檢測C肝病毒的方法和試劑的製作方法

2023-10-06 03:16:34 2

專利名稱：檢測C肝病毒的方法和試劑的製作方法
本申請為中國專利申請號為92111071,5、申請日為1992年8月26日發明名稱為《檢測C肝病毒的方法和試劑》的中國專利申請的分案申請。
本發明提供了用於檢測C肝病毒，即一種非甲、非B肝炎的病原體的試劑和方法。該試劑特別包括用於病毒RNA基因組反轉錄以及隨後的通過由此產生的cDNA的聚合酶鏈反應進行放大的低核苷酸引子。特定序列的低核苷酸探針被提供用來檢測放大後的HCV核酸序列。引子和探針可用於檢測HCV感染的診斷試驗中。這種診斷試驗在臨床和流行病學的環境中有重要的應用。
C肝病毒(HCV)是未知的幾種引起非甲，非B肝炎(NANBH)的因子之一。原型的HCV發現於從黑猩猩血漿中獲得的以血液為載體的NANBH病毒的cDNA克隆，如在1989年的Science雜誌第244期的第359-362頁上Choo等人的報導。來自這種原型HCV基因的核苷酸序列在歐洲專利公開第381,216；388,232和398,748中作了描述。HCV基因組的核苷酸序列在1991年美國國家科學院學報(Pro.Natl.Acad.Sci.)上第88期第2451至2455頁上由Choo.等人作了報導並與相關病毒作了比較。
在此後對其它族系的序列已有過報導。HCV基因組在分離體之間顯示出很強的核酸序列異種性，從HCVRNA基因組中分離cDNA在1989年的Nuc.Acid Res.第17期第10367-10372頁上由Kuboet等人報導。作者們創立了一種基於上述1989年Choo等人報導的序列的反轉錄引子。分離的HCV基因組片段表現出與原型HCV序列有79.8％的同種性。由類似的原始記錄得到的，來自三個不同區域的序列在1990年的Gene 91期第287-291頁上由Takeuchi等人作了報導。據報導，在這三個區域之一，與原型序列的序列同種性為73.5％。
來自從日本患者中分離出來的族系的HCV基因序列在1990年的Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A第87期9524-9528頁上由Kato等人作了報導。該序列在整個比較區域上顯示出與原型HCV基因組77.4％的同種性。在1991年的J.Virol.65期(3)第1105-1113頁上由Takamizawa等人報導的HCV基因組的全編碼區域的序列表現出與原型HCV菌系77％的同種性。
在日本，兩個標記為K1和K2的主要族系已經在基因組的400核苷酸區域上被觀察到。這些族系具有與原型HCV序列的67％的序列同種性(見1990年Biochem.Biophys.Res.Commun.170(3)期第1021-1025頁上Enomoto等人的報導)。K2族還可被進一步細分為兩組，標記為Ka和Kb，在兩組之間具有約20％的核苷酸變異和在每一組內具有約5％的核苷酸變異。
與原型HCV序列的近似的同種性水平在1990年的J.Clin.Invest.86期第1764-1767頁上Kato等人的文章中作了報導，在15位患者中，cDNA片段被放大並排序。被放大的部分，對應於原型序列中位置3525-3561的37個核苷酸表現出與原型HCV序列的68-78％的同種性。
HCV基因組的RNA可以在血清中被檢測到，通過從基因RNA中產生cDNA，用聚合酶鏈反應放大cDNA，並且隨後用特定序列的低核苷酸檢測。由於在HCV族系中的序列異種性，引子和探針很可能是族系特異的，除非能夠找到一個區域，在該區域內序列通過不同族系是不變的。一種這樣的不變區域是在HCV基因組的5′一端。
HCV基因組的5′-端非編碼序列首先在1990年的JapanJ.Exp.Med.60(3)期的第167-177頁上由Okamoto等人作了報導。兩個族系之間的對比表明5′-端非編碼序列是不變的。HCV基因組5′-端非編碼序列的這種不變特性還在1991年的Proc.Natl.Sci.U.S.A第88期1711-1715頁Han等人的文章中作了報導。比較從來自五大洲的個體中收集的11個HCV分離體中獲得的341核苷酸區域的部分序列，七個序列表現出與原型序列完全的同種性；剩下的四個序列表現出有1至5個鹼基不符合。
在1990年的Japan J.Exp.Med.60(3)期第215-222頁的Okamoto等人的文章中，描述了HCV基因組的各個不同區域，包括不變的5′非編碼區域的引子。選自不變區域的引子成功地放大了來自受試的大部分族系的核酸；選自異種區域的引子放大了來自一個更小的族系亞組的核酸。然而這些引子的放大效率低。參考文獻描述了一種兩步PCR放大法；第二放大循環是採用嵌套在由第一組引子放大的區域中的第二組引子，在前面放大的目標區域上進行的。
一種需要兩個放大循環，採用兩組引子的PCR放大法在1990年Lancet 335期第1419-1422頁的Garson等人的文章中也作了報導。一個對非結構蛋白質(NS5)進行編碼的區域被放大。由於序列的異種性，存在不被這些引子所識別的HCV序列(見1990年Lancet 336期第878-879頁Garson等人的文章)。因此，位於不變的5′非編碼區域內的引子被試驗，但為獲得足夠的靈敏性，採用多組嵌套引子的兩步放大仍是必要的。利用嵌套引子，通過兩步放大的5′-端區域放大在1990年Lancet 336期第245頁上Kanai等人的文章中作了報導。
利用嵌套的引子通過兩次放大循環的放大方法不僅效率低，而且極大地增加了汙染的可能性。汙染問題在本技術領域內是盡人皆知的；如果有一點可能性的話，在放大步驟中間最好避免打開反應試管更換引子和加入試劑，由於在初始的反轉錄步驟和隨後的PCR放大中間需要改變反應條件，這就進一步加劇了汙染問題。
仍然需要引子低核苷酸來放大HCV序列，每個引子選自一個不變區域，以使所有的，或幾乎所有的族系能夠被放大，而且放大作用足夠有效以使得採用一組引子的放大就足夠了。還需要探針低核苷酸來檢測放大的cDNA，cDNA選自與引子雜合的兩不變區域之間的一個不變區域。需要反應原始記錄和試劑以便採用相同試劑即可發生反轉錄和PCR，從而在放大過程中不再需要打開反應試管。
而且，百分之十的NANBH病例與原型殼體和被膜抗原是不反應的，見1991年J.Clinical Microbiology 29期第2329-2330頁中Chaudhary等人和1991年DNAS8期第3647-3651頁中Hosein等人的文章。因此，研製基於PCR的診斷及由新的分離體編碼的抗原將會改進血清診斷試驗的可靠性。本發明通過提供檢測HCV的引子、探針及方法來滿足這些要求。
所提供的專門的引子和特定序列的低核苷酸探針可以用於同種的反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)以便能夠放大和檢測病毒RNA基因組的序列。利用本發明的引子和方法進行放大的效率消除了用嵌套的引子進行的第二個PCR放大循環的需要，而且，結果試驗的高靈敏性提供了可靠的核酸檢測。
本發明的一個方面涉及特定的低核苷酸引子。本發明提供了一個組合，其中包括用來放大一種HCV核酸的低核苷酸引子，其中所說的引子適於放大來自一種HCV族系或選自含有日本，美國和C9菌族組的同型體的核酸子序列。這些引子在病毒RNA基因組的反轉錄中和隨後的利用聚合酶鏈反應對所產生的cDNA放大中起作用。引子與來自HCV基因組的不變區域的序列雜合，從而與各種族系鍵聯。利用所提供的引子進行放大的效率足以不再需要採用嵌套引子的第二個PCR放大循環。
本發明的另一個方面涉及能夠檢測HCV基因組核酸的存在，而與族系無關的探針。該探針與對不同族系不變的區域是互補的。利用本發明的探針進行的診斷試驗能夠檢測大量的HCV族系而不會損害其特異性。所以本發明提供的組合包括一種用於檢測C肝病毒核酸存在的低核苷酸探針，其中探針適於檢測HCV族系的核酸或者選自含有日本、美國和C9原型族系的各種不同族系的核酸。
本發明的第三個方面涉及試劑盒。這些試劑盒呈各種形式並包含一種或多種反轉錄，放大或檢測試劑，例如引子、探針、聚合酶、糖酶、綬衝劑以及核苷三磷酸鹽。
在一個實施例中，本發明提供了一套專門用於肝炎病毒的C9分離體的核酸檢測的試劑，該套試劑包括一個箱子，其中含有本質上與HCV-C9病毒的核酸子序列鍵聯的核酸探針。
本發明的另一方面涉及放大和檢測HCV RNA的方法。
此外，本發明涉及一種組合，包括本質上與SEQ ID.NO.29同種的病毒核酸序列。含有這樣一種病毒序列、這裡被稱為C9分離體的cDNA克隆，pHCV-C9，pHCV-C9被存放在American Type Culture Collection中，而且存放號為NO.75265。
本發明還提供了用於專門檢測C9分離體及相關的變異體的核酸序列的探針和引子。本發明的探針最好包括選自下列小組的子序列SEQ ID NO.345′-TTGCCGGAAAGACTGGGTCCTTTC-3′(nt 174-197)SEQ ID NO.355′-CAAAAGAAACACAAACCGCCGCCC-3′(nt 374-397)SEQ ID NO.365′-CCAGCCCATCCCGAAAGATCGGCG-3′(nt 527-550)SEQ ID NO.37(MY160)5′-TGTCCGGTCATTTGGGCG-3′(nt 216-233)本發明還提供了專門放大C9分離體的核酸序列的低核苷酸引子。專門用於放大C9變異體及相關的分離體的本發明的引子最好包括選自下列一組上端引子的核酸序列SEQ ID NO.385′-AAACCCACTCTATGTCCGGTC-3′(nt 204-224)；SEQ ID NO.395′-GTACGCCGGAATTGCCGGAAA-3′(nt 163-183)；及SEQ ID NO.405′-CCTCAAAGAAAAACCAAAAGA-3′(nt 360-380)；並與下列下端引子一起使用SEQ ID NO.415′-TGGCGTCTCCCACGCGGCTGG-3′(nt 509-529)；及SEQ ID NO.425′-CTTTCCCCAGGACCTGCCGGT-3′(nt 555-575).
本發明還提供了本質上與C9分離體及前面被視為C肝分離體的序列鍵聯的探針。這種類型的優選探針包括SEQ ID NO.43 KY150 5′-CATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGT-3′.本發明還提供了用於檢測非-C9HCV序列的探針。
本發明提供了用於檢測C肝基因組的核酸存在的方法，其中所說的C肝基因組的核酸選自由日本、美國及C9原型族系組成的小組，該方法包括(a)放大核酸子序列；(b)在探針與子序列鍵聯形成一個穩定的雜合複合體的條件下將放大的核酸與專門用於該子序列的低核苷酸探針混合；及(c)檢測形成於子序列和探針之間的雜合體。
在另一個實施例中，本發明提供了一個用於檢測肝炎病毒的C9分離體的方法，該方法包括以下步驟(a)讓懷疑含有HCV-C9核酸序列的樣品與具有一個和HCV-C9核酸序列互補的子序列的探針接觸；及(b)檢測探針與該序列的雜合。
該方法可以在步驟(a)之前進一步包括一個對病毒特定序列的子序列的放大步驟。放大最好通過採用聚合酶鏈反應法獲得。上述引子和探針最好用在本發明的方法中。
本發明還提供了檢測肝炎病毒的C9分離體特有的核酸的試劑盒。該試劑盒包括一個箱子，其中含有一個核酸探針，該探針本質上與核酸序列的一個核酸子序列鍵聯。該探針最好選自上列小組。
另一種測定方法是基於免疫學反應的，如血清抗體與蛋白或C9分離體的病毒溶樣產物的反應，或培養用來抗病毒抗體的免疫球蛋白與含病毒的生物樣品的反應。因此，本發明提供了培養用來抗C9分離體的生物純的免疫球蛋白。
為了理解本發明，下面定義幾個術語。
「放大反應混合液」是指含有用於放大目標核酸的各種試劑的含水溶液。這些試劑包括酶，含水緩衝劑，鹽，目標核酸，及脫氧核苷三磷酸鹽。按照上下文，混合液既可以是完全的也可以是非完全的放大反應混合液。
「放大反應系統」是指任何放大目標核酸序列複製品的體外方法。這些方法包括，但不局限於此，聚合酶鏈反應放大(PCR)，DNA連接酶，QB RNA複製酶，及基於RNA轉錄的放大系統。這些包括多种放大試劑並在下面更充分地描述。
「放大反應試管」是指適於盛放放大試劑的容器。通常試管由惰性成分構成以使其不抑制或幹擾所採用的放大系統。由於系統需要反覆加熱和冷卻的熱循環，故試管必須能夠耐受這個循環過程，且一般與熱循環控制裝置的套管準確地配合。
「放大試劑」是指各種緩衝劑，酶，引子，脫氧核苷三磷酸鹽(既有傳統的也有非傳統的)，和用於進行所選擇的放大步驟的引子。
「放大」或「放大過程」一般是指目標核酸的「指數」增長，在此被用來描述在選擇的目標核酸序列數量上線性的和指數的增長。
「實質上的鍵聯」是指一種低核苷酸和一個目標序列的互補雜合併且含有少量的不雜合部分，這些少量的不雜合能夠通過降低對雜合劑的嚴格性要求以獲得所希望的對PCR聚合酶或雜合信息檢測的引發作用而被接受。
「生物純」一詞是指實質上或本質上從在其自然狀態被發現時通常伴隨它的成分中游離出來的物質，例如，親合力純化的抗體或以一種生物純化狀態存在的單克隆抗體。
「雜合」是指兩個單股核酸通過互補鹼基配對鍵聯。
「核酸」是指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，並且除非另外限定，包括能夠以一種與天然產生的核苷酸類似的方式起作用的已知的天然核苷酸的類似物。
「核苷酸聚合酶」是指能夠催化由核苷三磷酸鹽前體合成DNA或RNA的酶。在本發明的放大反應中，聚合酶是依賴於模板的，並且一般在所形成的聚合物3′一端加入核苷酸。最優選的聚合酶是熱穩定的，如美國專利4,889,818和5,079,352中所述。
術語「低核苷酸」是指一個分子，它包括兩個或更多個脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，如引子，探針，待檢測的核酸片段，及核酸控制子。低核苷酸的準確大小依賴於多種因素及低核苷酸最終的作用或應用。低核苷酸可採用任何合適的方法製備，包括，例如克隆繁殖和對適當序列的限定及採用一種方法直接進行化學合成，如在1979年的Meth.Enzymol.68期第90-99頁上Narang等人的文章中所述的磷酸三酯化方法；1979年Meth.Enzymol 68期第109-151頁上Brown等人的磷酸二酯化方法；1981年TetrahedronLett.22期第1859-1862頁上Beaucage等人的二乙磷醯胺化方法；以及美國專利4,458,066中的固體支持物方法。
術語「引子」是指一種天然或合成的低核苷酸，在導致與一個核酸鏈互補的引子擴展產物的合成條件下，即存在四種不同的核苷三磷酸鹽和一種處於適當的緩衝劑中的聚合劑(即DNA聚合酶或反轉錄酶)的條件下以及在適當的溫度下，引子能夠起到DNA合成的引發點的作用。引子最好是單股低脫氧核糖核苷酸。合適的引子長度依賴於引子的使用用途，但一般在15至25個核苷酸範圍內。短的引子分子通常需要較低的溫度以便用模板形成充分穩定的雜合的複合物。引子不需要反映準確的模板序列，但必須充分地互補以便與模板雜合。
在本發明的一個公開的實施例中，提供了特定序列的引子和探針。對本領域的普通技術人員來說顯而易見的是，有了那些實施例，可以製備其它的特定序列的引子和探針，例如通過在5′或3′端加入核苷酸，其中核苷酸與目標序列互補或非互補。只要引子製品對於在目標序列上的擴展能夠起到的作用，並且只要引子和探針包括至少14個包含在所列舉的實施例中的連續的核苷酸，則這樣的製品就在本發明的範疇內。
術語「引子」可指多於一個引子，特別是在關於被放大的目標區域的一端或兩端方面的信息存在模糊的情況下。例如，如果一個區域表現出在總體中具有較高水平的多態性，則引子混合物可被製備來放大不同的序列。如果希望的話，引子可通過包括一個能夠用分光、光化學、生物化學、免疫化學或化學手段檢測到的標記物而被標記。例如，可使用的標記物包括32P螢光染料，電子密度試劑，酶(如在ELISA中普遍採用的)，生物素，或可獲得抗血清或單克隆抗體的半抗原和蛋白質。標記物還可以被用於「捕獲」引子，以便於將引子或引子擴展產物，如放大的DNA固定在固體支持物上。
「探針」是指通過與目標核酸子序列互補鹼基配對進行鍵聯的一種低核苷酸。對於本領域普通技術人員來說可以理解的是，探針一般可根據雜合狀態的嚴格性和與探針序列缺乏完全的互補性的目標序列實質上地鍵聯合。探針最好用同位素直接標記或如採用鏈黴抗生物素蛋白過後可與之鍵聯的生物素間接標記。通過測定探針的存在與否，人們可以檢測到目標存在與否。
「重組體」當指一個核酸探針時，意思是從通常與由細胞分離出來的探針相關的天然蛋白質和核酸中游離出來的低核苷酸，其中自然包含作為其天然基因組的一部分的探針序列。重組體探針包括通過放大方式製成的那些物質，這個放大方式如PCR法和基因的克隆繁殖方法，在後一種方法中，細菌被重組體探針所改變。
術語「反轉錄酶」是指一種酶，它催化脫氧核糖核苷三磷酸鹽的聚合作用以形成與核糖核酸模板互補的引子擴展產物。這種酶誘發在引子3′端進行的合成反應，並繼續向模板的5′端進行直到合成終止。將RNA目標序列轉化為一個互補的，複製-DNA(cDNA)序列的合適的聚合劑的例子是鳥類成髓細胞白血病病毒反轉錄酶和Thermus嗜熱菌DNA聚合酶，一種具有反轉錄酶活性的熱穩定的DNA聚合酶。
術語「特定序列的低核苷酸」和「SSO」是指具有一個稱為「雜合區域」的序列的低核苷酸，該序列與待檢測序列精確地互補，一般具有特殊的等位基因或變異體的序列在「特定序列的，嚴格的雜合狀態」下，只與那個嚴格互補的目標序列雜合。放鬆雜合狀態的嚴格性，將允許有序列的不符合；允許的不符合度可通過適當調整雜合狀態來控制。根據待分析的序列的不同，可以選用一種或多種特定序列的低核苷酸。術語「探針」及「SSO探針」可相互替換地與SSO一起使用。
一個特殊分離體「特有的序列」是該分離體特有的序列，即前面說明的其它分離體沒有的。一個含有與一種分離體特效的序列互補的子序列的探針在嚴格條件下(例如在70℃用2×SSC，0.1％的SDS衝洗固體支持物)通常不與其它分離體基因組的相應部分雜合。
特殊分離體特有的抗原或抗原決定簇是該分離體特有的，且是前面說明的其它分離體所不具備的。培養用來抗該抗原或抗原決定簇的免疫球蛋白在標準測定，如ELISA中，不與前面描述的分離體上的抗原進行交叉反應。
術語「本質上等同」表示兩個或多個核苷酸序列，其大部分序列是共同的。通常至少為其序列的約90％，優選地為其序列的約95％。另外還表示，如果在嚴格的條件下(參見例如Sambrook等人的，Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1985年)，與相同的核苷酸序列雜合的話，該序列是本質上等同的。嚴格的條件是依賴於序列的，在不同的情況下是不同的。通常，嚴格的條件被選為低於特定序列的熱焙點(Tm)5℃，並在規定的離子濃度和pH值下。Tm是指(在規定的離子深度和pH值下)，50％的目標序列與完全符合的探針雜合時的溫度。一般地，嚴格的條件是指在pH值為7時鹽濃縮度至少約為0.2摩爾且溫度至少約為60℃情況下的那些條件。
「子序列」是指包括一個更長的核酸序列的一部分的核酸序列。
術語「目標區域」是指待分析的核酸區域並可以包括多態區域。
術語「熱穩定聚合酶」是指一種對熱相對穩定，並能夠催化核苷三磷酸鹽的聚合作用以形成與目標序列的一個核酸鏈互補的引子擴展產物的酶。該酶引發在引子3′端的合成反應，並繼續向模板的5′端進行直到合成終止。一種純化了的熱穩定聚合酶在美國專利4,889,818中作了更充分的描述。


圖1提供了新穎的變異的HCV序列C9，四種相關的變型體及原型日本、美國HCV分離體的排列表。
C肝病毒是一種很小的RNA病毒，它包含一個長度為10,000個核苷酸的單個的正向的RNA分子。基因組含有一個據信可被轉化成單個的，大聚合蛋白並隨後進行處理的單個的長的開放閱讀架。這個開放閱讀架始於一個非轉化區域(UTR)之後的核苷酸343(採用原型病毒編號系統)。5′UTR序列是相對不變的，並且在病毒的複製和調節方面是很重要的。編碼區域的5′端也是不變的。本發明的某些引子和探針在HCV基因組的5′端與不變區域雜合。
下面將給出本發明的引子和探針的雜合區域的低核苷酸序列，本領域的普通技術人員將會明白，用於引子雜合區域的低核苷酸序列也可以用作探針的雜合區域。引子序列用於探針的適用性依賴於引子的雜合特性。同樣，用於探針的低核苷酸可用於引子。
表1所示的低核苷酸是正向的(上端)引子或探針。表是按照與基因組核酸雜合的低核苷酸的3′端的位置順序列出的。與最靠近基因組5′端雜合的低核苷酸被列在前面。
表1低核苷酸 序列表 序列 位置(末端數)KY65 SEQ ID NO1 5』-CCAAGCTTCACCATAGATCACT16-29KY79 SEQ ID NO2 5』-GGCGACACTCCACCATAGATCACT 6-29KY98 SEQ ID NO3 5』-CCAAGCTTAGATCACTCCCCTGTGAGGAACT 21-44KY96 SEQ ID NO4 5』-CCAAGCTTCACGCAGAAAGCGTCTAGCCAT50-74KY80 SEQ ID NO5 5』-GCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGT 56-79KY144 SEQ ID NO6 5』-ACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGT54-79KY83 SEQ ID NO7 5』-CCTCCAGGACCCCCCCTCCCGGGAGAGCCA99-128KY84 SEQ ID NO8 5』-GAGTACACCGGAATTGCCAGGACGACC 149-175KY85 SEQ ID NO9 5』-ACCCGCTCAATGCCTGGAGAT 194-214KY67 SEQ ID NO10 5』-CGAAGCTTGCTAGCCGAGTAGT236-250KY81 SEQ ID NO11 5』-CCGCAAGACTGCTAGCCGAGTAGT 227-250KY88 SEQ ID NO12 5』-GTTGGGTCGCGAAAGGCCTTGTGGT 251-275KY86 SEQ ID NO13 5』-GGTGCTTGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGT288-317KY87 SEQ ID NO14 5』-GACTTCCGAGCGGTCGCAACCTCG 482-505表2列出了作為反向(下端)引子或探針的低核苷酸，採用與表1相同的內部排序。
表2低核苷酸 序列表序列位置(末端數)KY153 SEQ ID NO155』-CCCAACACTACTCGGCTAGCAGTCT 232-256KY149 SEQ ID NO165』-AAGGCCTTTCGCGACCCAACACTACT 245-278KY148 SEQ ID NO175』-CACAAGGCCTTTCGCGACCCAACACT 248-273KY78 SEQ ID NO185』-CTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT276-299KY145 SEQ ID NO195』-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT 276-301KY95 SEQ ID NO205′-GGGAATTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT 276-298KY100 SEQ ID NO215』-CGAGGTTGCGACCGCTCGGAAGT 483-505KY110 SEQ ID NO225』-AGGTTGCGACCGCTCGGAAGT 483-503KY112 SEQ ID NO235』-AGGTTGCGACCGCTCGGAAGT 483-503KY109 SEQ ID NO245』-AATGCCATAGAGGGGCCAAGG 573-593KY111 SEQ ID NO255』-ATTGCCATAGAGGGGCCAAGG 573-594KY99 SEQ ID NO265』-CAGAATTCATTGCCATAGAGGGGCCAAGGAT 570-592KY68 SEQ ID NO275』-CAGAATTCGCCCTCATTGCCAT 586-599KY82 SEQ ID NO285』-CCCACCCCAAGCCCTCATTGCCAT586-610
有幾個低核苷酸具有被修改成包括一個向著分子的5′端的限定部位的雜合區域。當這些低核苷酸之一被用作引子時，該限定部位被引入到放大後的產物中。初始雜合條件被選擇以使得限定部位周圍的鹼基對不符合率能被接受。一個引子的5′端附近的不符合率比引子3′端附近的不符合率被更好地接受。低核苷酸KY 65(SEQ ID NO.1)，KY 98(SEQ ID NO.3)，KY 96(SEQ ID NO.4)，以及KY 67(SEQ ID NO.10)是上端的引子並含有一個Hind III部位，低核苷酸KY 95(SEQ ID NO.20)，KY 99(SEQ ID NO.26)及KY 68(SEQ ID NO.27)是下端的引子並含有一個EcoRI部位。將這種限定部位包括到放大的產物中便於放大產物的克隆繁殖。
本發明還提供了一種新的HCV分離體。大多數分離體與HCV的兩個族系之一有關。第一個是在歐州專利318,216,388,232，和398,748中描述的美國原型族系。第二個是由上述Kato等人描述的日本原型族系。兩個族系在假定的非結構基因區域上存在最高至30％差別，但在5′非轉化區域上表現出大於98％的同種性，和在殼體或核基因的5′部分92％的同種性。
本發明的分離體，在此被稱為C9，與兩個族系的相關度更低。這種新的分離體與同樣的5′非轉化區域具有93％的相似性。與原型或日本族系在核基因區域的5′部分僅存在約85％的同種性(見下面表3)C9(SEQ ID NO.29)分離體及有關的同型體，R 45(SEQ IDNO.31)，R 43(SEQ ID NO.33)，R 110(SEQ ID NO.32)，及R 116(SEQ ID NO.30)(見圖1)在從上述Stratagene購得的pBS(+)上被克隆繁殖成RI/HindIII限定部位。採用如在美國專利4,800,159中所述的純化病毒DNA目標和PCR克隆繁殖方法對不同的病毒進行克隆繁殖。結果得到的質粒被送到E.ColiStrain DG101(ATCC存放號為47043)。
5′端非轉化序列的核苷酸序列和原型C9分離體的5′端殼體基因以及四種相關的分離體被公開為C9(SEQ ID NO.29)，R 116(SEQ ID NO.30)，R 45(SEQ ID NO.31)，R 110(SEQ ID NO.32)，以及R 43(SEQ ID NO.33)並表示於下。所表示的序列不包括用來便於克隆繁殖病毒序列的引子KY 96(SEQ ID NO.4)和KY 99(SEQ ID NO.26)。C9-SEQ ID NO.291 ACTGTCTTCA CGCAGAAAGC GTCTAGCCAT GGCGTTAGTA TGAGTGTCGT51 ACAGCCTCCA GGCCCCCCCC TCCCGGGAGA GCCATAGTGG TCTGCGGAAC101 CGGTGAGTAC ACCGGAATTA CCGGAAAGAC TGGGTCCTTT CTTGGATAAA151 CCCACTCTGT GTCCGGTCAT TTGGGCGTGC CCCCGCAAGA CTGCTAGCCG201 AGTAGCGTTG GGTTGCGAAA GGCCTTGTGG TACTGCCTGA TAGGGTGCTT251 GCGAGTGCCC CGGGAGGTCT CGTAGACCGT GCATCATGAG CACAAATCCT301 AAACCTCAAA GAAAAACCAA AAGAAACACA AACCGCCGCC CACAGGACGT351 TAAGTTTCCG GGTGGCGGCC AGATCGTTGG CGGAGTTTAC TTGCTGCCGC401 GCAGGGGCCC CAGGTTGGGT GTGCGCGCGA CAAGAAAGAC TTCCGAGCGA451 TCCCAGCCGC GTGGGAGACG CCAGCCCATC CCAAAAGATC GGCGCTCCAC501 CGGCAAGTCC TGGGGAAAGC CAGGATR116-SEQ ID NO.301 GGCGTTAGTA TGAGTGTCGT ACAGCCTCCA GGCCCCCCCC TCCCGGGAGA51 GCCATAGTGG TCTGCGGAAC CGGTGAGTAC GCCGAATTAC CGGAAAGACT101 GGGTCCTTTC TTGGATAAAC CCACTCTATG TCCGGTCATT TGGGCGTCCC151 CCGCAAGACT GCTAGCCGAG TAGCGTTGGG TTGCGAAAGG CCTTGTGGTA
201 CTGCCTGATA GGGTGCTTGC GAGTGCCCCG GGAGGTCTCG TAGACCGTGC251 ATCATGAGCA CAGATCCTAA ACCTCAAAGA AAAACCAAAA GAAATACAAA301 CCGCCGCCCA CAGGACGTCA AGTTCCCGGG TGGCGGCCAG ATCGTTGGCG351 GAGTTTACTT GCTGCCGCGC AGGGGCCCCA GGTTGGGTGT GCGCACAACA401 AGGAAGACTT CCGAGCGATC CCAGCCGCGT GGAAGACGCC AGCCCATCCC451 GAAAGATCGG CGCTCCACCG GTAAGTCCTG GGGAAAGCCA GGATR45-SEQ ID NO.311 GGCGTTAGTA TGAGTGTCGT ACAGCCTCCA GGCCCCCCCC TCCCGGGAGA51 GCCATAGTGG TCTGCGGAAC CGGTGAGTAC GCCGAATTGC CGGAAAGACT101 GGGTCCTTTC TTGGATAAAC CCACTCTATG TCCGGTCATT TGGGCGTCCC151 CCGCAAGACT GCTAGCCGAG TAGCGTTGGG TTGCGAAAGG CCTTGTGGTA201 CTGCCTGATA GGGTGCTTGC GAGTGCCCAG GGAGGTCTCG TAGACCGTGC251 ATCATGAGCA CAAATCCTAA ACCCCAAAGA AAAACCAAAA GAAACACAAA301 CCGCCGCCCA CAGGACGTTA AGTTCCCGGG TGGCGGCCAG ATCGTTGGCG351 GAGTTTACTT GATGCCGCGC AGGGGCCCCA GGTTGGGTGT GCGCGCGACG401 AGGAAGACTT CCGAGCGATC CCAGCCGCGT GGGAGACGCC AGCCCATCCC451 GAAAGATCGG CGTTCCACCG GCAAGTCCTG GGGAAAGCCA GGATR110-SEQ ID NO.321 GGCGTTAGTA TGAGTGTCGT ACAGCCTCCA GGCCCCCCCC TCCCGGGAGA51 GCCATAGTGG TCTGCGGAAC CGGTGAGTAC GCCGAATTGC CGGAAAGACT101 GGGTCCTTTC TTGGATTAAC CCACTCTATG TCCGGTCATT TGGGCGTCCC151 CCGCAAGACT GCTAGCCTAG TAGCGTTGGG TTGCGAACGG CCTTGTGGTA201 CTGCCTGATA GGGTGCTTGC GAGTGCCCCG GGAGGTCTCG TAGACCGTGC251 ATCATGAGCA CAAATCCTAA ACCTCAAAGA AAAACCAAAA GAAACACAAA301 CCGCCGCCCA CAGGACGTCA AGTTCCCGGG AGGCGGTCAG ATCGTTGGCG351 GAGTTTACTT GCTGCCGCGC AGGGGCCCCA GGTTGGGTGT GCGCGCGACA401 AGGAAGACTT CCGAGCGATC CCAGCCGCGT GGGAGACGCC AGCCCATCCC451 GAAAGATCGG CGCTCCACCG GCAAGTCCTG GGGAAAGCCA GGATR43-SEQ ID NO.331 GGCGTTAGTA TGAGTGTCGT ACAGCCTCCA GGCCCCCCCC TCCCGGGAGA51 GCCATAGTGG TCTGCGGAAC CGGTGAGTAG ACCGAATTAC CGGAAAGACT101 GGGTCCTTTC TTGGATAAAC CCACTCTATG TCCGGTCATT TGGGCGTCCC151 CCGCAAGACT GCTAGCCTAG TAGCGTTGGG TTGCGAACGG CCTTGTGGTA201 CTGCCTGATA GGGTGCTTGC GAGTGCCCCG GGAGGTCTCG TAGACCGTGC251 ATCATGAGCA CAAATCCTAA ACCTCAAAGA AAAACCAAAA GAAACACAAA301 CCGCCGCCCA CAGGACGTCA AGTTCCCGGG TGGCGGCCAG ATCGTTGGCG351 GAGTTTACTT GCTGCCGCGC AGGGGCCCCA GGTTGGGTGT GCGCGCGACA401 AGGAAGACTT CCGAACGGTC CCAGCCGCGT GGGAGGCGCC AGCCCATCCC451 AAAAGATCGG CGCTCCACCG GCAAGTCCTG GGGAAAGCCA GGAT含病毒序列的克隆體以下列方式被存放在American Type CultureCollection，Baltimore，Maryland分離體SEQ ID NO.質粒標號ATCC存放號 存放日期C929pHCV-C975265 1992年7月2日R110 30pHCV-R110 75266 1992年7月2日質粒pHCV-C9含有一種新的變異的C9序列。四種與C9序列相關的變異體表示於圖1中。已知分離體的序列信息來源如下HCV-J1，HCV-J4(1990年的Japan J.Exp.Med.6(3)期第167-177頁Okamoto等人的文章)；HCV-J(1990年的Mol.Biol.Med.7期第495-501頁Kato等人的文章)；HCV-BK(1991年的J.Virol.65期第1105-1113頁Takamizawa等人的文章)；以及HCV-1 US-PT(1991年的Proc.Natl.Acad.Sci.USA88期第1711-1715頁Han等人的文章)。編號是根據1990年的Proc.Natl.Acad，Sci USA87期第9524-9528頁Kato等人的文章。
表3C9分離體與原型美國(PT-HCV)和日本分離體(J-HCV)的核苷酸和胺基酸序列同種性的確定。<
>因此，本發明提供了專門測定C9分離體以及區分該分離體與其它肝炎分離體的物質和方法。在一些實施例中，本發明的方法是基於採用或不採用PCR來放大目標序列的核酸的雜合。在另一些實施例中，本發明的方法採用了專門用於C9分離體的免疫球蛋白。
專用於C9的引子及探針的低核苷酸序列表示於下面的表4中。
表4探針SEQ ID NO.37MY 160 5′-TGTCCGGTCATTTGGGCG-3′ (nt216-233)SEQ ID NO.34(1)5′-TTGCCGGAAAGACTGGGTCCTTTC-3′(nt174-197)SEQ ID NO.35(2)5′-CAAAAGAAACACAAACCGCCGCCC-3′(nt374-397)SEQ ID NO.36(3)5′-CCAGCCCATCCCGAAAGATCGGCG-3′(nt527-550)正向引子SEQ ID NO.38(1)5′-AAACCCACTCTATGTCCGGTC-3′ (nt204-224)SEQ ID NO.39(2)5′-GTACGCCGGAATTGCCGGAAA-3′ (nt163-183)SEQ ID NO.40(3)5′-CCTCAAAGAAAAACCAAAAGA-3′ (nt360-380)反向引子SEQ ID NO.41(4)5′-TGGCGTCTCCCACGCGGCTGG-3′ (nt509-529)SEQ ID NO.42(5)5′-CTTTCCCCAGGACCTGCCGGT-3′ (nt555-575)用於識別核苷酸的編號系統取自上述1990年的Proc.Natl.Acad.Sci.上Kato等人的文章。
一種低核苷酸KY 150(SEQ ID NO.43)可用於檢測C9分離體及前面已知的HCV原型分離體。該低核苷酸具有以下序列5′-CATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGT-3′.
對於本領域的普通技術人員來說顯而易見的是表4中所示的任何正向/反向的引子對都適用於專門放大C9分離體及相關的同型體。還顯而易見的是選擇一個適於雜合體為表4中所給的核苷酸位置的導引的放大了的核酸子序列的C9-專用的引子。
在一個優選實施例中，本發明的引子與目標核酸的聚合酶鏈反應(PCR)放大一起使用。由於HCV是一種RNA病毒，在放大過程的第一步是待放大區域的DNA複製體(cDNA)的合成。反轉錄可以作為一個獨立的步驟進行，或如下面所述，在一個同型的反轉錄聚合酶反應(PT-PCR)，即用於放大RNA的聚合酶 鏈反應的一種變型中進行。
儘管PCR方法在本技術領域內是眾所周知的(見美國專利第4,683,195；4,683,202及4,965,188號)，但是為了明確起見，並且為了那些對PCR方法不熟悉的人充分理解本發明，下面給出了一些PCR的一般性知識。
為了採用PCR方法放大樣品中的目標核酸序列，該序列對於放大系統的組成來說必須是可以得到的。通常這種可得性是通過將核酸從樣品中分離出來而保證的。從生物樣品中提取核糖核酸的多種技術已在本領域內已知。例如，參見1989年的PCR Technology(Erliched.，Stockton Press，New York)中Rotbart等人的文章及1987年的Biochemistry 26期第1617-1625頁上Han等人的文章中所描述的那些技術。另外，如果樣品相當容易分解，則在採用PCR技術進行放大之前，不需要對核酸進行純化，即，如果樣品中包括細胞，特別是外周血液淋巴細胞或單核細胞，則細胞內成分的溶胞和分散只能通過讓細胞懸浮在低滲的緩衝液中來完成。
每個PCR循環的第一個步驟包括核酸複合體的分離。當然，如果目標核酸是單股的，即單股RNA，則在第一個特循環中不需要初始分離步驟。一旦兩股被分開，則PCR的下一步包括將分離開的股與位於目標序列兩側的引子雜合，則引子被擴展成與目標股互補的複製體。為成功進行PCR放大，引子被設計以便每個引子沿著複式序列雜合的位置就是使得一個引子合成得到的擴展產物，當從模板(補體)上分離出來時，起到另一個引子擴展的模板作用。變性、雜合及擴展循環可按需要重複多次以獲得所希望數量的放大的核酸。
在PCR方法的優選實施例中，股分離是通過將反應加熱到足夠高的溫度並持續足夠長時間以引起複合體的變性但不引起聚合酶的不可逆變性來獲得的(見美國專利第4,965,188號)。典型的熱變性包括約80℃至105℃的溫度持續幾秒至幾分鐘的時間。然而，股分離可採用任何包括物理的，化學的或酶的方式進行。可以採用螺旋酶，例如或一種顯示出螺旋活性的酶來誘發股分離。例如，在存在ATP的情況下，RecA酶就具有螺旋活性。適於採用螺旋酶進行股分離的反應條件是本技術領域內已知的。(參見1978年的CSH-Quantative Biology 43期第63-67頁上Kuhn Hoffman-Berling的文章；和1982年的Ann.Rev.Genetics 16期第405-436頁上Radding的文章)。
在包括適當的鹽、金屬陽離子及pH緩衝液系統的反應介質中存在適量的四種脫氧核苷三磷酸鹽(一般為dATP，dGTP，dCTP，以及dTTP)，的情況下，PCR中的引子依賴於模板的擴展被一種聚合劑催化。適當的聚合劑是已知用來催化依賴模板的DNA合成的酶。由於C肝是一種RNA病毒，因此，作為引子擴展的初始模板是RNA。適合於由RNA模板合成互補的複製-DNA(cDNA)序列的聚合劑是反轉錄酶(RT)，如鳥成髓細胞性白血病病毒RT，Moloney(莫洛尼)鼠白血病病毒RT，或Thermus嗜熱菌(Tth)DNA聚合酶，一種由Perkin Elmer銷售的具有反轉錄酶活性的一種熱穩定的DNA聚合酶。一般在初始反轉錄步驟留下DNA鏈作為放大模板之後的第一個變性步驟中，基因RNA/cDNA複式模板被加熱變性。與一個DNA模板一起使用的適當的聚合酶包括，例如，E.coli DNA聚合酶I或其Klenow片段，T4DNA聚合酶，Tth聚合酶及Tag聚合酶，從一種由Hoffmann-LaRoche研製和生產的，並由Perkin Elmer銷售的Thermus水生動植物中分離出來的一種熱穩定的DNA聚合酶。後一種酶被廣泛用於核酸的放大和排序。採用Taq聚合酶的反應條件在本領域內是已知的並且在上述1989年PCR Technology上Gelfand的文章中作了描述。
當RNA被放大時，進行一個初始反轉錄(RT)步驟以產生RNA的一個DNA複製體(cDNA)。1991年7月11日出版的國際專利第WO91/09944號中描述了採用一種在PCR放大中也起作用的熱穩定聚合酶進行高溫反轉錄。高溫RT得到了更強的引子特異性並改進了效率。在「同種的RT-PCR」中，相同的引子和聚合酶足以滿足反轉錄和PCR放大步驟兩者的要求，並且優選反應條件以使得不需改變試劑即可發生兩種反應。Thermus嗜熱菌DNA聚合酶，一種可以起到反轉錄酶作用的熱穩定的DNA聚合酶被用於所有的引子擴展步驟中，而無論模板如何。兩個過程無需打開試管更換或加入試劑即可完成；只有溫度模式在第一個循環(RNA模板)和其餘的放大循環(DNA模板)之間要進行調整。
預計HCV基因組的5′終端具有重要的二級結構，該結構可能通過幹擾與引子的雜合，利用反轉錄酶，如Moloney鼠白血病病毒RT，來阻止反轉錄的進行。不幸的是，提高反應溫度使二級結構變性的方法同時也使得大多數反轉錄酶失去活性。而利用重組的Thermus嗜熱菌(rTth)DNA聚合酶的反轉錄活性則允許cDNA合成在高溫下進行而不會使酶滅活。本發明的引子在這種高反轉錄溫度下保持與RNA模板雜合。
PCR方法可以一種在每個步驟之後加入新的試劑的分段方式進行，或以一種所有試劑都同時加入的方式，或以一種在給定數目的步驟之後加入新鮮的或不同試劑的部分分段方式進行。例如，如果通過加熱誘發股分離，且聚合酶是對熱敏感的，則必須在每一個股分離循環之後加入聚合酶。但如果，例如，採用螺旋酶來變性，或如果採用一種熱穩定聚合酶來擴展，則所有試劑都可以在一開始時加入，或可替換地，如果試劑的克分子比對於反應很重要的話，則由於合成反應的消耗，需周期性地補充試劑。
對於本領域普通技術人員已知的是，PCR過程極普遍的是採用熱穩定酶以自動操作過程的方式進行的。在該過程中，反應混合物的溫度通過變性區域，引子緩冷區域，及擴展反應區域進行循環。或者緩冷和擴展溫度可以是相同的。在實例中所述RT-PCR採用了這種兩步溫度循環。專門適於與熱穩定酶一起使用的設備可以買到。
對於本領域內的普通技術人員來說還應知道，由前述反應和非特定的放大作用而產生的放大後的核酸導致的PCR的汙染問題。一個減少這些問題的方法就是允許由前述反應產生的任何放大後的DNA的酶的降解並減少非特定放大。PCR放大是在替代dTTP的dUTP存在的情況下進行的。所產生的雙股的含尿嘧啶的產物將被尿嘧啶N-糖基酶(UNG)降解，而正常的含胸腺嘧啶的DNA不會被UNG降解。在放大作用開始之前向放大反應混合物中加入UNG，降解了所有可能作為目標的含尿嘧啶的DNA。由於前面反應中的放大了的產物是含尿嘧啶DNA的唯一來源，則這一方法有效地對反應混合物作了消毒，消除了來自前面反應的汙染問題(攜帶)。UNG本身由於加熱而暫時不起作用，這樣，在放大過程中變性步驟也用作使UNG失活。因此，儘管包含尿嘧啶，新的放大產物是在有效的，無UNG環境下形成的，並不會被降解。
本發明的一個優選實施例使用了一種包含一個消毒步驟的同種RT/PCR方法。這種一個試管不添加反應起到了消毒RT/PCR反應，防止攜帶汙染的作用並提供了放大了的，可從含RNA目標的樣品中檢測到的PCR產物。該方法在實施例6中舉例說明。
雖然優選的實施例包括有RT-PCR放大作用，但樣品中目標序列的放大可採用任何已知的方法來完成，如連接酶鏈反應(LCR)，轉錄放大，和自持序列複製，其中每一種方法都提供了充分的放大以使得目標序列可通過核酸與一個SSO探針的雜合被檢測到。或者，能夠將探針放大到可檢測水平的多種方法都可被採用，例如，Qβ-複製酶放大方法。術語「探針」包含了用於上述過程中的特定序列的低核苷酸；例如，用於LCR的兩個或多個低核苷酸就是為本發明目的而採用的「探針」，儘管某些LCR實施例僅需用探針的連接來表示等位基因的存在。
特定序列探針的雜合是成功地完成本發明的一個重要步驟。本發明的特定序列的低核苷酸探針專門與HCV基因組的特定片段雜合，並具有與來自其它生物體的序列的不穩定失配。在充分嚴格的雜合條件下，探針只是專門與精確互補的序列雜合。雜合條件的嚴格性可被放鬆，從而允許不同數量的序列不符合。放大後的產物的檢測使用了這種特定序列的雜合以確保檢測到唯一準確放大的目標，因此，減少了由於來自相關生物體的同種序列的存在而引起的假陽性的機會。
檢測在SSO探針和核酸序列之間形成的雜合體的測定方法是需要的，因為除雜合區域以外探針還具有其它特徵。例如，如果探針首先被固定，如以下面所述的「反」點斑式固定，則探針還包含較長範圍的，能夠採用擴散法，一種在國際專利第89/11548號中更詳細描述的技術，被固定在一個尼龍支持物上的多-dT。在點斑格式中，固定的目標與含有用於檢測過程的化合物的探針雜合，如下所述。
本發明的探針可以利用上述合成低核苷酸的技術合成和標記。通過用32P-ATP和激酶培養探針的方法將探針在5′端用32P標記。一種合適SSO探針的非放射性標記是辣根過氧化物酶(HRP)。製備和檢測含有該標記的探針的方法在下面的實施例中以及美國專利4,914,210和4,962,029中作了描述。關於這種被標記探針的使用方面的其它信息參見美國專利第4,789,630號；1988年度N.Eng.J.Med.319其第537-541頁Saiki等人的文章；以及1988年的Bio/Technology 6期第943-947頁上Bugawan等人的文章。有用的色原包括紅的褪色染料和3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺(TMB)。
通過測定SSO探針是否與存在於樣品中的病毒序列鍵聯，本發明的探針可被用於確定樣品中是否存在病毒序列。為本發明目的而檢測在SSO探針和樣品中的核酸序列之間形成的雜合體的檢測方法已為本領域公知。例如，可採用點斑方式來完成檢測，如在實施例中所描述的。在點斑方式中，未標記的放大了的樣品被鍵聯在一個固體支持物上，如一種薄膜上，在適當的雜合條件下，用標記的探針對膜進行培養，通過衝洗除去未雜合探針，並用過濾器監測鍵聯的探針的存在。當用一個探針分析多種樣品時，點斑方式是十分有用的。多種樣品被固定在同一膜的分散位置上，並通過將膜滲入探針溶液使它們同時雜合。
當使用多種不同的探針時，另一種十分有用的方法是「反」點斑方式，其中放大了的序列含有標記，且探針被鍵聯在固體支持物上。如果本發明的試驗被用作同步進行的一組試驗之一的話，這種方式將是有用的。在該方式中，未標記的SSO探針被鍵聯在膜上並在適當嚴格的雜合條件下暴露給標記的樣品。然後通過在適當嚴格條件下衝洗除去未雜合的標記樣品，過濾器則監測鍵聯序列的存在。
正向和反向的點斑測定方法都可以在微量滴定盤中方便地進行。例如，探針可與粘接在微量滴定盤中的牛血清白蛋白(BSA)相連合，從而固定探針。
在另一種適合的測定系統中，在PCR放大過程中加入標記的探針。在每一個合成步驟中與目標DNA雜合的任何SSO探針都被聚合酶如Taq聚合酯，5′至3′端的核酸外切酶活性所降解，然後檢測由探針得到的降解產物。因此，分解產物的存在表示在SSO探針和目標DNA之間產生了雜合。
上面給出的核苷酸序列是本發明的一個重要方面。儘管只表示出序列的一股，但對於本領域普通技術人員來說應認識到序列的另一股可從上述信息中推斷出來。這些信息能夠構成本發明的其它探針和引子。
本發明還涉及試劑盒，包含對於實施本發明方法有用的組分的多容器裝置。一種有用的試劑盒含有用來檢測C肝病毒核酸的SSO探針。在某些情況下，SSO探針可被固定在一個適當的支持膜上。試劑盒還可包含用於RT-PCR的引子，如在本發明優選實施例中有用的引子。試劑盒其它優選組分包括，例如，反轉錄酶或聚合酶，核苷三磷酸鹽的酶解物，用於標記的裝置(例如，如果標記物是生物素的話，抗生物素蛋白-酶結合物，酶解物及色原)，及用於反轉錄，PCR或雜合反應的適當的緩衝劑。除上述組分外，試劑盒還可包含實施本發明方法的教導。
除PCR和核酸探針的使用外，本發明還提供了用來培養對特殊的HCV分離體特效的免疫球蛋白的方法。該方法的完成通常是首先表達病毒核酸序列，然後用被表達的蛋白質培養對所需分離體特效的抗體。
肝炎分離體的核苷酸序列可用於各種重組表達系統。在該方式中，所需基因，如殼體基因可被表達。原核或真核生物宿主中的核苷酸序列的重組表達在本領域內是眾所周知的(見上述Sambrook等人文章)。被表達的蛋白質可被用於培養對分離體特效的免疫球蛋白。然後將免疫球蛋白用於檢測病毒存在的測定方法中，如下面所述。蛋白質也可用於檢測感染病毒的患者體內抗體的存在。
所希望的病毒序列在採用標準技術轉化為用來表達的哺乳動物、酵母菌或昆蟲細胞系之前方便地插入到一種媒介物中。原核生物被優選用於中間的克隆繁殖步驟。
為表達病毒序列而用於將轉化的基因物質引入到宿主細胞中的特殊方法不是要求特別嚴格的。可以採用熟知的，將外來核苷酸序列引入到宿主細胞中的任何方法。這些方法包括採用磷酸鈣轉染，聚凝胺(Polybrene)，原生質體融合，electroporation，脂質體，微量注射，質粒媒介物，病毒媒介物，以及任何其它的將克隆繁殖的基因DNA，cDNA，合成DNA或其它外來基因物質引入到宿主細胞的熟知的方法(見上述Sambrook等人的文章)。唯一必要的是所採用的特殊基因工程方法能夠成功地將至少一個能夠表達所需的病毒蛋白質的基因引入到宿主細胞中。
用來將基因信息傳輸到細胞中的特殊的媒介物也不是特別嚴格的。可以採用任何表達真核細胞中重組蛋白質的適宜的媒介物。
表達媒介物包含一個真核生物轉錄單元或表達盒，其中含有表達真核細胞中的病毒核酸序列所需的全部要素。一個典型的表達盒包含一個可操縱地與DNA序列相連對病毒蛋白質進行編碼的啟動基因及轉錄體有效地進行多腺苷酸化所需的信息。
媒介物通常包括可選擇的標記，如鈉，鉀ATP酶，胸苷激酶，氨基苷磷酸轉移酶，潮黴素B磷酸轉移酶，黃嘌呤-鳥嘌哈磷酸核糖轉移酶，CAD(氨基甲醯磷酸合成酶，天冬氨酸鹽氨甲醯基轉移酶和二氫乳清酶)，腺嘌呤脫氨酶，DHFR，及天冬醯胺合成酶和烏本苷選擇。
本發明的表達媒介物一般含有便於細菌中的媒介物克隆繁殖的原核生物序列和一種或多種僅在真核生物細胞，如哺乳動物細胞中被表達的真核生物轉錄單元。媒介物可包含或不包含一個真核生物複製子。如果存在一個真核生物複製子，則媒介物通過適當的可選擇標記在真核生物細胞中是可放大的。如果媒介物不包括真核生物複製子，則不可能產生附著放大。取而代之的是，轉染的DNA併入轉染細胞基因中，而啟動基因引導所需基因的表達。表達媒介物一般是由取自不同的，充分特性化的病毒或哺乳動物基因的成分構成的。對於在培養的哺乳動物細胞中克隆繁殖的基因的表達的一般性討論參見上述Sambrook等人Ch.16。
表達之後，媒介物被引入到細胞中，轉染的細胞在有利於病毒蛋白表達的條件下被培養，並利用標準技術將蛋白從培養物中復原。可以採用提純蛋白的多種標準方法，例如，硫酸銨沉澱反應，凝膠電泳，離子交換色譜法，大小排斥色譜法或親合色譜法。總的參見ProteinPurification，Springer-Verlag，N.Y.(1982)上Scopes，R.的文章。
除採用被所希望的病毒基因組編碼的蛋白質外，還可以採用複製對病毒特效的抗原決定簇的肽來培養專門對於該病毒的抗體。該技術對於本領域的普通技術人員來說是熟知的，並在，例如，Geysen等人Multipin Peptide Synthesis-A Review，Coselco Mimotypes，PTY Ltd。中作了描述。
上面討論的多肽則被用於採用標準技術培養抗體當中。免疫球蛋白可用於多種用途。例如，它們可被用來測定在一種生物樣品中病毒的存在或者提純病毒抗原，例如採用親合色譜法。它們也可被用來使相應的蛋白無效，包括抑制全部病毒的傳染性。因此對於本領域的普通技術人員來說可獲得的大量有關生產和製造各種免疫球蛋白分子的技術可以很容易地被用於產生對於特殊分離體的診斷和檢測有用的分子。
如在此使用的術語「免疫球蛋白」，是指由一種或多種實質上被免疫球蛋白基因編碼的一個或多個多肽構成的蛋白質。已知的免疫球蛋白基因包括K，λ，α，γ，δ，ε和μ不變區域基因，還有無數的免疫球蛋白可變區域基因。免疫球蛋白可以以除抗體之外的任何形式存在，包括例如Fv，Fab，和F(ab)2，還有以單鏈形式存在(例如，1988年的Proc.Natl.Acad.Sci.USA85期第5879-5883頁上Huston等人的文章；1988年的Science 242期第423-426頁上Bird等人的文章；和1986年Nature 323期第15-16頁上Hunkapiller和Hood的文章)。對於免疫球蛋白的結構和功能的一般性評述參見Fundamental Immunology，2d Ed；W.E.Pauled.，Ravens Press，U.Y.，(1989)。
可以採用各種方式生成使等位基因專門與所希望的分離體鍵聯的抗體。非人類單克隆抗體，例如鼠的，復齒目的，馬的等抗體的生成是熟知的並可通過例如用含有病毒或其中的一個片段的製劑使動物免疫的方式完成。由免疫的動物體獲得的抗體-生成細胞被採用標準技術使其不滅並進行篩選。關於單克隆抗體生成的一般性方法的討論參見Havlow和Lane的Antibodi es，A Laboratory Manual ColdSpring Harbor Publications，N.Y，(1988)。
在某些情況下，希望採用重組DNA技術將非人類抗體的抗原鍵聯區域，例如F(ab′)2或多可變區域，轉變為人類不變區域(Fc)或構架組織區域以便從本質上生成人類分子。這種方法一般為本領域內已知並在例如，美國專利4,816,397，歐洲專利173,494和239,400中作了描述。另外，人們可以採用根據1986年Science 246期第1275-1281頁上Huse等人概括的總的原始記錄中的從人類B細胞中篩選DNA集合的方式分離對於專門與病毒鍵聯的人類單克隆抗體或其中一部分進行編碼的DNA序列，然後克隆繁殖並放大對具有所希望的特異性的抗體(或鍵聯片段)編碼的序列。
然後如上述方式產生的免疫球蛋白被用在許多確定肝炎分離體存在的診斷方法中。例如，對C9病毒特效的標記了的免疫球蛋白可被用於包括讓免疫球蛋白與預計含有該病毒的樣品接觸並檢測複合體是否形成的測定方法中。標記物可以按照本領域內熟知的方法直接或間接地與免疫球蛋白結合。如上面討論的在標記的低核苷酸上下文中，可以採用很多種標記物。成分可採用幾種方法中的任何一種被標記。一種普遍的檢測方法是採用3H，125I，35S，14C，或32P標記的複合物或類似物的放射自顯影照片。放射性同位素體的選擇依賴於預計研究中便於合成的選擇，變化的穩定性以及所選擇的同位素的半壽命。非放射性標記物包括與標記的抗體鍵聯的配體，螢光劑，化學發光劑和酶。標記物的選擇依賴於所需靈敏性，與複合物結合的便利性，穩定性要求和可得到的測試設備。
非放射性標記物經常是採用間接方式連接的。一般地，一個配體分子(例如生物素)與分子共價地鍵聯，然後配體與一個抗配體分子(例如鏈黴抗生物素蛋白)鍵聯，該抗配體分子既是固有地可檢測的，也是被共價地鍵聯在一信號系統，如可檢測到的酶，螢光複合物，或化學發光複合物上。配體和抗配體可以在很大範圍內變化。由於配體具有天然的抗配體，例如生物索，甲狀腺素，皮質醇，則全可被用於與標記的天然產生的抗配體的結合。或者，任何半抗原或抗原複合物均可被用於與一種抗體結合。
分子還可被直接用於信號發生複合物，例如通過與一種酶或螢光基團結合。具有標記物意義的酶基本上是水解酶，特別是磷酸酶，酯酶及糖苷酶，或氧化還原酶，特別是過氧化物酶。螢光複合物包括螢光素及其衍生物，若丹明及其衍生物，丹醯，傘形酮等。化學發光複合物包括蟲螢光素和2，3-二氫基二氮雜萘二酮，例如，盧米諾。對於可被採用的各種信號產生系統的評述，見美國專利第4,391,904號。
為了檢測本發明的複合物，一般將混合物與能夠鍵聯免疫球蛋白Fc區域的蛋白質接觸，如第二抗體，蛋白質A或蛋白質G。蛋白質最好被固定在一個固體表面上，且該固體表面被衝洗以除去對所需病毒特效的非鍵聯免疫球蛋白。將生物分子固定在固體表面上的許多種方法已為本領域已知。例如，固體表面可以是一種膜(例如，硝化纖維素)，一種微滴定盤(例如PVC或聚苯乙烯)或一個顆粒。所希望的成分可以共價鍵聯或非共價地通過非特異性結合進行連接。利用適合於所使用的特殊標記物的標準技術則可檢測到標記物。
上面討論的重組表達的蛋白質或病毒溶解產物也可被用在診斷過程中。這些過程一般包括讓懷疑含有抗體的生物樣品(如血清)與病毒接觸，並檢測免疫學反應。反應的檢測最好採用上述標記的蛋白質。適合於這個過程的方法在美國專利第5,055,391號中作了詳細描述。
給出下面列舉的本發明的實施例，只是為了說明本發明目的而不是對本發明範疇進行限定。通過閱讀前面的內容並根據實例，對那些本專業普通技術人員顯而易見的是，在權利要求範圍內包含了本發明大量的實施例。
實例1在同種RT-PCR中，同一種聚合酶起到了反轉錄酶和DNA聚合酶兩者的作用。這就使得HCV基因組的RNA的初始反轉錄和其後的cDNA放大在同一試管中進行，而不需要在兩個步驟之間打開試管更換試劑。
利用產自Micro Probe的Iso QuickTM核酸提取試劑盒將核酸從血清或血漿中分離出來。所有的放大作用都是利用產自PerkinElmer的Tc9600 ThermocyclerTM和Micro AmpTM試管，以20微升的總的反應容量進行的。每20微升反應的試劑列在下面表5中。
表5RT-PCR反應混合液H2O6.3μl10xRT反應緩衝劑(100mM Tris-HCl(pH8.3)，900mM. HCl)2.0μlMncl2(10mM，0.85mM最後濃度 1.7μldNTP(dATP，dCTP，dGTP和dTTP各2mM在H2O，pH7.0中)2.0μl引子KY78(SEQ ID NO.18)(1.5μm在H2O中，3微克克分子/反應最終濃度)2.0μl引子KY80(SEQ ID NO.5)(1.5μm在H2O
中，3微克克分子/反應最終濃度) 2.0μlrTth DNA聚合酶(Perkin Elmer，Norwalk，CT.USA；0.18μM或2.5單位/μl在1X酶貯存緩衝劑(20μm Tris-Hcl(pH7.5)，100mM KCl，0.1μM EDTA，1μM DTT0.2％20 Tween 20(Pierce Surfactants)，50％甘油[v/v]) 2.0μl模板核酸(在d H2O中總量＜250ng) 2.0μl對TC9600進行編程以提供如下分布的反應溫度。在70℃下預熱1分鐘後，程序暫停一段足以插入反應試管的時間，程序重新啟動。反應維持在70℃，歷時15分鐘，以便進行反轉錄。然後反應溫度升至95℃，維持1分鐘，以便使RNA-cDNA複合體變性。下一步，反應溫度要經歷兩個95℃持續15秒和60℃持續20秒以循環，接著是38個90℃持續15秒的60℃持續20秒的循環。最後，反應溫度維持在60℃維持4分鐘，以進行最後的擴展步驟，冷卻到15℃，維持這一溫度直到放大了的樣品分析得以完成。
實例2採用點斑式檢測方法，將一小部分放大了的DNA進行變性並用到一個尼龍過濾器上，而後，該過濾器與一個標記的探針雜合。探針雜合區域是KY88(SEQ ID NO.12)，並用32P進行放射標記。或者，探針可共價地結合到辣根過氧化物酶(HRP)上，以便在有色原或化學發光基底物存在的情況下，提供一種非同位素的檢測手段。
放大反應通常按照實例1所述的方法進行。而後PCR放大的產物經鹼處理予以變性。5μl的PCR產物加入5μl，0.5M的EDTA，pH8.0，8μl 5N的NaOH，和82μl的H2O。混合物在室溫下維持10分鐘以完成變性。
Bio DyneTMB尼龍過濾器(Pall Corp，Glen Cove，NY，USA)的製備是採用在H2O中浸泡5到10分鐘，在點斑複製(Bio-DotTMfrom Bio Rad，Richmond，CA，USA)已經形成之後，用200μl的H2O進一步漂洗。變性之後，在真空條件下，利用點斑裝置，將100μl的樣品混合液施於尼龍薄膜上，而後，每個凹室均用200μl 0.4N的NaOH漂洗，而整個過濾器則簡單地用2×SSC漂洗，並進行空氣乾燥，直至無積水留在上面。DNA被固定並交聯在尼龍過濾器上，這是利用StratalinkerTM(Stratagene，La Jolla，CA，USA)UV光箱(「自動交聯」裝置)，通過1200mJ/cm2的光通量的紫外線照射來實現的。
過濾器的「預雜合」是通過將其浸泡在隔熱袋中的雜合緩衝液內(5XSSPE，5XDenhardt的溶液，0.1％SDS，50μg/ml鯡魚精液DNA)，在50℃(空氣振蕩器)下保持至少30分鐘。而後，緩衝劑用同樣數量的含有1-2×105cpm/ml探針的相同溶液置換，過濾器可以在2小時至一整夜的時間內在50℃下進行雜合。
雜合後，將過濾器在2XSSPE/0.1％SDS中衝洗三遍；兩次是在室溫下持續20分鐘，另一次是在嚴格的60℃高溫下衝洗20分鐘。而後將過濾器吸乾，包以塑料包皮，用一或二個增光屏，在-70℃下對X-光底片暴光。
一個替換的目視觀測方法是將過濾器與結合有低核苷酸探針的辣根過氧化物酶雜合，其配製方法如Levenson和Chang 1989年在PCR Protocols中的A Guide to Method and Application(Innis等eds.Academic Press，San Diego)第92-112頁上和Saiki等人1988年的N.Eng.J.Med.319期第537-541頁上所描述的，每篇文獻都收編於此作為參考。雜合作用是採用每5ml雜合溶液2pmoles的HRP-SSO探針來進行的。
清洗後，有待用色原染色基底顯影的過濾器應在pH5.0的100μM檸檬酸鈉中漂洗，然後放入含有每毫升(Fluka)0.1mg/ml的3，3′5，5′-四甲基聯苯胺和百分之0.0015的過氧化氫的pH5.0的100μM檸檬酸鈉中，在室溫下輕輕攪動培養10到30分鐘。在水中漂洗顯影后的過濾器，並立即被拍照。準備好TMB檢測系統，並基本上按照Perkin Elmer銷售的AmpliTypeTMDQα DNA定型試劑盒中所描述的方法使用。在另一個實施例中，過濾器是採用化學發光檢測系統(ECL；Amersham ArlingtonHeights，IL，USA)進行顯影的。過濾器在PBS中漂洗5分鐘，並置入ECL溶液，輕輕攪動持續1分鐘。而後過濾器在室溫下在X-線底片上暴光1至5分鐘。
實例3在本發明的這一實施例中，使用了反點斑方式。探針的雜合區是KY88(SEQ ID NO.12)，KY150(SEQ ID NO.43)，或MY160(SEQID NO.37)而且探針是固定在一個薄膜上的。放大了的目標DNA與結合在薄膜上的探針雜合，如在尚未批准的序號為197,000和347,495的申請中；1989年的Proc.Natl.Acad.Sci.86期第6230-6234頁上Saiki等人的文章中；及由PerkinElmer銷售的Ampli TypcDQα DNA定型試劑盒內的產品插頁中所描述的。每份文獻都收編於此作為參考。放大的引子被生物素基化，如上述Levenson和Chang 1989年所介紹的那樣，因此，與結合在膜上的探針雜合的任何放大的DNA都可以很容易地被檢測到。
在一個實施例中，檢測是靠結合有鏈黴抗生物素蛋白的辣根過氧化物酶(SA-HRP)與任一種生物素基化了的，放大的與結合在膜上的探針雜合的DNA進行反應來實現的。於是，通過SA-生物素的相互作用，HRP變成可與放大的DNA結合，並可被用來產生一個信號，這可以採用多種熟知的方式實現，如利用四甲基聯苯胺的氧化作用生成一種帶色的化合物(見美國專利第4,789,630號)。
儘管探針可用任意一種方法固定在薄膜上，一種優選的方法是用一個很長的多-dT序列接在探針雜合區域末端。於是，所得到的多-dT「尾巴」可與尼龍薄膜上的胺基基團起反應。將探針共價地固定在薄膜上，可以利用UV輻射使這種反應變得更加容易。
末端的脫氧核糖核苷酸轉移酶(TdT，Ratliff Biochemicals；為進行如下反應，假定濃度約為120單位/μl，這相當於100pmole/μl)可用來在探針上生成一個多-dT尾巴，雖然也可以在市場上買得到的DNA合成裝置上合成帶尾巴的探針。當採用DNA合成裝置製造帶尾巴的探針時，仍應將尾巴置於探針的5′-末端上，因此，在尾巴區，首先發生不希望的過早的鏈終止。
TdT反應需在容積約為100μl的含有1XTdT鹽，200pmole低核苷酸，800μMdTT和60單位TdT的溶液中進行。10XTdT鹽是1.000mM K-二甲胂酸鹽，10mM CoCl2，2mM-二硫蘇糖醇，250mM的Tris-d，pH7.6，並按收編於此作為參考的Meth.Enzymol 65期第43-62頁上Roychoudhury和Wu，Meth所述的方法製備的。為方便起見，可配製出8 mM dTTP的10X貯備溶液(用NaOH中和到pH7.0)。
TdT反應需在37℃下進行2小時，然後，通過加入100μl10mM的EDTA，pH8予以停止。帶尾巴的低核苷酸的最終濃度為1μM(1pmole/μl)，而均聚物尾巴的長度為400個殘基。可以通過調節dTTP與低核苷酸的克分子比來改變尾巴的長度。加了尾巴的探針可在-20℃下貯存直至使用。
對於反點斑式優選的薄膜是由Pall製造並由ICN以BioTransTM尼龍薄膜出售的一種BiodyneTMB尼龍薄膜，微孔大小為0.45微米。可用Bio Rad生產的Bio-DotTM點斑裝置很方便地將探針點式固定在薄膜上。每一種探針都被均勻，離散地點式固定於薄膜上。在用於點斑裝置之前，約2到10微微克分子的每一種帶尾巴的探針與50到100μl的TE緩衝劑預先混合。點斑固定後，將薄膜簡單地放在吸紙上，吸去過多的液體。然後將薄膜放入UV光箱內，如Stratagene生產的StratalinkerTM光箱，並在光通量為，50到60微焦耳/cm2下用254nm曝光，以使加尾巴的探針固定在尼龍薄膜上。在雜合溶液中簡單漂洗約15分鐘以除去粘結的探針之後，準備將薄膜與生物素基化了的PCR產物雜合。
通過加熱至95℃，並保持3到10分鐘，以使放大了的PCR產物變性。將40μl變性後的PCR產物加在探針板上以進行雜合。雜合作用是在57℃下在裝有雜合緩衝液的搖動的水槽中進行的，歷時20分鐘，雜合緩衝液是由0.5XSSPE，0.25％SDS，和5XDenhardt溶液(20XSSPE，含有0.02MEDTA，0.2MNaH2PO4，3.6MNaCl；0.11MNaOH，調整到pH7.4)組成的。用3ml的在3.1ml雜合緩衝液中含有25μl的SA-HRP溶液去置換雜合緩衝液，並在57℃下在一個搖動的水槽中持續培養20分鐘。
清洗是在2×SSPE和0.1％的SDS清洗緩衝液中進行的。薄膜在10ml清洗緩衝液中經簡單漂洗後，歷時12分鐘的嚴格的清洗在57℃下在10ml的清洗緩衝液中進行。在10ml，0.1M的檸檬酸鈉，pH5.0中清洗5分鐘之後，進行室溫下歷時5分鐘的另一次清洗。
色原的結合是在5ml的色原溶液中進行的，室溫下歷時25-30分鐘，該溶液包含5ml 0.1 M的檸檬酸鈉，5μl 3％的過氧化氫和0.25ml的色原(Perkin Elmer生產的TMB)。在室溫下進行三次在蒸溜水中歷時10分鐘的清洗。用1XPBS在室溫下歷時30分鐘的後清洗可以提高信號的質量。在這些包括著色的步驟中，薄膜應該用鋁箔包裹以避光，顯影后的薄膜應被拍照下來以作為永久性記錄。
實例4在本發明的這一實施例中採用了微滴定盤方式。探針被固定在微滴定盤上的凹室內。如上所述，放大了的目標DNA與已經鍵聯在上面的探針雜合。如在前述實施例中所述，起放大作用的引子被生物素基化以使其能檢測出與鍵聯的探針雜合的放大的DNA。
首先，所需的與BSA鍵聯的探針可以吸附到每個凹室的塑性表面上，然後，用蛋白質，如牛血清白蛋白將凹室封閉。優選地，採用可由Corning得到的96個凹室的盤。
放大一旦完成，PCR試管被從熱循環控制器(可由PerkinElmer得到)上取下。在每個PCR試管中加注100微升變性溶液。在每個試管上使用一種新的帶吸管的頂端。在一個實施例中，檢測工作不是馬上進行的。在那種情況下，PCR試管在2℃至8℃下存放了一晚上。變性放大反應劑在2℃至8℃存貯情況下變得粘稠了。試管在打開之前在25℃至30℃之間粗略加熱以便於吸出。
適當數量的8凹室微滴定盤條帶(最少為2個條帶)被取出並放於微滴定盤框架中。微滴定盤中每一個凹室吸入100μl的雜合緩衝液。
變性溶液含有0.4MNaOH；80mM的EDTA和0.005％的麝香草酚蘭。雜合/中和緩衝液含有2.5M的NaSCN；80mM的NaH2PO4；10mM的NaH2PO4；和0.125％的TweenTM20。使用前核實pH值為5.0+/-0.2。
使用帶有多通道吸管的堵住的頂端，將25μl的變性放大反應劑由支架上的PCR試管中吸到微滴定盤中相應的凹室位置上。該盤用微滴定盤蓋覆蓋，並在側面輕輕敲擊10到15下，在吸入適量試劑後，凹室將變成淺黃色。如果未觀察到改變，或僅僅是單一的改變為蘭色，加入了過量的amplicon。試驗持續下去，直到正OD值增加而負OD值不受影響。將該盤在37℃下恆溫培養60分鐘。
在恆溫培養之後，用清洗液將盤清洗5次，盤的清洗可以人工方式完成，或採用適當編程的自動微滴定盤清洗器完成。為進行清洗，採用了一種1XPCR清洗緩衝劑。一種10X濃縮的PCR清洗緩衝液是按如下方法配製的9.94克/升的磷酸二氫鈉；4.41克/升的磷酸鈉(單元基)；3.722克/升的EDTA；87.66克/升的氯化鈉；13.7克/升的TweenTM20；和10克/升的ProClin 300(Rohm和Haas，Philadelphia，PA)。溶液用磷酸調節的pH值(優選的pH值為6.5-7.1)。
用於手工清洗時，盤內的東西被倒空並拍幹。在待試驗盤中的每個凹室中加入300μl的清洗液，並且讓該盤乾燥15到30秒鐘。將盤再次倒空並拍幹。這種清洗過程應再重複四次。
對於一個自動微滴定盤清洗器，採用以下方法，凹室中的東西被吸出來，清洗器依程控在即將試驗盤的每一個凹室內加入350微升的正在使用的清洗液，浸泡30秒鐘並吸出，這些步驟應再重複四次，然後將盤拍幹。
在即將試驗的盤內每個凹室中加入100μl的結合液，抗生物素蛋白-HRP結合液是按如下方法配製的。稀釋液含有0.1克分子濃度；0.25％Emulist 25(DKS International，Inc.，Tokyo，Japan)，0.1％的Kathon CG(Rohm和Haas，Philadelphia，PA)；0.1％的酚；1.0％的牛γ球蛋白。溶液具有達7.3用濃HCl調節的pH值。在該稀釋液中加入10nM的結合的抗生物素蛋白(Vector Labs，Burlingame，CA)。於是盤被覆蓋，並在37℃下恆溫培養50分鐘，並按上述方法再次清洗。工作基質是採用將2.0ml基質A和0.5ml基質B混合配製而成的，這是用於兩個8凹室微滴定盤條帶(16個試驗)的每一聯的用量。基質A含有3mM過氧化氫；6.5mM的檸檬酸鹽；和0.1％的Kathon CG。基質B含有4.2mM的3，3′5，5′-四甲基聯苯胺和40％的二甲基甲酸鹽。工作基質的配製不能超過使用前三小時，或者在無陽光直射下貯存。
100μl的工作基質(基質A和基質B混合物)被加入到待試驗的盤內的每個凹室中，而後盤被覆蓋，並在室溫下(20℃至25℃)在暗處培養10分鐘，將100μl Stop Reagent(5％的H2SO4)加入準備試驗的每個凹室中。記錄下在450mM每個的凹室在加入Stop Reagent一小時內的吸收率。吸收率值被記錄下來作為樣本和對照。
實例5本發明的低核苷酸提供了大量的引子和探針的組合，它們可用於放大HCV基因組序列和檢測放大後的產物。試驗了大量的低核苷酸為證實其在RT-PCR放大過程中作為引子的有效性。
採用實例1中所述方法，不同的低核苷酸對均可進行PCR放大反應。放大後的產物用瓊脂凝膠電泳分離並著色的標準方法(見上述Sambrook等)進行檢測。在HCV序列的放大過程中，每一個上端引子KY 65(SEQ ID NP.1)和KY 98(SEQ ID NO.3)與每一個下端引子KY 68(SEQ ID NO.27)，KY 95(SEQ ID NO.20)和KY99(SEQ ID NO.26)有效地起著作用。KY 67(SEQ ID NO.10)與KY 68(SEQ ID NO.27)和KY 99(SEQ ID NO.26)一起有效地起作用，每一個上端引子KY 80(SEQ ID NO.5)，KY 83(SEQ IDNO.7)，KY84(SEQ ID NO.8)，KY 85(SEQ ID NO.9)和KY 144(SEQ ID NO.6)與每一個下端引子KY 78(SEQ ID NO.18)，KY95(SEQ ID NO.20)，KY 145(SEQ ID NO.19)，KY 148(SEQ IDNO.17)和KY 149(SEQ ID NO.16)一起有效地起作用。最後，每一個上端引子KY 80(SEQ ID NO.5)和KY 81(SEQ ID NO.11)與KY 100(SEQ ID NO.21)一起有效地起作用。
用KY 78(SEQ ID NO.18)和KY 80(SEQ ID NO.5)作為引子，經過PCR放大得到的放大產物，利用如上述實例2中所述方法，以KY88(SEQ ID NO.12)，KY 84(SEQ ID NO.8)和KY85(SEQ ID NO.9)中的每一個作為探針，即可被檢測出。
引子KY 153(SEQ ID NO.15)，KY 149(SEQ ID NO.16)和KY 148(SEQ ID NO.17)不能和KY 85下端的任何上端引子一起使用。KY 78(SEQ ID NO.18)的3′-端與KY 88(SEQ ID NO.12)的3′-端相鄰，因此，儘管這兩個引子可以起到一個引子對的作用，由於缺少交錯序列，使獨立的探測成為不可能。引子KY86(SEQID NO.13)只能與KY 100(SEQ ID NO.21)，KY 99(SEQ ID NO.26)，KY 109(SEQ ID NO.24)和KY 111(SEQ ID NO.25)配對。引子KY 87(SEQ ID NO.14)只能與KY 99(SEQ ID NO.26)，KY109(SEQ ID NO.24)和KY 111(SEQ ID NO.25)配對。
以上討論的KY 84(SEQ ID NO.8)，KY 85(SEQ ID NO.9)，KY87(SEQ ID NO.14)和KY 148(SEQ ID NO.17)對於檢測已知的HCV分離體而不是C9分離體是有用的。表4中所列出的探針和引子對於放大和檢測HCV-C9和相關的變異體是特別有效的，而日本、美國HCV原型體除外。
KY 84(SEQ ID NO.8)，KY 85(SEQ ID NO.9)，KY 148(SEQ OD NO.17)和KY 87(SEQ ID NO.14)是對於放大日本和美國HCV原型體特別有效，而對HCV-C9則例外的引子的例證。用於放大日本，美國和C9HCV原型體的引子包括KY 67(SEQID NO.10)，KY 78(SEQ ID NO.18)，KY 80(SEQ ID NO.5)，KY81(SEQ ID NO.11)，KY 83(SEQ ID NO.7)，KY 86(SEQ IDNO.13)，KY 88(SEQ ID NO.12)，KY 95(SEQ ID NO.20)，KY100(SEQ ID NO.21)，KY 144(SEQ ID NO.6)，KY 145(SEQ IDNO.19)和KY 153(SEQ ID NO.15)。引子KY 65(SEQ ID NO.1)，KY 68(SEQ ID NO.27)，KY 98(SEQ ID NO.3)，KY 99(SEQ IDNO.26)，KY 109(SEQ ID NO.24)，KY 111(SEQ ID NO.25)和KY 149(SEQ ID NO.16)適於放大日本和美國HCV原型體和相關的變異分離體並也可適用於檢測HCV-C9及相關的同型體。
KY 67(SEQ ID NO.10)，KY 78(SEQ ID NO.18)，KY 81(SEQ ID NO.11)，KY 86(SEQ ID NO.13)，KY 95(SEQ ID NO.20)，KY 150(SEQ ID NO.43)和KY 145(SEQ ID NO.19)被證明是檢測日本、美國和C9HCV原型體和相關的變異體的探針。用於檢測日本和美國HCV原型體和相關的變異體而不能檢測HCV-C9原型體的探針包括KY 83(SEQ ID NO.7)，KY 87(SEQ ID NO.14)，KY 84(SEQ ID NO.8)，KY 88(SEQ ID NO.12)，KY 85(SEQ ID NO.9)，KY 100(SEQ ID NO.21)，KY 148(SEQ ID NO.17)和KY 149(SEQ ID NO.16)。探針KY 65(SEQ ID NO.1)，KY 68(SEQ ID NO.27)，KY 82(SEQ ID NO.28)，KY 99(SEQ IDNO.26)，KY 109(SEQ ID NO.24)，KY 111(SEQ ID NO.25)，KY80(SEQ ID NO.5)，KY 144(SEQ ID NO.6)和KY 153(SEQ IDNO.15)適於檢測日本和美國HCV原型體和相關的變異分離體並且可以同時適用於檢測HCV-C9和相關的變異體。
實例6在有UNG存在的情況下，HCV RNA的同種RT/PCR放大是一種優選的方法。實例1中所說的同質RT/PCR放大方法被修改成包括一個消毒步驟。下述原始記錄表明，RT和PCR反應包含了dUTP。消毒是在RT步驟之前，在50℃下進行的。在被提高了的RT-PCR反應溫度下，UNG是沒有活性的，且含dU的產物不會被降解。兩個單位的UNG(Perkin Elmer)成功地對100μl用10,000個HCV RNA複製體構成的放大液中相當於0.25μl的攜帶體進行了消滅。更高劑量的UNG，例如，達到每100μl反應液6個單位，仍是適宜的。
反應混合物成分按以下順序加入μl/RX50％甘油16.0016.0010X RT Rxn.緩衝劑(100mM Tris-HCl(pH8.3)，900mM HCl) 10.00dGTP(10mM)；200μM終值 2.00dATP(10mM)；200μM終值 2.00dUTP(20mM)；200μM終值 1.00dCTP(10mM)；200μM終值 2.00
KY80(SEQ ID NO.5)在15μM(15pmoles each/rxn終值)；(+)生物素基化了的鏈引子 1.00KY78(SEQ ID NO.18)在15μM(15pmoles each/rxn終值；生物素基(-)鏈，RT引子 1.00UNG1單位/μl 2.00rTth DNA聚合酶在1X酶存貯緩衝劑*中2.5U/μl4.00MnCl2(10mM)；0.9mM終值 9.00每支試管的Master Mix50.00RNA(連同在H2O中的載體基底**)50.00反應劑總體積100.00*1X酶存貯緩衝劑＝(20mM Tris-HCl[pH7.5]，100 mMHCl，0.1 mM EDTA，1 mN DTT，0.5％TweenTM20[Pierce Surfactamps]，50％甘油[v/v]。
**1毫克來自Pharmacia的聚rA均聚合RNA(No.27-聚合tA具有平均值8.8(範圍在6-13)的S20，W或在降溫下的一些非特定產物)是在每份反應劑低於200ng的輸入值下使用的。牛胸腺DNA，PBLDNA，人胎盤DNA和來自細胞系K562的DNA均已檢測過且其效果相同。
步驟1.打開TC9600熱循環控制器，預熱表層。
2.在室溫下製備反應混合液。
3.將試管放入熱循環控制器，按下「RUN」重新啟動熱循環控制器。
4.在文件(file)8處啟動機器。
5.建議的熱循環控制器條件為文件1保持 2分鐘， 50℃(UNG消毒步驟)文件2保持 15分鐘，70℃(反轉錄步驟)文件3保持 1分鐘， 95℃文件4兩種溫度的PCR95℃，15秒和60℃10-30秒兩個循環文件5兩種溫度PCR90℃15秒和60℃10-30秒38個循環文件6保持 72℃1小時文件7保持 15℃不限定文件8連接文件1，2，3，4，5，6，和7在第五步文件2中，15分鐘的反應時間可以降低到5分鐘，而不會降低反應效率。在第五步文件5中，對於高G+C模板，可以優選地提高變性溫度到95℃。用微滴定盤測定方式分析反應產物，通常導致在陽性樣品情況下大於0.8的吸收率值，和對陰性樣品情況下≤0.5的吸收率值。
權利要求
1.一種檢測在懷疑含有C型肝炎病毒核酸的樣品中的C型肝炎病毒核酸存在的方法，該方法包括(a)將在樣品中的核酸與一種寡核苷酸探針相接觸，該寡核苷酸探針包括一個其長度至少為14個核苷酸的核酸苷序列，而且該寡核苷酸探針特異地適合於檢測C9同型族系的一種HCV，而且其中所說的核酸序列包含於選自以下序列及其互補序列的一個序列中或者由選自以下的序列及其互補序列的一個序列所組成SEQ ID NO.29，SEQ ID NO.30，SEQ ID NO.31，SEQ ID NO.32，和SEQID NO.33，以及(b)檢測在C型肝炎病毒核酸和該探針之間形成的穩定雜種。
2.根據權利要求1的方法，其中所說的核酸序列包含於由下列序列及其互補序列中選出的一個序列中或者由選自下列序列的及其互補序列的一個序列所組成SEQ ID NO.38，SEQ ID NO.39，SEQ ID NO.40，SEQ ID NO.41和SEQID NO.42。
3.根據權利要求1或2的方法，該方法還包括在步驟(a)之前在能夠放大在樣品中的HCV核酸的條件下處理該樣品的步驟，從而該放大作用是應用聚合酶鏈反應來完成的。
4.一种放大來自C型肝炎病毒(HCV)族系的C型肝炎病毒(HCV)核酸的方法，該C型肝炎病毒(HCV)族系來自在樣品中懷疑含有該病毒核酸的C9同型族系，該方法包括(a)將其長度至少為14個核苷酸並適合於放大來自C型肝炎病毒(HCV)的一種族系的C型肝炎病毒(HCV)核酸的寡核苷酸引物與在該樣品中的核酸相接觸，該C型肝炎病毒(HCV)族系來自C9同型族系的一種C型肝炎病毒(HCV)的族系，以及其中所說的核酸序列包含於由下列序列及其互補序列中選出的一個序列中或者由選自下列序列及其互補序列的一個序列所組成SEQ ID NO.29，SEQ ID NO.30，SEQ ID NO.31，SEQ ID NO.32和SEQID NO.33；(b)用核酸聚合酶延長該引物；以及(c)重複步驟(a)和(b)直至得到可檢測到的數目的C型肝炎病毒核酸的複製品。
5.根據權利要求4的方法，其中該寡核苷酸引物適宜於放大來自C9同型族系的C型肝炎病毒(HCV)的一種族系的C型肝炎病毒(HCV)核酸，而所說的核酸序列包含於由下列序列及其互補序列中選出的一個序列中或者由選自下列序列及其互補序列的一個序列所組成SEQ ID NO.38，SEQ ID NO.39，SEQ ID NO.40，SEQ ID NO.41，和SEQID NO.42。
6.用於檢測C型肝炎病毒核酸的一套試劑盒，其特徵在於該試劑盒包括一隔層，在該隔層中包含權利要求1至3的任一項權利要求所限定的一種寡核苷酸探針。
7.用於檢測C型肝炎病毒核酸的一套試劑盒，其特徵在於該試劑盒包括一隔層，在該隔層中包含權利要求4至5的任一項權利要求所限定的一種寡核苷酸引物。
全文摘要
本發明為放大和檢測HCV－C同型核酸提供了試劑,方法和一套試劑盒,在包括病毒基因組DNA反轉錄生成cDNA以及隨後的利用聚合酶鏈反應放大cDNA的過程中。低核苷酸引子可被用來放大和檢測C肝病毒核酸。通過雜合作用,低核苷酸探針可被用於檢測放大後的DNA的存在。
文檔編號C12N7/00GK1259670SQ9812379
公開日2000年7月12日 申請日期1998年10月31日 優先權日1991年8月27日
發明者R·M·雷斯尼克, K·K·Y·楊 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司