抗圓斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗體及其製備方法和應用的製作方法
2023-10-05 17:07:59 3
抗圓斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗體及其製備方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種抗圓斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗體，其特徵在於，由一份高效價抗圓斑蝰蛇毒素抗體和一份高效價抗五步蛇毒素抗體混合而成，所述的抗圓斑蝰蛇毒素抗體是採用圓斑蝰蛇毒素經滅活而成的圓斑蝰蛇毒素抗原免疫母雞產生的雞卵黃IgY抗體，所述的抗五步蛇毒素抗體是採用五步蛇毒素經滅活而成的五步蛇毒素抗原免疫母雞產生的雞卵黃IgY抗體。本發明能保護人和動物在蝰蛇或五步蛇咬傷時免受圓斑蝰蛇毒素或五步蛇毒素的傷害，特異性高，反應靈敏，成本低，適於大規模推廣應用。本發明還提供了上述抗圓斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗體的製備方法和應用，其製備方法過程簡單，應用廣泛，十分具有實用性。
【專利說明】抗圓斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗體及其製備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及抗體【技術領域】，更具體地，涉及抗蛇毒抗體【技術領域】，特別是指一種抗圓斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗體及其製備方法和應用。
【背景技術】
[0002]圓斑蝰蛇(Vipera russellii)主要分布於我國廣東、廣西、福建、雲南、湖南、江西、臺灣等華南地區，是我國的主要毒蛇品種。圓斑蝰也廣泛分布在東南亞，常見於馬來西亞、越南、泰國、緬甸、柬埔寨等國。圓斑蝰屬蝰科蝰亞科蝰屬。
[0003] 圓斑蝰蛇毒素主要是血液毒，毒性成分以凝血毒素為主，還含有較強的溶血毒素、纖維蛋白溶解毒素、抗凝毒素、血小板積聚變性因子、出血毒素、心臟毒素等。還含有許多酶類，主要有磷脂酶A2, (PLA)、激肽釋放酶、精氨酸酶、磷酸二酯酶、透明質酸酶、蛋白水解酶等。圓斑蝰蛇毒有很強的凝血毒素，可直接激活凝血因子X而發揮凝血作用；有類似凝血酶功能，能直接使纖維蛋白原變成纖維蛋白；激活凝血酶原作用。這幾種凝血作用的共同結果是引起凝血纖溶症，這種纖溶症可以導致和加重瀰漫性血管內凝血(DIC)、出血性休克、急性腎功能衰竭、內出血、腦水腫、急性心衰等。
[0004]圓斑蝰蛇的心臟毒素是由60個胺基酸組成的鹼性多肽，分子量7KD左右，含4對二硫鍵，生化結構上和神經毒素相似。當心臟毒素被吸收進入血液循環達到一定濃度時，會對全身肌肉產生膜興奮作用，心臟毒素的帶有正電的鹼性胺基酸與肌細胞膜外帶負電部分產生靜電吸引作用，使胞膜持久去極化而難以復極化。其結果是細胞膜的完整性破壞，細胞內的物質流出，細胞死亡。心臟毒素對心肌的損害最明顯，中毒量大時可產生室顫，繼而心臟停搏。心臟病理檢查可見出血壞死灶、心肌纖維斷裂等。圓斑蝰蛇的出血性毒素能促使炎症遞質釋放，造成血管內皮細胞聯接的疏鬆，紅細胞可以通過鬆散的細胞聯接處漏出血管。出血毒素也可以引起毛細血管內皮細胞破壞，紅細胞從破壞的內皮細胞處外滲出血。圓斑蝰蛇蛇毒中的卵磷酯酶A2 (PLA2)可直接作用於紅細胞膜上的磷脂，使紅細胞破壞溶解。PLA2可損害心肌，增強心臟毒素的毒性作用；破壞毛細血管管壁，增加通透性。PLA2在低濃度時促進血小板凝聚，在高濃度時抑制血小板聚集，從而使血凝系統的調控失去功能。
[0005]圓斑蝰蛇毒素毒性很強，對人的致死量為42mg左右，同時圓斑蝰蛇的排毒量也很大，一次攻擊可以排毒達到45毫克，足以造成傷者死亡。圓斑蝰蛇咬傷後患者發病迅速，症狀嚴重，皮下出血形成瘀斑，血液大量快速凝固，血液中凝血因子消耗殆盡。隨後，血液失去凝血功能，全身嚴重出血，常引起DIC。圓斑蝰蛇毒素還可以損害心肌，造成心肌功能障礙。
[0006]圓斑蝰蛇咬傷輕者可造成肢體殘疾，重者死亡，圓斑蝰蛇咬傷的死亡率很高。對野外從事林業、農業生產的工作者危害極大。所以對研製相應特效治療血清顯得極為迫切。國外已有抗蝰蛇毒血清產品上市，主要針對分布於歐洲的蝰蛇種類製備，已生產使用的蝰蛇毒血清有河蝰、毒蝰、極北蝰、草原蝰抗血清等。英國藥典1993年版第二卷記載的河蝰、毒蜂、極北蜂、草原蜂抗血清的效價分別為:抗河蜂(Vipera ammodytes Venom)抗血清不低於 IOOLD5tl,抗毒蜂(Vipera aspis Venom)不低於 IOOLD5tl,抗北極蜂(Vipera berus Venom)不低於 50LD5(I,抗草原蜂(Vipera ursinsi Venom)不低於 150LD5。。
[0007]五步蛇(學名:尖吻蝮，地方名:白花蛇、蘄蛇、百步蛇等)屬蝰蛇科蝮亞科，尖吻蝮屬。五步蛇頭大，明顯三角形，吻端尖而向上翹。頭背黑褐色，頭側自吻鱗經眼至口角上唇鱗以上均為黑褐色，以下黃白色，偶有少許黑褐色斑點。頭腹及喉部為白色，散有少數黑褐色斑點。最大體長可達1.5m。五步蛇已知的分布地區有安徽、重慶、江西、浙江、福建、湖南、湖北、廣西、貴州、廣東及臺灣省。國外只見於越南北部。
[0008]五步蛇生活在海拔100~1400m的山區或丘陵地帶。大多棲息在山谷溪澗附近，偶爾也進入山區村宅。喜食鼠類、鳥類、蛙類、蟾蜍和蜥蜴。之所以稱之為五步蛇，意指人類只要曾被其所咬，腳下踏出五步內必然會毒發倒地，以顯示該蛇奇毒無比。該蛇種的毒液的單位上的毒性(對小白鼠之LD5tl值)並不強烈，但是排毒量大，具有較大的危險性由五步蛇的咬擊所導致的死亡事件是較為常見的(趙爾宓、黃美華等主編《中國動物志爬行綱第三卷》科學出版社1998年版390頁)。
[0009]五步蛇毒素主要血循環毒素，包括凝血和抗凝血成分、出血因子、直接溶解纖維蛋白成分，直接溶血因子、細胞毒因子、降血壓因子等。引起出血因子的主要因子是出血因子I(AaHl),分子量為22kD，此分子可破壞內皮細胞間質和基底膜，引起出血。凝血毒素有凝血酶樣作用，能直接使纖維蛋白原凝固，能加速凝血酶原轉化為凝血酶，造成彌散性血管內凝血，以致血液失凝及廣泛出血。纖維蛋白溶解毒素能直接水解纖維蛋白和纖維蛋白原，使血凝過程產生的大量為血栓溶解，血內殘留的纖維蛋白原也受水解破壞，發生纖維蛋白溶解症，造成全身多發性出血。五步蛇毒的蛋白水解酶能引起傷口局部嚴重炎症反應，傷口部位腫脹，劇烈疼痛。心臟毒素對各類細胞膜有不可逆的損害，細胞膜去極化，使細胞的結構和功能發生障礙。
[0010] 對於上述類型的毒蛇，經常會發生人類被咬的情況，此時蛇毒的抗毒素就十分必要了，通常，蛇毒的抗毒素是用蛇毒免疫馬匹等大動物，使之產生高效價抗體，隨後採集這些動物的血漿，分離純化相應的抗體製成抗毒素。由於大動物的來源受限，用採血的方法獲取抗體的產量低，對動物有一定程度的傷害，需要一個能保護動物福利的替代方案。
[0011]生物的抗體是指機體免疫細胞被抗原激活後，由分化成熟的終末B細胞——眾細胞所合成與分泌的一類能與相應抗原特異性結合的具有免疫功能的球蛋白。現今發現，禽類的免疫系統包括細胞免疫和體液免疫，分別受胸腺和法氏囊的控制。當機體受到外來抗原刺激後，法氏囊內的B細胞分化成為漿細胞，分泌特異性抗體進入血液循環，禽蛋的卵黃對抗體(免疫球蛋白)有集聚作用，當血液流經卵巢時，特異性抗體(主要是IgY)在卵細胞中逐漸蓄積，形成卵黃抗體(Immunoglobulin of yolk, IgY) ;IgY是鳥類的抗體,這相當於哺乳動物的IgG。
[0012]卵黃抗體(IgY)與哺乳動物IgG的功能相似，是一種多克隆抗體，具有典型的免疫球蛋白空間構象，正常雞IgY的分子量約為180KDa，由兩條輕鏈(2L)和兩條重鏈(2H)組成，分子量分別為60~70KDa和22~30KDa。其等電點約為5.2。IgY移行進入卵細胞是受體作用的結果，因而IgY可在卵細胞中大量蓄積，濃度高於血液中的IgY。一個雞蛋含有100~200毫克的IgY抗體。卵黃抗體在禽胚孵化過程中逐漸進入禽胚血液,為剛出殼雛禽提供被動免疫保護，在雛禽疾病預防中具有重要作用。
[0013]IgY與一般哺乳動物IgG相比，IgY具有較強的耐熱、耐酸、抗離子強度和一定的抗酶降解能力。IgY具有良好的熱穩定性，在溫度高達75°c條件下，仍保持一定的生物學活性。65°C時可保持24h以上，70°C時加熱90min後其活性才明顯下降60°C，30min條件下巴氏消毒不影響IgY ;高於80°C，大部分IgY失去活性。IgY製劑在4°C貯存5年或在室溫貯存6個月其活性仍無明顯下降，IgY在pH4.0~11.0時比較穩定，pH3.0~3.5時活性迅速下降，pH12時活性亦有所下降。IgY對胃蛋白酶有較高的抵抗力，將胃蛋白酶和IgY在pH2.0溫育Ih後，幾乎所有活性喪失，但在pH4.0時Ih後可保持91%的活性，甚至溫育IOh後仍有63%活性。IgY分別與胰蛋白酶和胰凝乳酶溫育8h，活性保持39%和41%。
[0014]與產生於哺乳動物的IgG相比，IgY還具有許多其他獨特的優點:
[0015](1)無需採血，只需收集免疫家禽所產下的蛋即可獲得抗體；
[0016](2)使用少量的抗原免疫禽類既可獲得大量的質量均一的特異性IgY ；
[0017](3)由於種系發生距離相差很大，禽類IgY與哺乳動物免疫球蛋白之間不會發生交叉血清學反應；
[0018](4)不激活哺乳動物的補體系統，不與類風溼因子或Fe受體相結合，避免在免疫檢測過程中產生假陰性或價陽性結果；作為治療製劑使用時，無須考慮補體激活隨之而來一系列副作用；
[0019](5)耐熱、耐酸，巴氏滅菌溫度下也不會失活並且在pH值小於3時仍能保持穩定活性，可以用加熱、低PH等方法進行滅活病毒處理，使得產品更加安全。
[0020]所以，採用IgY作為IgG的替代品是十分具有實現性的。
[0021]現今，圓斑蝰蛇和五步蛇在地域分布上重疊，這兩種蛇傷都發生在偏遠山區，交通不便，就醫困難。發生蛇傷時，患者和醫生有時難以判別是五步蛇還是蝰蛇致傷以致誤用不相關的抗蛇毒血清，失去最佳救治機會。且國外現有的產品主要是基於歐洲分布的蝰蛇種類製備的，由於不同種類、不同地區的蝰蛇蛇毒抗原特異性具有種屬差異和地域差異，國外蝰蛇抗血清用於治療我國圓斑蝰蛇咬傷患者，針對性差，療效不明顯；另外圓斑蝰蛇排毒量多，毒性強，咬傷後發病迅速，死亡率高，需要高效價的抗毒素才能中和。
[0022]所以研製一種可從禽類IgY中得到、同時中和蝰蛇和五步蛇蛇毒、高效價、廉價且易於取得的抗圓斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗體是十分具有實用價值的。
【發明內容】
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[0023]本發明的主要目的就是針對以上存在的問題與不足，提供一種效價高，能具有很好的中和圓斑蝰蛇毒素和五步蛇毒素的功能，能保護人和動物在蝰蛇或五步蛇咬傷時免受圓斑蝰蛇毒素或五步蛇毒素的傷害，特異性高，反應靈敏，成本低，適於大規模推廣應用的抗圓斑蝰蛇毒素和五步蛇毒素抗體及其相關製備方法和應用。
[0024]為了解決上述目的，在本發明的第一方面，提供了一種抗圓斑蝰蛇毒素和五步蛇毒素抗體，其特點是，所述的抗圓斑蝰蛇毒素和/或五步蛇毒素抗體是採用圓斑蝰蛇毒素和/或五步蛇蛇毒經滅活後共同免疫母雞產生的雞卵黃IgY抗體或分別免疫母雞、分別產生的抗圓斑蝰蛇蛇毒IgY和抗五步蛇蛇毒IgY混合而成，所述的圓斑蝰蛇毒素購自江西鷹潭蛇場廣州辦事處，批號200701 ;所述的五步蛇毒素購自浙江義烏蛇類研究所，批號200802。
[0025]較佳的，所述的圓斑蝰蛇毒素先後經PMSF、EDTA和碘乙醯胺處理進行滅活。所述的五步蛇毒素經甲醛處理進行滅活。
[0026]本發明有益效果在於:
[0027]本發明的抗圓斑蝰蛇毒素抗體是採用圓斑蝰蛇毒素經滅活後免疫母雞產生的雞卵黃IgY抗體，所述的圓斑蝰蛇毒素購自江西鷹潭蛇場廣州辦事處,批號200701，此免疫方法獲得的抗體效價高，能具有很好的中和圓斑蝰蛇毒素的功能。本發明的抗五步蛇毒素抗體是採用五步蛇毒素經滅活後免疫母雞產生的雞卵黃IgY抗體，所述的五步蛇毒素購自浙江義烏蛇類研究所，批號200802，此免疫方法得到的抗體效價高，能具有很好的中和五步蛇毒素的功能。本發明將抗圓斑蝰蛇毒素抗體和抗五步蛇毒素抗體以1:1的比例混合，製成抗圓斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗體製劑能保護人和動物在蝰蛇或五步蛇咬傷時免受相應蛇毒素的傷害，特異性高，反應靈敏，成本低，適於大規模推廣應用。
[0028]在本發明的第二方面，提供了一種上述的抗圓斑蝰蛇毒素抗體的製備方法，其特點是，包括以下步驟:
[0029]A、抗原製備:採集圓斑蝰蛇毒素，然後進行滅活製得抗原；
[0030]B、免疫母雞；將步驟A製得的抗原免疫母雞，收集所述的母雞所下的雞蛋；母雞可以是例如出生4~5個月的母雞。
[0031]C、提取抗體；分離所述的雞蛋中的雞蛋黃，採用水溶法提取所述的雞蛋黃中的IgY抗體,從而得到所述的抗圓斑蝰蛇毒素抗體。
[0032]較佳的，在所述的步驟A中，所述的圓斑蝰蛇毒素先後經PMSF、EDTA和碘乙醯胺處理進行滅活。
[0033]較佳的，在所述的步驟B中，所述的抗原與不完全福氏佐劑充分混勻後注射所述的母雞，之後每隔10天加強免疫一次，共6次，連續收集4個月雞蛋。注射採用多點皮下注射法，一般選用4點。
[0034]較佳的，在所述的步驟C中，將雞蛋黃用注射用水稀釋(通常5~6體積)，充分攪拌(pH可調整為2~8)，過濾(例如用帆布)，收集濾液，加硫酸銨(例如33%飽和度硫酸銨或80%飽和度硫酸銨)沉澱IgY抗體。
[0035]更佳的，在所述的步驟C後，還包括步驟:將所述的IgY抗體壓濾後，將沉澱溶於注射用水，用超濾膜(例如IOKD超濾膜)超濾除去硫酸銨，並加入磷酸鈉緩衝液(例如pH7.0,20mM磷酸鈉),經DEAE-Sepharose FF和SP-Sepharose FF離子交換層析獲得精製IgY抗體。
[0036]本發明還提供了一種上述的抗五步蛇毒素抗體的製備方法，其特點是，包括以下步驟:
[0037]A、抗原製備:採集五步蛇毒素，然後進行滅活製得抗原；
[0038]B、免疫母雞；將步驟A製得的抗原免疫母雞，收集所述的母雞所下的雞蛋；母雞可以是例如出生4~5個月的母雞。
[0039]C、提取抗體；分離所述的雞蛋中的雞蛋黃，採用水溶法提取所述的雞蛋黃中的IgY抗體，從而得到所述的抗五步蛇毒素抗體。
[0040]較佳的，在所述的步驟A中，所述的五步蛇毒素經甲醛處理進行滅活。
[0041]較佳的，在所 述的步驟B中，所述的抗原與不完全福氏佐劑充分混勻後注射所述的母雞，之後每隔10天加強免疫一次，共6次，連續收集4個月雞蛋。注射採用多點皮下注射法，一般選用4點。
[0042]較佳的，在所述的步驟C中，將雞蛋黃用注射用水稀釋(通常5~6體積)，充分攪拌(pH可調整為2~8)，過濾(例如用帆布)，收集濾液，加硫酸銨(例如33%飽和度硫酸銨或80%飽和度硫酸銨)沉澱IgY抗體。
[0043]更佳的，在所述的步驟C後，還包括步驟:將所述的IgY抗體壓濾後，將沉澱溶於注射用水，用超濾膜(例如IOKD超濾膜)超濾除去硫酸銨，並加入磷酸鈉緩衝液(例如pH7.0,20mM磷酸鈉),經DEAE-Sepharose FF和SP-Sepharose FF離子交換層析獲得精製IgY抗體。
[0044]本發明提供了一種抗圓斑蝰蛇和抗五步蛇毒素抗體的製備方法，其特點是，包括以下步驟:
[0045]A、抗原製備:採集五步蛇毒素，然後進行滅活製得抗原；採集圓斑蝰蛇蛇毒，進行滅活製得抗原[0046]B、免疫母雞；將步驟A製得的兩種蛇毒抗原混合後免疫母雞，收集所述的母雞所下的雞蛋；母雞可以是例如出生4~5個月的母雞。
[0047]C、提取抗體；分離所述的雞蛋中的雞蛋黃，採用水溶法提取所述的雞蛋黃中的IgY抗體,從而得到所述的抗圓斑蝰蛇和抗五步蛇毒素抗體。
[0048]較佳的，在所述的步驟A中，所述的五步蛇毒素經甲醛處理進行滅活，所述的圓斑蝰蛇毒素先後經PMSF、EDTA和碘乙醯胺處理進行滅活。
[0049]較佳的，在所述的步驟B中，所述的抗原與不完全福氏佐劑充分混勻後注射所述的母雞，之後每隔10天加強免疫一次，共6次，連續收集4個月雞蛋。注射採用多點皮下注射法，一般選用4點。
[0050]較佳的，在所述的步驟C中，將雞蛋黃用注射用水稀釋(通常5~6體積)，充分攪拌(pH可調整為2~8)，過濾(例如用帆布)，收集濾液，加硫酸銨(例如33%飽和度硫酸銨或80%飽和度硫酸銨)沉澱IgY抗體。
[0051]更佳的，在所述的步驟C後，還包括步驟:將所述的IgY抗體壓濾後，將沉澱溶於注射用水，用超濾膜(例如IOKD超濾膜)超濾除去硫酸銨，並加入磷酸鈉緩衝液(例如pH7.0,20mM磷酸鈉),經DEAE-Sepharose FF和SP-Sepharose FF離子交換層析獲得精製IgY抗體。
[0052]本發明的有益效果在於:上述製備方法流程簡單，適合工業化大生產。
[0053]在本發明的第五方面，提供了上述的圓斑蝰蛇毒素和五步蛇抗體在製備圓斑蝰蛇毒素和五步蛇毒素解毒劑中的應用。
[0054]在本發明的第六方面，提供了一種抗圓斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗體免疫製劑，其特點是，包括上述的抗圓斑蝰蛇毒素抗體和抗五步蛇毒素抗體。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0055]圖1為本發明實施例9的抗體樣本的聚丙烯醯胺凝膠電泳分離實驗結果示意圖。【具體實施方式】
[0056]下面結合附圖對本發明的具體實施方法作進一步說明。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人,分子克隆:實驗室手冊(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例中所用到的各種常用化學試劑，均為市售產品。
[0057]實施例1圓斑蝰蛇毒素滅活:
[0058]圓斑蝰蛇毒素凍乾粉購自江西鷹潭蛇場廣州辦事處，批號200701，用pH7.020mMTris緩衝液溶解成20毫克/毫升濃度，加入PMSF至最其終濃度為0.8-1.2mM,攪拌後加入EDTA至0.8-1.5mM，調節蛋白濃度至I毫克/毫升，取100毫升蛇毒蛋白溶液加900毫升50mM pH7.8Tris緩衝液，離心4000rpm30分鐘，除去沉澱顆粒物質，上清緩緩倒入3000毫升含碘乙醯胺溶液(50mM Tris, 1.33mM EDTA, 2.67M NaCl，2.67M 尿素，266.7mM 碘乙醯胺pH8.0)，充分混勻後置37度水浴箱避光反應3小時。反應結束後用分子量截留值IOkD的Millipore板式超濾器超過濾，同時更換緩衝為pH7.0,50mM Tris，0.15M氯化鈉緩衝液，將最終蛋白濃度濃縮到I毫克/毫升，低溫保存備用。
[0059]低溫新鮮採取五步蛇蛇毒，立即用pH7.020mM Tris緩衝液稀釋10倍，離心4000rpm30分鐘，除去沉澱顆粒物質,調節蛋白濃度至20毫克/毫升,加入0.3-0.6%甲醒(v/v)，37°C保溫2周後低溫保存備用。
[0060]實施例2滅活蝰蛇毒素免疫健康母雞:
[0061]用滅活圓斑蝰蛇毒素與福氏不完全佐劑等量混合，使最終的滅活毒素的濃度為
0.5毫克/毫升，每羽母雞每次注射0.5毫升，在第一次注射後，每隔10天強化注射一次，共4次；以後每隔45天加強免疫一次。共10羽母雞免疫滅活蝰蛇毒素，雞號分別為1、2、3、4、
5、6、7、8、9、10。
[0062]實施例3滅活五步蛇毒素免疫健康母雞:
[0063]用滅活五步蛇毒素與福氏不完全佐劑等量混合，使最終的滅活毒素的濃度為0.5毫克/毫升，每羽母雞每次注射0.5毫升，在第一次注射後，每隔10天強化注射一次，共4次；以後每隔45天加強免疫一次。共10羽母雞免疫滅活五步蛇毒素，雞號分別為11、12、13、14、15、16、17、18、19、20。
[0064]實施例4滅活圓斑蝰蛇毒素和滅活五步蛇毒素共同免疫健康母雞:
[0065]用滅活五步蛇毒素和滅活蝰蛇毒素與福氏不完全佐劑等量混合，使最終的滅活的五步蛇毒素和蜂蛇毒素的濃度均為0.5暈克/毫升,每羽母雞每次注射0.5毫升,在第一次注射後，每隔10天強化注射一次，共4次；以後每隔45天加強免疫一次。共10羽母雞免疫滅活蝰蛇毒素與五步蛇毒素混合抗原，雞號分別為21、22、23、24、25、26、27、28、29、30。
[0066]實施例5雞血清抗圓斑蜂蛇毒素抗體ELISA效價測定:
[0067]於第一次免疫後40天經腋靜脈取血I毫升，分離血清，採用間接ELISA法測定血清中的抗體效價。用PH9.6，50mM碳酸鈉緩衝液稀釋天然圓斑蝰蛇毒素到I μ g/ml的濃度，取96孔酶標板(Nunc-Maxisorb)，每孔加200微升稀釋的圓斑蝰蛇蛇毒，37°C孵育2小時，傾去稀釋的蛇毒，然後加200微升5%脫脂奶粉(溶於PBS-Tween20 (M-PBST)) 37°C封閉I小時。雞血清用M-PBST稀釋1024倍，IgY用M-PBST稀釋1000倍後加到包被有蛇毒的孔內37°C孵育60分鐘，充分洗滌後加入1:5000稀釋的HRP標記抗雞IgY (Sigma)，孵育60分鐘後充分洗滌，顯色，酶標儀上讀數。表1、表2為ELISA的結果。
[0068]表1為雞血清抗 圓斑蝰蛇毒ELISA檢測結果:免疫母雞在免疫第O、10、20、30、40天分別採血，分離血清，檢測抗體效價，(血清1024倍稀釋)
[0069]
【權利要求】
1.一種抗圓斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗體，其特徵在於，由一份高效價抗圓斑蝰蛇毒素抗體和一份高效價抗五步蛇毒素抗體等量混合而成； 所述的抗圓斑蝰蛇毒素抗體是採用圓斑蝰蛇毒素經滅活而成的圓斑蝰蛇毒素抗原免疫母雞產生的雞卵黃IgY抗體； 所述的抗五步蛇毒素抗體是採用五步蛇毒素經滅活而成的五步蛇毒素抗原免疫母雞產生的雞卵黃IgY抗體。
2.根據權利要求1所述的抗圓斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗體，其特徵在於，所述的圓斑蝰蛇毒素先後經苯甲基磺醯氟、乙二胺四乙酸和碘乙醯胺處理進行滅活； 所述的五步蛇毒素經甲醛處理進行滅活。
3.一種根據權利要求1所述的抗圓斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗體的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟: 步驟一:進行抗原製備: 進行圓斑蝰蛇毒素抗原製備,採集圓斑蝰蛇毒素，立即加入0.08-0.12M苯甲基磺醯氟，使所述的苯甲基磺醯氟與所述的圓斑蝰蛇毒素形成最終濃度為0.8-1.2mM的I毫升蛇毒溶液。然後加入乙二胺四乙酸溶液，使其中的乙二胺四乙酸濃度在0.8-1.5mM範圍內，加入碘乙醯胺溶液，使所 述的蛇毒溶液和所述的碘乙醯胺溶液充分攪拌混勻，使其中的碘乙醯胺濃度為100-200mM範圍內，避光培育。反應完成後，超濾，洗脫除去殘存的苯甲基磺醯氟、碘乙醯胺、乙二胺四乙酸等小分子物質並濃縮，滅活脫毒後製得所述的圓斑蝰蛇毒素抗原。 進行五步蛇毒素抗原製備:採集五步蛇毒素，用PBS稀釋，然後加入甲醛，放置，滅活蛇毒製得所述的五步蛇毒素抗原； 步驟二:免疫母雞: 將製得的所述的圓斑蝰蛇毒素抗原和所述的五步蛇毒素抗原分別免疫母雞，分別收集圓斑蝰蛇毒素抗原免疫母雞所下雞蛋與五步蛇毒素抗原免疫母雞所下雞蛋； 步驟三:提取抗體: 分別分離圓斑蝰蛇毒素抗原免疫母雞所下雞蛋與五步蛇毒素抗原免疫母雞所下雞蛋中的雞蛋黃，採用水溶法和離子交換方法分別提取IgY抗體，從而分別得到抗圓斑蝰蛇毒素抗體和抗五步蛇毒素抗體。 步驟四:將所述的抗圓斑蝰蛇毒素抗體和所述的抗五步蛇毒素抗體按1:1比例混合成所述的抗圓斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗體。
4.一種根據權利要求1所述的抗圓斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗體的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟: 進行圓斑蝰蛇毒素抗原製備,採集圓斑蝰蛇毒素,立即加入0.8-1.2M苯甲基磺醯氟，使所述的苯甲基磺醯氟與所述的圓斑蝰蛇毒素形成最終濃度為0.8-1.2mM的I毫升蛇毒溶液。然後加入乙二胺四乙酸溶液和碘乙醯胺溶液，使所述的蛇毒溶液和所述的乙二胺四乙酸溶液、碘乙醯胺溶液充分攪拌混勻，避光培育。反應完成後，超濾，洗脫除去殘存的苯甲基磺醯氟、碘乙醯胺、乙二胺四乙酸等小分子物質並濃縮，滅活脫毒後製得所述的圓斑蝰蛇毒素抗原。進行五步蛇毒素抗原製備:採集五步蛇毒素，用PBS稀釋，然後加入甲醛，放置，滅活蛇毒製得所述的五步蛇毒素抗原；步驟二:免疫母雞: 將製得的所述的圓斑蝰蛇毒素抗原和所述的五步蛇毒素抗原混合後免疫母雞，收集所述的混合免疫母雞所下的雞蛋； 步驟三:提取抗體: 分離所述的混合免疫母雞所下雞蛋中的雞蛋黃，採用水溶法和離子交換方法提取所述的混合免疫母雞所下雞蛋黃中的IgY抗體，從而得到所述的抗圓斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗體。
5.根據權利要求3或4中任一所述的抗圓斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗體的製備方法，其特徵在於，所述的圓斑蝰蛇毒素先後經苯甲基磺醯氟、乙二胺四乙酸和碘乙醯胺 處理進行滅活； 所述的五步蛇毒素經甲醛處理進行滅活。
6.根據權利要求3或4中任一所述的抗圓斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗體的製備方法，其特徵在於，免疫母雞的方法為:用抗原與不完全福氏佐劑充分混勻後注射所述的母雞，之後每隔10天加強免疫一次，共6次，連續收集4個月雞蛋。
7.根據權利要求3或4中任 一所述的抗圓斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗體的製備方法，其特徵在於，分離雞蛋黃的方法為:將雞蛋黃用注射用水稀釋，充分攪拌，過濾，收集濾液，加硫酸銨沉澱IgY抗體。
8.根據權利要求3或4中任一所述的抗圓斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗體的製備方法，其特徵在於，提取IgY抗體的方法為:將所述的IgY抗體壓濾後，將沉澱溶於注射用水，用超濾膜超濾除去硫酸銨，並加入磷酸鈉緩衝液，經離子交換層析獲得精製IgY抗體。
9.根據權利要求1所述的抗圓斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗體在製備圓斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素解毒劑中的應用。
10.一種抗圓斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗體免疫製劑，其特徵在於，包括抗圓斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗體。
【文檔編號】A61K39/395GK103910798SQ201410167917
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年4月24日 優先權日:2014年4月24日
【發明者】李曉, 柏偉, 孫九如 申請人:上海賽倫生物技術有限公司