白血病急變主效基因之一gata－2突變基因及其應用的製作方法
2023-10-05 20:33:34 2
專利名稱：白血病急變主效基因之一gata－2突變基因及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子遺傳學、細胞生物學、白血病學領域。具體地說，本發明涉及慢性粒細胞性白血病急變主效基因之一GATA-2突變基因及其應用背景技術慢性粒細胞性白血病(CML)是造血幹細胞增殖紊亂性疾病，以染色體易位t(9；22)(q34；q11)產生費城染色體為主要特徵。易位產生的BCR-ABL融合蛋白具有持續的酪氨酸激酶活性，可以使細胞發生轉化，導致腫瘤發生。轉基因小鼠實驗已經證實BCR-ABL融合蛋白可以導致慢性粒細胞性白血病的發生，使細胞獲得生存和增殖優勢，但是，慢性粒細胞性白血病急變時細胞還會發生分化阻滯。所以，臨床上CML患者從相對良性的慢性期轉化到加速期和急變期需要「二次打擊」，即除BCR-ABL融合蛋白以外再發生一次遺傳學改變，使已經獲得生存和增殖優勢的白血病細胞發生分化阻滯，後者被認為是促進因素。然而，目前只有很少的患者由CML-CP轉化到BC的相關遺傳學事件被發現p53和p16/ARF突變發生在10-20％的急變患者中；少數患者有Rb和Ras突變；少數患者有染色體易位產生的融合蛋白NUP98-HOXA9和AML-1-EVI，但是p53、p16/ARF、Rb和Ras等主要還是使細胞獲得生存和增殖優勢，白血病細胞在急變時發生分化阻滯的原因仍未明。
AML-1(runt相關轉錄因子1或急性髓細胞性白血病因子1)是一種已知的基因(genebank登錄號RNA gi49574545；DNA gi51475294)，位於21q22.3，在各系血細胞中廣泛表達，AML-1和CBFβ結合成異二聚體調控許多造血分化相關基因的表達，現已證實AML1轉錄調控的靶基因有MPO、GM-CSFR、M-CSFR、中性粒細胞酯醇、IL3、IL5、中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)、明膠酶β、TCRs和B-細胞受體等。AML-1-/-小鼠胎肝造血障礙，造血幹細胞不能向下階段分化成熟，各系血細胞生成障礙，導致貧血及中樞神經系統出血使小鼠死於胚胎發育期。AML-1和CBFβ上調促進巨核細胞的分化，而下調促進紅細胞的分化。AML-1和CBFβ是人類白血病染色體易位經常累及的基因，易位產生的融合蛋白主要以顯性負形式抑制正常AML-1的功能而致白血病。AML-1也是人類白血病中最常發生突變的基因之一，在散發性白血病例如AML(M0，MI，M2，M3，M4，M5，M7主要是M0)、MDS轉化的AML、繼發性(治療相關)MDS/AML、伴隨21三體的髓性惡性疾病、DOWN氏綜合症相關的血液疾病、伴隨7q-的骨髓異常增殖性疾病等都發現了AML-1的點突變。迄今為止，只有兩篇文章涉及在慢性粒細胞性白血病急變患者中篩查AML-1突變，總共篩查84例患者只發現一例R80C突變，作者認為AML-1突變在慢性粒細胞性白血病急變患者中罕見。
GATA-2(GATA轉錄因子2)是一種已知的基因(genebank登錄號RNA GI31982886；DNA gi37550867)，主要表達於造血幹細胞早期階段並隨著造血細胞的分化、發育成熟表達下調GATA-2的缺失可導致造血的嚴重缺陷和胚胎死亡。GATA-2下調出現於造血幹細胞向祖細胞的演變過程中，從而邁出了造血分化的關鍵一步。GATA-2的表達下調對於紅系分化是必需的，且過度表達GATA-2還可使細胞向巨核細胞分化。GATA-2調節的靶基因可能參與了急性早幼粒細胞白血病的發病機制，並在誘導分化治療中被激活轉錄。GATA-2與ROG，TZFP，PML-RARA，PLZF-RARA之間存在交互作用。MITF聯合GATA-1或GATA-2使嗜鹼前體細胞分化成熟。到目前為止國內外報導GATA-2基因突變的發生率並不高，國內國人李發現1例M1型和1例M2型病人出現點突變。目前對GATA-2的研究主要集中在其生物學特性和功能方面，而對其在白血病中的作用的報導不多，未見GATA-2突變與慢性粒細胞性白血病急變相關的報導。
發明內容
本發明的目的在於(1)公開慢性粒細胞性白血病急變的主效基因之一GATA-2基因；(2)公開慢性粒細胞性白血病急變的主效基因之一GATA-2突變基因的突變位點；(3)公開檢測慢性粒細胞性白血病急變的主效基因之一GATA-2突變基因的試劑盒；(4)公開GATA-2突變基因在慢性粒細胞性白血病急變的早期檢測和/或治療方法中的應用；(5)公開試劑盒在慢性粒細胞性白血病急變的早期檢測和/或治療方法中的應用。
本發明的目的是通過以下技術方法來實現的發明人以造血相關轉錄因子為候選基因，在85例中國人群慢性粒細胞性白血病急變患者(其中急髓系變患者51例，急淋系變患者6例，加速期患者28例)中篩查可能的突變。經過大量的實驗，用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增-直接測序技術在兩例加速期患者和九例急變期患者中發現有AML-1突變(突變頻率為12.9％)，其中有兩例患者具有相同的點突變。九例發生在runt同源盒結構域；一例發生在AML-1的輔助抑制因子Ear-2的結合位點；一例發生在轉錄激活結構域；一例發生在轉錄抑制結構域。在一例加速期患者和八例急變期患者中發現有GATA-2突變(突變頻率為10.6％)，其中一例患者是缺失突變，發生在第一鋅指結構域；八例患者具有相同的點突變，發生在第二鋅指結構域。我們對上述患者的慢性期骨髓標本以及200例正常對照外周血標本採用同樣的直接測序法，均未檢測到上述突變。伴AML-1基因突變的其中1例患者在急變後還獲得了一次完全緩解，完全緩解時沒有檢測到該突變。說明這些突變是與慢性粒細胞性白血病急變相關的，而且在加速期就已經能檢測到。從而本發明找到了兩個慢性粒細胞性白血病急變二次打擊的遺傳學事件。
本發明提供了檢測慢性粒細胞性白血病急變相關基因GATA-2突變基因的方法，所述方法為直接測序法。
第一種方法A提取DNA，對GATA-2基因外顯子設計引物，進行PCR擴增；BPCR反應產物經直接純化後直接測序，將所得序列於genebank上的序列比對，確定突變位點。
進一步包括如下步驟C按正常讀碼框架進行翻譯以確定GATA-2基因的突變位點。
第二種方法A提取總RNA，逆轉錄成cDNA，在突變位點附近設計PCR引物，進行PCR擴增；
BPCR反應產物經直接純化後直接測序，將所得序列於genebank上的序列比對，確定突變位點。
進一步包括如下步驟C按正常讀碼框架進行翻譯以確定GATA-2基因的突變位點。
第三種方法A提取總RNA，逆轉錄成cDNA，在突變位點附近設計PCR引物，進行PCR擴增；BPCR反應產物可隆到p-GEMT-easy載體中，然後轉化大腸桿菌菌株JM109，挑單克隆測序，將所得序列於genebank上的序列比對，確定突變位點。
進一步包括如下步驟C按正常讀碼框架進行翻譯以確定GATA-2基因的突變位點。
本發明提供了一種檢測慢性粒細胞性白血病急變相關基因AML-1突變基因的方法，所述方法為直接測序法。
第一種方法A提取DNA，對AML-1基因外顯子設計引物，進行PCR擴增；BPCR反應產物經直接純化後直接測序，將所得序列於genebank上的序列比對，確定突變位點。
進一步包括如下步驟C按正常讀碼框架進行翻譯以確定AML-1基因的突變位點。
第二種方法A提取總RNA，逆轉錄成cDNA，在突變位點附近設計PCR引物，進行PCR擴增；BPCR反應產物經直接純化後直接測序，將所得序列於genebank上的序列比對，確定突變位點。
進一步包括如下步驟C按正常讀碼框架進行翻譯以確定AML-1基因的突變位點。
第三種方法A提取總RNA，逆轉錄成cDNA，在突變位點附近設計PCR引物，進行PCR擴增；BPCR反應產物可隆到p-GEMT-easy載體中，然後轉化大腸桿菌菌株JM109，挑單克隆測序，將所得序列於genebank上的序列比對，確定突變位點。
進一步包括如下步驟C按正常讀碼框架進行翻譯以確定AML-1基因的突變位點。
本發明優選突變位點位於AML-1的RUNT結構域和GATA-2的第一、第二鋅指結構域。更優選突變位點至少一個位於AML-1 1788delC(胺基酸突變L71fs-ter94)、C1812A(胺基酸突變H78Q)、G1815C(胺基酸突變W79C)、C1993G(胺基酸突變R139G)、A2090G(胺基酸突變D171G)、G2099A(胺基酸突變R174Q)、C2455T(胺基酸突變R293X)、2356-2357insCAAT(胺基酸突變Y260fs-ter573)、1849delG(胺基酸突變V91fs-ter94)、2718-2722delCGGCG(胺基酸突變G381fs-ter570)和GATA-2基因的T1075G(胺基酸突變L359V)、1021-1038del(胺基酸突變A341-G346del)。
本發明提供檢測慢性粒細胞性白血病急變的兩個主效基因AML-1和GATA-2突變基因的試劑盒試劑盒含有1)擴增引物引物名稱 上遊引物序列 下遊引物序列AML-1-C1 5』CCCCGCAGTAATAAAGG3』 5』GCTCTGTGGTAGGTGGC3』AML-1-C2 5』ATGGCTGGCAATGATGAA3』 5』AGGGTTAAAGGCAGTGGAGT3』AML-1-C3 5』ACAGCCATGAGGGTCAGC3』 5』GCCGTAGTACAGGTGGTAGG3』AML-1-C4 5』CCAGCGGCATGACAACC3』 5』CCTCAGTAGGGCCTCCACA3』AML-1-E2 5』AGGGTCCTAACTCAATCGGCTT3』5』CAACACAGCATCCCCCACATCC3』AML-1-E3 5』CCGAGTTTCTAGGGATTCCA3』 5』CCGAGTTTCTAGGGATTCCA3』AML-1-E4 5』AAATTCCGGGAGTGTTGTCA3』 5』GCAACTTTTTGGCTTTACGG3』AML-1-E5 5』TGATCTCTTCCCTCCCTCCT 5』CAGGTGGTGCTGTTGGTTC3』AML-1-E6 5』ATTTGAACAAGGGCCACTCA3』 5』GGGCATGGGACTCAGAGTAG3』AML-1-E7 5』CTCACTTCCGCTCCGTT3』 5』CTCCACCACGTCGCTCT3』GATA-2-C1 5』CTGCTCCCAGCTCTACTCCA3』 5』GCCTTCTGAACAGGAACGAG3』GATA-2-C2 5』CACCTACCCCTCCTATGTGC3』 5』ACGTCCATCTGTTCCCTAGC3』GATA-2-E1 5』ACACCTCGTGGTGGGACTT3』 5』TTTTCAGCAGCTCGATTCCT3』GATA-2-E2 5』GTCCCTAGCTCTGCCTACCC3』 5』CCTCTCCCAAGTCACAGCTC3』2)Taq DNA聚合酶(5U/μl)。Taq DNA聚合酶儲存於20mM Tris-HCl，pH8.0；0.1mM EDTA；1mM DTT，0.5％ NP-40，0.5％ Tween20，50％glycerol，100mM KCl緩衝液中。-20℃保存一年以上。
3)10×反應緩衝液。10×反應緩衝液組成成分為KCl 500mM；Tris-HCl 200mM(pH9.0)；Triton X-100 1％；MgCl220Mm。
4)dNTP(10mM/L)本發明提供了AML-1和GATA-2突變基因的檢測方法在慢性粒細胞性白血病急變的早期檢測和/或治療方法中的應用以及突變的AML-1和GATA-2基因在慢性粒細胞性白血病急變的早期檢測和/或治療方法中的應用。例如，由於本發明證實AML-1和GATA-2基因是慢性粒細胞性白血病急變相關基因中的兩個，尤其是突變集中在AML-1的RUNT結構域和GATA-2的第一、第二鋅指結構域，從而將AML-1和GATA-2基因與慢性粒細胞性白血病急變患者的藥物治療聯繫起來，可以發明作用於這些靶點的藥物來治療慢性粒細胞性白血病急變患者，為慢性粒細胞性白血病急變患者的新藥研發提供理論依據。
圖1Kaplan-Meier生存曲線用SPSS統計軟體，曲線示兩組患者間由慢性期到急變期所需時間有顯著差別有AML-1突變的患者疾病進程相對緩慢；有GATA-2突變的患者疾病進程相對兇險。
圖211號患者測序圖。箭頭所示為AML-1突變位點C1812A(胺基酸突變H78Q)。患者在慢性期和完全緩解期均為野生型。
圖318號患者測序圖。箭頭所示為AML-1突變位點2356_2357InsCAAT(胺基酸突變Y260fsTer573)。患者在慢性期為野生型，克隆後測序發現患者急變時插入CAAT，所以PCR產物直接測序時，該處序列為雙峰。
圖4GATA-2點突變A1075C(胺基酸突變L359V)測序圖。箭頭所示為點突變位點。患者在慢性期為野生型。
圖5GATA-2缺失突變測序圖。箭頭所示為GATA-2缺失突變位點1021-1038del(胺基酸突變A341-G346del)後的第一個核苷酸A，與野生型相比其前缺失18bp即GCCGCCAGAAGAGCCGGC。患者在慢性期為野生型，所以PCR產物直接測序時，該處序列為雙峰。
圖6GATA-23號患者骨髓細胞形態觀察，主要向粒單系方向急變。(a)慢性期骨髓塗片瑞氏染色，中性中幼粒、晚幼粒和杆狀核粒細胞比例增加；(b)-(g)急變期骨髓塗片(b)瑞氏染色，原始粒細胞、原始單核細胞和早幼粒細胞佔78％；(c)髓過氧化物酶(MPO)染色，是粒系標誌性染色，圖中強陽性，陰性和弱陽性共存，表明患者向粒-單方向急變。(d)過碘酸希夫氏鹼(PAS)染色；(e)氯化醋酸AS-D萘苯酚酯酶(NAS-DCE)染色，是粒系特異性標記；(f)乙酸AS-D萘酚酯酶(NAS-DAE)染色，是單核系特異性標記；(g)NaF抑制NAS-DAE染色，是單核細胞特徵性檢驗，能被NaF抑制說明患者向單核系急變。(h)GATA-26號患者急變期骨髓瑞氏染色塗片，原始粒細胞25％，嗜酸細胞佔26.5％。
圖7AML-1 16號患者骨髓細胞形態觀察，主要向粒系方向急變。(a)慢性期骨髓塗片瑞氏染色，中性中幼粒、晚幼粒和杆狀核粒細胞比例增加；(b)-(e)急變期骨髓塗片(b)瑞氏染色，原始粒細胞72％；(c)髓過氧化物酶(MPO)染色陽性，說明患者向粒系急變；(d)過碘酸希夫氏鹼(PAS)染色；(e)乙酸AS-D萘酚酯酶(NAS-DAE)染色。
圖8GATA-2野生型和兩個突變型L359V，Δ341-346的轉錄活性比較。a轉染實驗，用含GATA-2-RE的螢光素酶報告系統，將野生型GATA-2，L359V和Δ341-346分別和報告質粒一起轉染293-T細胞，用SV-40質粒作內參，pcDNA3.1空載作對照。結果顯示與野生型GATA-2比較L359V突變體有明顯的轉錄激活作用而Δ341-346轉錄抑制作用。b-d用實時定量逆轉錄聚合酶鏈式反應檢測UPN2、UPN3、UPN6(即2號、3號和6號)三個患者GATA-2的三個靶基因在慢性期和急變期的表達水平，數據為平均值±標準誤，是三次獨立實驗的結果，緊靠在一起的成對柱狀圖左邊為慢性期測量值右邊為急變期測量值。
圖9體外蛋白吸附實驗(GST pull-down拉下試驗)，比較野生型GATA-2，L359V和Δ341-346與CBP或HDAC1之間的結合活性。與野生型相比L359V與CBP結合能力增強，Δ341-346無明顯變化；三者與HDAC1的結合能力幾乎相同，GST為陰性對照。提示突變型L359V轉錄激活能力增強可能和其與CBP結合能力增強有關。
圖10DNA結合蛋白凝膠阻滯分析實驗，比較野生型GATA-2，L359V和Δ341-346與DNA的結合活性；以及冷探針(未用同位素標記的探針)和抗GATA-2抗體作用後的結果。+加GATA-2抗體；-不加冷探針或抗GATA-2抗體。圖中可看出突變型L359V蛋白較野生型GATA-2蛋白DNA結合能力明顯增強(見1、5泳道)，5倍冷探針使突變型L359V和野生型GATA-2信號均明顯減弱(見2、6泳道)，而20倍冷探針則使二者信號幾乎消失(見3、7泳道)，這說明所用實驗系統的特異性。在Supershift實驗中加入抗pcDNA3.1載體His-tag抗體亦顯示突變型L359V蛋白較野生型GATA-2蛋白DNA結合能力明顯增強(見4、8泳道)。與螢光素酶報告系統轉染實驗結果一致，Δ341-346突變型較野生型GATA-2蛋白DNA結合能力減弱(見9-12泳道)。
圖11AML-1和GATA-2蛋白結構示意圖，箭頭所示為突變位點。RHDrunt同源盒結構域；ECAML-1的輔助抑制因子Ear-2的結合位點；TAD轉錄激活結構域；TRD轉錄抑制結構域；ZF鋅指結構域。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步描述。
實施例1GATA-2基因各外顯子的PCR擴增1、患者樣品採集及處理在治療開始前採集患者的骨髓5-10ml，肝素抗凝，於當天用密度梯度離心法分離出單個核細胞，加適量白細胞裂解液及蛋白酶K，待白細胞充分裂解後用酚-氯仿法抽提基因組DNA，置-20℃備用。總RNA抽提和cDNA合成總RNA抽提和逆轉錄反應按試劑盒(GIBCO BRL公司)標準操作步驟進行。
正常對照瑞金醫院職工年度體檢各項指標均正常者的外周血5ml，共200份。按前述方法製備DNA。
2、引物設計採用的軟體Primer premier5，引物參數設定為片斷長度為300-700bp，引物最佳長度為20bp，最佳退火溫度為60℃，引物濃度為0.3μM。引物設計時應注意設計的引物也作為測序引物，因此上下遊引物包括的序列儘可能地避免多聚體(重複數N應小於或等於4)；引物離外顯子起始或終止端至少50bp。AML-1和GATA-2PCR擴增引物見表1，其中C表示以cDNA為模板，E表示以DNA為模板。AML-1用四對引物擴全長cDNA；GATA-2用二對引物擴全長cDNA。E後面的數字表示相應的外顯子編號。
3、樣本DNA的聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)尋找突變位點採用小樣本(24例AML患者)PCR擴增目的基因，採用申友公司的Taq酶，反應體系(25μl)為10×Buffer 2.5μl，引物(20μM)0.4μl×2，dNTPmix(10mM)0.5μl，MgCl2(25mM)1.5μl，Taq酶0.25μl，ddH2o18.65μl，DNA模板25ng.PCR反應程序94℃5min，94℃30sec，56℃40sec，72℃ 40sec，35cycles；72℃ 10min；4℃ forver.若有非特異條帶，且提高退火溫度也不能去除雜帶，則採用Touch-down的PCR反應程序94℃ 5min；94℃ 30sec，65℃ 40se -1℃/cycle，72℃ 40sec，10cycles；94℃30sec，56℃ 40sec，72℃ 40sec，30cycles；72℃ 10min；4℃ forver。
表1AML-1和GATA-2PCR擴增引物引物名稱 上遊引物序列下遊引物序列AML-1-C1 5』CCCCGCAGTAATAAAGG3』5』GCTCTGTGGTAGGTGGC3』AML-1-C2 5』ATGGCTGGCAATGATGAA3』 5』AGGGTTAAAGGCAGTGGAGT3』AML-1-C3 5』ACAGCCATGAGGGTCAGC3』 5』GCCGTAGTACAGGTGGTAGG3』AML-1-C4 5』CCAGCGGCATGACAACC3』5』CCTCAGTAGGGCCTCCACA3』AML-1-E2 5』AGGGTCCTAACTCAATCGGCTT3』5』CAACACAGCATCCCCCACATCC3』AML-1-E3 5』CCGAGTTTCTAGGGATTCCA3』 5』CCGAGTTTCTAGGGATTCCA3』AML-1-E4 5』AAATTCCGGGAGTGTTGTCA3』 5』GCAACTTTTTGGCTTTACGG3』AML-1-E5 5』TGATCTCTTCCCTCCCTCCT 5』CAGGTGGTGCTGTTGGTTC3』AML-1-E6 5』ATTTGAACAAGGGCCACTCA3』 5』GGGCATGGGACTCAGAGTAG3』AML-1-E7 5』CTCACTTCCGCTCCGTT3』5』CTCCACCACGTCGCTCT3』GATA-2-C1 5』CTGCTCCCAGCTCTACTCCA3』 5』GCCTTCTGAACAGGAACGAG3』GATA-2-C2 5』CACCTACCCCTCCTATGTGC3』 5』ACGTCCATCTGTTCCCTAGC3』GATA-2-E1 5』ACACCTCGTGGTGGGACTT3』5』TTTTCAGCAGCTCGATTCCT3』GATA-2-E2 5』GTCCCTAGCTCTGCCTACCC3』 5』CCTCTCCCAAGTCACAGCTC3』實施例2PCR產物純化測序1、PCR產物純化採用蝦鹼酶(Shrimp Alkaline Phosphatase，SAP)和外切酶(Exonuclease I)純化PCR產物，反應體系為SAP 0.16μl，Exonuclease I 0.25μl，PCR產物50ng，加水補至總體積7μl；純化反應程序37℃ 60min，80℃ 15min，4℃ forver。
2、PCR純化產物測序採用ABI 3700 Automatic Sequencer(PEBiosystems)。對PCR片段進行測序1)-20℃冰箱中取出PCR純化產物、MIX、0.8uM引物2)取96孔反應板，標上模板名(即PCR純化產物名)、日期，用連續加樣器逐一加入引物2ul，然後用12孔排槍加入模板2ul，最後用連續加樣器逐一加入mix2ul於離心機上甩一下，達1300轉/分左右即停。
3)PCR擴增(9700 of PE biosystem) 4)擴增結束後，用連續加樣器加入70％乙醇(加入量與反應體系之比為9∶1)即50ul左右於室溫進行沉澱，時間15分鐘以上，不得超過24小時。
5)4000轉/分，4℃離心30分鐘。
6)輕輕倒去上清液，將96孔板倒置離心，達800轉/分即停。
7)每孔加入10ul的loading buffer，2000轉/分1min離心。
8)90℃變性2分鐘，立即置冰上，待上樣。
9)在ABI3700 Automatic Sequencer上進行電泳，3小時後機器自動分析輸出結果。
實施例3突變位點的搜尋採用Polyphred軟體搜尋突變位點。Polyphred軟體會用各種顏色標示出可疑突變位點，不同顏色代表不同的可信程度，最終的確認需打開圖形用肉眼來評定。對於豐度高的突變位點，軟體識別的可靠性非常高，但對於低豐度的突變位點，如只有一個樣本顯示雜合的圖形，就需要用肉眼根據評判標準來確定，去除由於測序不好造成的幹擾。判斷一個位點是否為突變位點，至少應滿足下列一些條件1)顯示雜合鹼基兩側序列是可辨別的單峰，背景比較低；2)正反方向測序需一致，均為雜合子；3)將雜合個體與純合個體測序圖進行比較，在雜合個體的圖中，鹼基峰有明顯的下降趨勢。將含突變的序列與genebank上的序列比對，進一步確定突變位點。對於有插入或缺失的片斷，有很特徵的測序圖——在雜合個體裡，測序峰形會從插入或缺失位置開始變得很亂。此時可將PCR產物可隆到p-GEMT-easy載體中，然後轉化大腸桿菌菌株JM109，挑單克隆測序。將所得序列與genebank上的序列比對，就可以得到具體的插入或缺失的序列。
實施例4突變型GATA-2功能研究1、質粒構建Flag-GATA-2/pCMV真核表達載體，CD34×2/Luc報告基因載體均由Tariq Enver教授惠贈。以Xho I和EcoR I為兩端酶切位點，Flag-GATA-2/pCMV為模板，採用定向克隆方法和定點突變技術構建野生型GATA-2/pcDNA3.1和GATA-2L359V/pcDNA3.1突變真核表達載體。
2、細胞培養及細胞轉染COS-7、293細胞以DMEM(GIBCO BRL)培養基加10％胎牛血清培養，K562細胞以1640培養基加10％胎牛血清培養。用Superfect(Qiagen)按廠家推薦的方法轉染細胞。轉染前一天，將2×104/ml細胞接種到六孔板上，待細胞達到70-80％貼壁後進行轉染。轉染前293細胞用PBS洗1次。先以SV40內對照(50ng/孔)加入無血清DMEM培養液660μl中，再加入報告基因載體CD34×2/Luc(100ng/孔)，最後分別加入野生型和突變型GATA-2真核表達載體(2μg/孔)和Superfect(2.5μl/孔)，充分混勻離心後靜置15min，使複合物充分形成後再分別加入各培養孔。加入500μl培養液，5％CO2，37℃孵育2-3小時後加含有10％FBS的DMEM培養基1ml繼續培養24小時進行報告基因的檢測。電轉K562細胞參照BIO-RAD公司操作手冊進行。
3、螢光素酶(Luciferase)檢測採用雙螢光素酶報告基因檢測系統(Promega)，按照推薦的方法，在螢光檢測儀(Lumat LB9507)上測量螢光素酶活性。
4、GST融合蛋白表達及純化將相應的GST-CBP、GST-HDAC1等融合蛋白表達質粒轉化大腸桿菌BL-21菌株，挑取單克隆菌落接種於5ml含有氨苄青黴素(50mg/ml)的LB培養液中，37℃ 300rpm培養過夜。1∶100稀釋到含有氨苄青黴素(50mg/ml)的2×YT中，30℃ 300rpm培養至OD600達到0.6-0.8。加入0.1M異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)使終濃度達到0.4-0.8mM，30℃誘導GST融合蛋白表達3小時。5000rpm離心5min，去上清，收集菌體，加入預冷的PBS混懸菌體。加入1M二硫蘇糖醇(DTT)至最終濃度為5mM，加入10mg/ml的苯甲磺醯氟(PMSF)至最終濃度為100μg/ml。冰浴中超聲裂解細胞成勻漿。然後加20％ TritonX-100至終濃度1％，冰浴30min。最後4℃ 12000rpm離心10min，轉移上清，4℃再13000rpm離心10min，取上清，-80℃保存備用。如需純化，直接按每一毫升上清中加入20μl 50％穀胱甘肽瓊脂糖凝膠顆粒，4℃慢搖孵育過夜，用預冷的PBS洗6次，加入洗脫液(10mM還原穀胱甘肽，50mMTris(pH8.0))，4℃慢搖孵育4小時，離心取上清，-80℃保存備用。
5、GST pull-down拉下試驗蛋白體外翻譯分別以野生型GATA-2/pcDNA3.1和GATA-2L359V/pcDNA3.1突變真核表達載體為模板，採用體外轉錄翻譯試劑盒(TNTQuick Coupled Transcription and TranslationKit，Progema)進行體外翻譯，並用[35S]-蛋氨酸(1175Ci/mmol)對翻譯產物進行標記，-80℃保存備用。取保存備用的含有GST融合蛋白的上清，解凍後按每一毫升上清中加入20μl 50％穀胱甘肽瓊脂糖凝膠顆粒，4℃慢搖孵育60min。然後用500μl預冷的PBS洗滌3次，即得到純化的GST融合蛋白。將結合了GST融合蛋白的瓊脂糖凝膠顆粒重懸於200μl結合液中(0.5％NP40，20mM Tris(pH8.0)，100mM NaCl，1mM EDTA)，再加入一定量體外翻譯產物，4℃孵育2小時後用400μl結合液洗滌3次，加蛋白上樣緩衝液後煮沸變性。10％SDS-PAGE電泳，抽乾膠後放射自顯影。
6、Gel shift蛋白體外翻譯同上。翻譯同時以S35標蛋氨酸為陽性對照。按Santa Cruz公司提供的序列合成了用於Gel shift實驗的GATA探針。探針序列為sense 5』--CAC TTG ATA ACA GAA AGT GAT AAC TCT--3』antisense 5』--AGA GTT ATC ACT TTC TGT TAT CAA GTG--3』使用-P32ATP進行末端核苷酸標記，復性後用MicroSpinG-25(Armersham Pharmacia)純化探針。未標記探針經復性直接得到。體外翻譯蛋白和探針室溫孵育30分鐘，6％的非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳，電泳液為0.5×TBE。在競爭反應中分別加入10倍和100倍未標記探針；Supershift試驗加入pcDNA3.1載體His-tag抗體。
實施例5檢測慢性粒細胞性白血病急變的主效基因之一GATA-2突變基因的試劑盒及其應用。
1、試劑盒含有1)擴增引物引物名稱 上遊引物序列 下遊引物序列AML-1-C1 5』CCCCGCAGTAATAAAGG3』5』GCTCTGTGGTAGGTGGC3』AML-1-C2 5』ATGGCTGGCAATGATGAA3』 5』AGGGTTAAAGGCAGTGGAGT3』AML-1-C3 5』ACAGCCATGAGGGTCAGC3』 5』GCCGTAGTACAGGTGGTAGG3』AML-1-C4 5』CCAGCGGCATGACAACC3』5』CCTCAGTAGGGCCTCCACA3』AML-1-E2 5』AGGGTCCTAACTCAATCGGCTT3』 5』CAACACAGCATCCCCCACATCC3』AML-1-E3 5』CCGAGTTTCTAGGGATTCCA3』 5』CCGAGTTTCTAGGGATTCCA3』AML-1-E4 5』AAATTCCGGGAGTGTTGTCA3』 5』GCAACTTTTTGGCTTTACGG3』AML-1-E5 5』TGATCTCTTCCCTCCCTCCT 5』CAGGTGGTGCTGTTGGTTC3』AML-1-E6 5』ATTTGAACAAGGGCCACTCA3』 5』GGGCATGGGACTCAGAGTAG3』AML-1-E7 5』CTCACTTCCGCTCCGTT3』5』CTCCACCACGTCGCTCT3』GATA-2-C1 5』CTGCTCCCAGCTCTACTCCA3』 5』GCCTTCTGAACAGGAACGAG3』GATA-2-C2 5』CACCTACCCCTCCTATGTGC3』 5』ACGTCCATCTGTTCCCTAGC3』GATA-2-E1 5』ACACCTCGTGGTGGGACTT3』5』TTTTCAGCAGCTCGATTCCT3』GATA-2-E2 5』GTCCCTAGCTCTGCCTACCC3』 5』CCTCTCCCAAGTCACAGCTC3』2)Taq DNA聚合酶(5U/μl)。Taq DNA聚合酶儲存於20mM Tris-HCl，pH8.0；0.1mM EDTA；1mM DTT，0.5％NP-40，0.5％Tween20，50％glycerol，100mM KCl緩衝液中。-20℃保存一年以上。
3)10×反應緩衝液。10×反應緩衝液組成成分為KCl 500mM；Tris-HCl200mM(pH9.0)；Triton X-100 1％；MgCl220Mm。
4)dNTP(10mM/L)2、使用方法A提取總RNA，逆轉錄成cDNA，在突變位點附近設計PCR引物，進行PCR擴增；
BPCR反應產物經直接純化後直接測序，將所得序列於genebank上的序列比對，確定突變位點。
進一步包括如下步驟C按正常讀碼框架進行翻譯以確定GATA-2基因的突變位點。
實施例6檢測慢性粒細胞性白血病急變的主效基因之一AML-1突變基因的試劑盒及其應用。
1、試劑盒含有1)擴增引物引物名稱上遊引物序列下遊引物序列AML-1-C15』CCCCGCAGTAATAAAGG3』 5』GCTCTGTGGTAGGTGGC3』AML-1-C25』ATGGCTGGCAATGATGAA3』 5』AGGGTTAAAGGCAGTGGAGT3』AML-1-C35』ACAGCCATGAGGGTCAGC3』 5』GCCGTAGTACAGGTGGTAGG3』AML-1-C45』CCAGCGGCATGACAACC3』 5』CCTCAGTAGGGCCTCCACA3』AML-1-E25』AGGGTCCTAACTCAATCGGCTT3』5』CAACACAGCATCCCCCACATCC3』AML-1-E35』CCGAGTTTCTAGGGATTCCA3』 5』CCGAGTTTCTAGGGATTCCA3』AML-1-E45』AAATTCCGGGAGTGTTGTCA3』 5』GCAACTTTTTGGCTTTACGG3』AML-1-E55』TGATCTCTTCCCTCCCTCCT 5』CAGGTGGTGCTGTTGGTTC3』AML-1-E65』ATTTGAACAAGGGCCACTCA3』 5』GGGCATGGGACTCAGAGTAG3』AML-1-E75』CTCACTTCCGCTCCGTT3』 5』CTCCACCACGTCGCTCT3』GATA-2-C1 5』CTGCTCCCAGCTCTACTCCA3』 5』GCCTTCTGAACAGGAACGAG3』GATA-2-C2 5』CACCTACCCCTCCTATGTGC3』 5』ACGTCCATCTGTTCCCTAGC3』GATA-2-E1 5』ACACCTCGTGGTGGGACTT3』 5』TTTTCAGCAGCTCGATTCCT3』GATA-2-E2 5』GTCCCTAGCTCTGCCTACCC3』 5』CCTCTCCCAAGTCACAGCTC3』2)Taq DNA聚合酶(5U/μl)。Taq DNA聚合酶儲存於20mM Tris-HCl，pH8.0；0.1mM EDTA；1mM DTT，0.5％ NP-40，0.5％ Tween20，50％glycerol，100mM KCl緩衝液中。-20℃保存一年以上。
3)10×反應緩衝液。10×反應緩衝液組成成分為KCl 500mM；Tris-HCl200mM(pH9.0)；Triton X-100 1％；MgCl220Mm。
4)dNTP(10mM/L)
2、使用方法A提取總RNA，逆轉錄成cDNA，在突變位點附近設計PCR引物，進行PCR擴增；BPCR反應產物經直接純化後直接測序，將所得序列於genebank上的序列比對，確定突變位點。
進一步包括如下步驟C按正常讀碼框架進行翻譯以確定AML-1基因的突變位點。
實施例7檢測慢性粒細胞性白血病急變的主效基因之一GATA-2突變位點L359V的試劑盒及其應用。
1、試劑盒含有1)GATA-2-C1上遊引物序列5』CTGCTCCCAGCTCTACTCCA3』下遊引物序列5』GCCTTCTGAACAGGAACGAG3』。
2)Taq DNA聚合酶(5U/μl)。Taq DNA聚合酶儲存於20mM Tris-HCl，pH8.0；0.1mM EDTA；1mM DTT，0.5％ NP-40，0.5％ Tween20，50％glycerol，100mM KCl緩衝液中。-20℃保存一年以上。
3)10×反應緩衝液。10×反應緩衝液組成成分為KCl 500mM；Tris-HCl200mM(pH9.0)；Triton X-100 1％；MgCl220Mm。
4)dNTP(10mM/L)2、使用方法A提取總RNA，逆轉錄成cDNA，在突變位點附近設計PCR引物，進行PCR擴增；BPCR反應產物經直接純化後直接測序，將所得序列於genebank上的序列比對，確定突變位點。
進一步包括如下步驟C按正常讀碼框架進行翻譯以確定GATA-2基因的突變位點。
實施例8檢測慢性粒細胞性白血病急變的主效基因之一GATA-2突變位點A341-G346del的試劑盒及其應用。
1、試劑盒含有1)GATA-2-C2上遊引物序列5』CACCTACCCCTCCTATGTGC3』下遊引物序列5』ACGTCCATCTGTTCCCTAGC3』。
2)Taq DNA聚合酶(5U/μl)。Taq DNA聚合酶儲存於20mM Tris-HCl，pH8.0；0.1mM EDTA；1mM DTT，0.5％ NP-40，0.5％ Tween20，50％glycerol，100mM KCl緩衝液中。-20℃保存一年以上。
3)10×反應緩衝液。10×反應緩衝液組成成分為KCl500mM；Tris-HCl200mM(pH9.0)；Triton X-100 1％；MgCl220Mm。
4)dNTP(10mM/L)2、使用方法A提取總RNA，逆轉錄成cDNA，在突變位點附近設計PCR引物，進行PCR擴增；BPCR反應產物可隆到p-GEMT-easy載體中，然後轉化大腸桿菌菌株JM109，挑單克隆測序，將所得序列於genebank上的序列比對，確定突變位點。
進一步包括如下步驟C按正常讀碼框架進行翻譯以確定GATA-2基因的突變位點。
實施例9檢測慢性粒細胞性白血病急變的主效基因之一AML-1突變位點C1812A的試劑盒及其應用。
1、試劑盒含有1)AML-1-C1上遊引物序列5』CCCCGCAGTAATAAAGG3』下遊引物序列5』GCTCTGTGGTAGGTGGC3』2)Taq DNA聚合酶(5U/μl)。Taq DNA聚合酶儲存於20mM Tris-HCl，pH8.0；0.1mM EDTA；1mM DTT，0.5％ NP-40，0.5％ Tween20，50％glycerol，100mM KCl緩衝液中。-20℃保存一年以上。
3)10×反應緩衝液。10×反應緩衝液組成成分為KCl 500mM；Tris-HCl200mM(pH9.0)；Triton X-100 1％；MgCl220Mm。
4)dNTP(10mM/L)2、使用方法A提取總RNA，逆轉錄成cDNA，在突變位點附近設計PCR引物，進行PCR擴增；BPCR反應產物經直接純化後直接測序，將所得序列於genebank上的序列比對，確定突變位點。
進一步包括如下步驟C按正常讀碼框架進行翻譯以確定AML-1基因的突變位點。
實施例10檢測慢性粒細胞性白血病急變的主效基因之一AML-1突變位點R293X的試劑盒及其應用。
1、試劑盒含有1)AML-1-C3上遊引物序列5』ACAGCCATGAGGGTCAGC3』下遊引物序列5』GCCGTAGTACAGGTGGTAGG3』2)Taq DNA聚合酶(5U/μl)。Taq DNA聚合酶儲存於20mM Tris-HCl，pH8.0；0.1mM EDTA；1mM DTT，0.5％ NP-40，0.5％ Tween20，50％glycerol，100mM KCl緩衝液中。-20℃保存一年以上。
3)10×反應緩衝液。10×反應緩衝液組成成分為KCl 500mM；Tris-HCl200mM(pH9.0)；Triton X-100 1％；MgCl220Mm。
4)dNTP(10mM/L)2、使用方法A提取總RNA，逆轉錄成cDNA，在突變位點附近設計PCR引物，進行PCR擴增；BPCR反應產物經直接純化後直接測序，將所得序列於genebank上的序列比對，確定突變位點。
進一步包括如下步驟C按正常讀碼框架進行翻譯以確定AML-1基因的突變位點。
實施例11含GATA-2或AML-1突變的慢性粒細胞性白血病加速期或急變期患者的臨床資料。見表2AP加速期；del缺失；ins插入；fs移碼突變；ter終止.My原始粒細胞；Mo原始單核細胞；Promo幼單核細胞；Promy早幼粒細胞；E嗜酸細胞.所有患者都有BCR-ABL融合基因。有GATA-2突變的患者疾病進程相對兇險，主要向粒單系方向急變；含AML-1突變的患者疾病進程相對緩慢，主要向粒系方向急變。大部分患者急變前後沒有染色體的改變。
表2
權利要求
1.一種慢性粒細胞性白血病急變的主效基因之一GATA-2突變基因，其中所述GATA-2突變基因至少一個突變位點位於T1075G、1021-1038del。
2.根據權利要求1所述的GATA-2突變基因，其編碼胺基酸至少一個突變位點位於第一、第二鋅指結構域。
3.根據權利要求1所述的GATA-2突變基因，其編碼胺基酸至少一個突變位點位於L359V、A341-G346del。
4.一種檢測慢性粒細胞性白血病急變的主效基因之一GATA-2突變基因的試劑盒，其包括擴增引物，dNTP，用於PCR反應的DNA聚合酶及其緩衝液的一種或多種，所述擴增引物選自GATA-2-C1、GATA-2-C2、GATA-2-E1、GATA-2-E2。
5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特徵在於擴增引物GATA-2-C1上遊引物序列5』CTGCTCCCAGCTCTACTCCA3』下遊引物序列5』GCCTTCTGAACAGGAACGAG3』。
6.根據權利要求4所述的試劑盒，其特徵在於擴增引物GATA-2-C2上遊引物序列5』CACCTACCCCTCCTATGTGC3』下遊引物序列5』ACGTCCATCTGTTCCCTAGC3』。
7.根據權利要求4所述的試劑盒，其特徵在於擴增引物GATA-2-E1上遊引物序列5』ACACCTCGTGGTGGGACTT3』下遊引物序列5』TTTTCAGCAGCTCGATTCCT3』。
8.根據權利要求4所述的試劑盒，其特徵在於擴增引物GATA-2-E2上遊引物序列5』GTCCCTAGCTCTGCCTACCC3』下遊引物序列5』CCTCTCCCAAGTCACAGCTC3』。
9.根據權利要求1所述的GATA-2突變基因在慢性粒細胞性白血病急變的早期檢測和/或治療方法中的應用。
10.根據權利要求4-8任一權利要求所述的試劑盒在慢性粒細胞性白血病急變的早期檢測和/或治療方法中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種慢性粒細胞性白血病急變主效基因之一GATA－2突變基因及其應用；本發明同時涉及檢測慢性粒細胞性白血病急變的主效基因之一GATA－2突變基因的試劑盒及其應用。本發明將GATA－2基因與慢性粒細胞性白血病急變患者的藥物治療聯繫起來，可以發明作用於這些靶點的藥物來治療慢性粒細胞性白血病急變患者，為慢性粒細胞性白血病急變患者的新藥研發提供理論依據。
文檔編號C12N15/12GK1683532SQ20051002384
公開日2005年10月19日 申請日期2005年2月4日 優先權日2005年2月4日
發明者陳竺, 陳賽娟, 張蘇江, 顧柏煒, 施靜藝, 李國 , 高曉東 申請人:上海第二醫科大學附屬瑞金醫院