG在黑暗下溫育I小時。為了 DNA染色，在另一個洗滌循環(3XPBS)後，添加4』，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI, Sigma-Aldrich, Taufkirchen,德國)保持10分鐘。將載玻片再次洗滌兩次並用螢光封固劑(Dako Deutschland GmbH, Hamburg,德國)封裝。
_4] yH2Ax灶點的自動化解釋
[0105]用於評價免疫螢光模式如H2Ax灶點的全自動化解釋系統AKLIDES的概念基於新的模式識別的數學軟體算法。使用具有機動掃描臺(頂120，Miirzhiiuser,德國)、400nm和490nm發光二極體(LED) (PrecisExcite, CoolLED, UK)和電荷耦合器件(CCD)灰階照相機(DX4, Kappa,德國)的機動倒置螢光顯微鏡(01ympusIX81，Olympus，日本)自動評估Y H2Ax灶點。
[0106]該解釋系統受AKLIDES軟體(Medipan，德國)控制，所述軟體由用於裝置和自動對焦控制的模塊、具有模式識別算法的圖像分析模塊組成。藉助灰階轉變，新的基於對象的Haralick圖像表徵的自動對焦過程使用DAPI作為螢光染料或使用本發明的用於對焦、質量評價和對象識別的微粒。AKLIDES系統的掃描算法依次地選擇載玻片孔的位置並且以DAPI通道模式對細胞層對焦。
[0107]照相機積分時間的再調節確保細胞核正確地暴露。隨後對獲得的圖像進行質量屬性評價。在人為現象的情況下，將自動地選擇新的亞孔(sub-well)位置。此後，在三個Z-層中捕獲檢測的細胞的免疫突光。針對每個層選擇細胞特徵以及組合特徵使得灶點計數的計算成為可能(圖2)。
[0108]自動Y H2Ax灶點圖像處理的技術方面
[0109]使用60X物鏡，以DAPI螢光通道恰當地進行自動圖像捕獲過程。開始使用寬Z-步驟(10 y m)粗對焦，隨後用窄Z-步驟(0.5 u m)精細對焦，可以確保檢測到主焦平面。為改變螢光波長，與產生IOOrns的標準轉換時間的雙波段濾光片組合，轉換激發波長。鑑於「即時(on-the-fly)」分析圖像的重要性，通過分析的性能、可擴展性和質量選擇算法。為了消除人為現象，通過將圖像內容劃分成至尺寸相等的圖塊隨後計算圖塊清晰度和均勻性，進行額外的定性圖像分析。通過基於直方圖的閾值算法隨後進行分水嶺變換而進行目標分害I]。通過分析對象的凸度(convexity)排除細胞團塊和嚴重受損的細胞。分段核以局部、拓撲形貌和質地/表面描述符為特徵。通過計數每個細胞中離散的灶點的數目對YH2Ax灶點進行定量。離散的灶點的位置的定義是a)比8個相鄰像素更亮的像素，b) I個像素與相鄰灶點的最小距離(像素大小:110nm)，和c)最小亮度(比細胞的平均亮度亮)。計數每個載玻片上含有100個細胞的最少10個視野。
[0110]在4圖中顯示暴露於OGy和IGy188Re後的PC C13細胞的免疫螢光圖樣的代表性圖像，其通過針對Y H2Ax灶點的染色和針對IR引起的灶點的核染色而獲得。如果需要，可以使用DAPI作為用於另外的質量評價的螢光染料(圖4A，4D)。在圖4G和圖5中展示自動計數的灶點的結果。
[0111]如可以在圖5中見到，每個細胞核的灶點數目響應於輻射劑量增加而增加。除了手工(目視)評估螢光灶點數目之外，在用如本文所述的自動化系統測量時，觀察到這種效果。這展示了本發明的自動化方法和系統用於測定細胞中DNA雙鏈斷裂數目，用於測定DNA損傷或用於測定細胞和/或細胞群體對電離或任何其他類型輻射的輻射暴露的有用性。
[0112]參考文獻清單
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【權利要求】
1.用免疫螢光法自動測定細胞免疫螢光灶點的方法，包括: a.提供待分析的細胞和合成校正粒子的混合物，藉以將細胞和粒子固定至固相， b.檢測合成校正粒子，隨後基於所述合成校正粒子的檢測將螢光顯微裝置和自動化評價系統校正並對焦， c.將所述混合物與一種或多種結合至細胞的靶底物上的抗體溫育， d.通過所述螢光顯微裝置檢測與所述底物結合的抗體，以及 e.使用所述自動化評價系統由所述螢光顯微裝置產生的圖像數據測定免疫螢光灶點。
2.根據前述權利要求所述的方法，其特徵在於所述免疫螢光灶點是YH2Ax灶點。
3.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其特徵在於所述合成校正粒子是微粒，優選地具有1-100 u m之間的直徑。
4.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其特徵在於使用螢光標記特異性標記所述合成校正粒子和/或抗體。
5.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其特徵在於所述抗體涉及一種或多種與細胞的靶底物結合的第一抗體以及一種或多種經螢光標記並且與第一抗體結合的第二抗體，從而促進作為免疫螢光灶點的結合底物的檢測。
6.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其特徵在於所述細胞選自單核細胞血細胞如淋巴細胞、單核細胞和/或巨噬細胞，體外培養的細胞如成纖維細胞或來自實驗細胞系的細胞。·
7.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其特徵在於步驟b)中的所述校正或步驟e)中的所述測定包括通過檢測染色或標記的細胞核，優選地通過檢測DAPI染色的細胞核，額外地檢測並定位細胞。
8.根據前述權利要求所述的方法，其特徵在於所述測定提供每個細胞的灶點數的測定。
9.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其特徵在於步驟e)的所述自動化評價系統包括具有將可執行指令作為軟體儲存的計算機可讀存儲器的計算裝置，所述計算裝置由模塊組成，所述模塊當由計算機執行時執行自動對焦控制、自動化圖像採集、自動化圖像分析和/或自動化模式識別的功能。
10.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其特徵在於螢光顯微鏡和自動化評價系統的對焦藉助顯微圖像的動態自動對焦而發生。
11.根據前述權利要求中任一項所述的方法在測定細胞和/或細胞群體中DNA雙鏈斷裂的數目中的應用，其中Y H2Ax灶點的數目與DNA雙鏈斷裂的數目成正比。
12.根據前述權利要求的應用，其特徵在於用於測定細胞和/或細胞群體中的DNA損傷，藉以 a.將測試細胞中所述YH2Ax灶點的數目與對照細胞中所述yH2Ax灶點的數目比較，並且 b.與所述對照細胞相比，所述測試細胞中每個細胞的所述H2Ax灶點數目更多表示所述測試細胞中DNA損傷增加。
13.根據前述權利要求所述的應用，其特徵在於用於測定細胞和/或細胞群體對電離或任何其他類型的輻射、任何其他DNA損傷性物質或治療的輻射暴露。
14.根據前述權利要求中任一項所述方法的用免疫螢光法自動測定免疫螢光灶點的系統，所述系統包括 a.待分析的細胞和合成校正粒子的混合物，藉以將細胞和粒子固定至固相， b.螢光顯微裝置，包括帶有照相機、機動掃描臺和多通道發光二極體(LED)的螢光顯微鏡，和 c.自動化評價系統，包括具有將可執行指令作為軟體儲存的計算機可讀存儲器的計算裝置，所述計算裝置由模塊組成，所述模塊當由計算機執行時執行自動對焦控制、自動化圖像採集、自動化圖像分析和/或自動化模式識別的功能，藉以分析兩個以上顏色通道，每個所述通道對應於合成校正粒子或祀底物相關的免疫突光灶點。
15.用於實施根據前述權利要求中任一項所述的用免疫螢光法自動測定免疫螢光灶點的方法的試劑盒，所述試劑盒包含 a.—種或多種固相，包含固定至所述固相表面的合成校正粒子，待分析的細胞將固定在所述固相表面上， b.一種或多種偶合物，包含與螢光標記物偶聯的、優選地用作第二抗體的免疫球蛋白特異性抗體，和任選地 c.洗滌緩衝液、 蓋玻片、覆蓋介質和/或用於合成校正粒子、第一抗體和/或第二抗體的螢光標記。
【文檔編號】G01N33/543GK103718044SQ201280033417
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2012年6月4日 優先權日:2011年6月6日
【發明者】迪爾克·羅根布克 申請人:Medipan有限公司