抑制整合素α5的物質在製備預防內皮細胞激活和/或動脈粥樣硬化的產品中的新用途的製作方法與工藝

2023-10-06 03:52:54

本發明屬於生物技術領域，具體涉及抑制整合素α5的物質在製備預防內皮細胞激活和/或動脈粥樣硬化的產品中的新用途。

背景技術：
動脈粥樣硬化是嚴重威脅人類身體健康的疾病，常常引起心梗、腦梗等嚴重併發症。目前的研究公認，血管內皮細胞激活，功能障礙是動脈粥樣硬化發病的起始步驟。因此，探討內皮激活的機制並進行幹預，對預防動脈粥樣硬化有著非常重要的意義。血管內皮是循環血液與血管壁之間的重要屏障，參與調節血管內外物質交換，合成釋放血管活性物質，調節凝血和血管平滑肌的舒縮等。最重要的，血管內皮直接感受來自血流的機械作用力的影響，亦即血流剪切力，其在動脈粥樣硬化發病中有著舉足輕重的作用。臨床資料表明，在同一患者中，血管系統經受著相同的血脂、血壓、血糖等其他條件，但是動脈粥樣硬化斑塊好發於血管的拐彎以及分叉處。決定斑塊的這種特徵性分布的因素就是血流剪切力。剪切力對血管功能的影響較為複雜，目前已有研究認為主要決定因素包括剪切力的大小和剪切力的方向。在整個血管系統中，血管直部感受層流，其主要特徵呈方向一致的高剪切力，對內皮細胞具有抗炎、抗凋亡、上調內皮細胞保護性基因表達的作用，從而發揮對內皮的保護作用，具有抗動脈粥樣硬化的特點；而血管的拐彎和分叉處則感受紊亂的流體形式，在體外通常用湍流(紊流的一種形式)來模擬，其主要特徵呈方向不定的低剪切力，能上調內皮細胞中炎症基因如細胞間粘附分子1(ICAM-1)、血管細胞粘附分子(VCAM-1)的表達、促進內皮細胞氧自由基的產生、加速內皮細胞更迭，從而激活內皮細胞，使內皮細胞具有易感性，能夠促進動脈粥樣硬化的發生。脂筏(Lipidraft)，是內皮細胞膜上特殊的結構域，其具有富含鞘磷脂和膽固醇的特點，結構緻密，是蛋白質停泊的平臺，與膜的信號轉導及蛋白質分選有密切關係。參與感受流體剪切力的刺激，幫助進行機械信號的轉導。內皮細胞中整合素表達含量豐富，參與細胞內外信號的轉導，介導細胞與細胞外基質間的相互調節。有報導認為激活的整合素在機械信號轉導中發揮著重要作用。而正常血管中，整合素α5主要分布於血管內皮中，是內皮細胞較為重要的整合素受體。已有報導認為其分別在內皮細胞和巨噬細胞中介導NF-κB、炎症小體的激活，從而發揮促炎反應。

技術實現要素：
本發明的目的是提供抑制整合素α5的物質在製備預防內皮細胞激活和/或動脈粥樣硬化的產品中的新用途。本發明還保護與整合素α5結合從而抑制所述整合素α5的活性的物質在製備產品中的應用；所述產品的用途為如下(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(f)中的至少一種：(a)預防和/或治療動脈粥樣硬化；(b)抑制湍流的如下作用：促使血管內皮細胞中激活狀態的整合素α5的含量增加；(c)抑制湍流的如下作用：促進血管內皮細胞與THP-1細胞的粘附作用；(d)抑制湍流的如下作用：促進血管內皮細胞中的炎症小體激活；(e)抑制湍流的如下作用：促進血管內皮細胞中的Caspase-1p20和IL-1βp17增加；(f)抑制湍流的如下作用：促進血管內皮細胞中的VCAM-1和/或ICAM-1增加。所述整合素α5具體可為序列表的序列1所示的蛋白質或序列表的序列3所示的蛋白質。所述「與整合素α5結合從而抑制所述整合素α5的活性的物質」具體可為所述整合素α5的抗體，例如購自美國Abcam公司，貨號為ab72663的整合素α5的特異性中合抗體(特異結合激活狀態的整合素α5)。本發明保護一種產品，其活性成分為與整合素α5結合從而抑制所述整合素α5的活性的物質；所述產品的用途為如下(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(f)中的至少一種：(a)預防和/或治療動脈粥樣硬化；(b)抑制湍流的如下作用：促使血管內皮細胞中激活狀態的整合素α5的含量增加；(c)抑制湍流的如下作用：促進血管內皮細胞與THP-1細胞的粘附作用；(d)抑制湍流的如下作用：促進血管內皮細胞中的炎症小體激活；(e)抑制湍流的如下作用：促進血管內皮細胞中的Caspase-1p20和IL-1βp17增加；(f)抑制湍流的如下作用：促進血管內皮細胞中的VCAM-1和/或ICAM-1增加。所述整合素α5具體可為序列表的序列1所示的蛋白質或序列表的序列3所示的蛋白質。所述「與整合素α5結合從而抑制所述整合素α5的活性的物質」具體可為所述整合素α5的抗體，例如購自美國Abcam公司，貨號為ab72663的整合素α5的特異性中合抗體(特異結合激活狀態的整合素α5)。所述產品可以進行局部或全身給藥，給藥方式可為口服或注射。同時可以全身服用降低膽固醇的製劑以幹預脂筏結構，增加產品療效。本發明還保護抑制整合素α5的編碼基因表達的物質在製備產品中的應用；所述產品的用途為如下(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(f)中的至少一種：(a)預防和/或治療動脈粥樣硬化；(b)抑制湍流的如下作用：促使血管內皮細胞中激活狀態的整合素α5的含量增加；(c)抑制湍流的如下作用：促進血管內皮細胞與THP-1細胞的粘附作用；(d)抑制湍流的如下作用：促進血管內皮細胞中的炎症小體激活；(e)抑制湍流的如下作用：促進血管內皮細胞中的Caspase-1p20和IL-1βp17增加；(f)抑制湍流的如下作用：促進血管內皮細胞中的VCAM-1和/或ICAM-1增加。所述整合素α5具體可為序列表的序列1所示的蛋白質或序列表的序列3所示的蛋白質。所述整合素α5的編碼基因具體可為序列表的序列2所示的DNA分子或序列表的序列4自5』末端第223-3384位核苷酸所示的DNA分子。所述抑制整合素α5的編碼基因表達的物質具體可為序列表的序列6所示的siRNA、編碼序列表的序列6所示的siRNA的DNA分子或具有編碼序列表的序列6所示的siRNA的DNA分子的重組載體。所述編碼序列表的序列6所示的siRNA的DNA分子包括如下兩個元件：序列表的序列5自5』末端第1-21位核苷酸和序列表的序列5自5』末端第28-48位核苷酸。所述編碼序列表的序列6所示的siRNA的DNA分子具體可如序列表的序列5所示。所述「具有編碼序列表的序列6所示的siRNA的DNA分子的重組載體」具體可為重組腺病毒質粒或重組腺病毒。所述重組腺病毒質粒具體可為如下重組質粒：(1)將序列表的序列5所示的DNA分子插入pYr-1.1載體的BsaI酶切位點，得到中間質粒；(2)使所述中間質粒甲與腺病毒骨架載體pAd/BL-DEST發生LR重組，得到具有序列5所示雙鏈DNA分子和wtAd5(ΔE3)的基因組DNA的腺病毒質粒，即為重組腺病毒質粒。所述重組腺病毒具體可為將所述重組腺病毒質粒線性化後轉染哺乳動物細胞，然後收集細胞並破碎，收集上清液即為含有所述重組腺病毒的病毒液。所述重組腺病毒的製備方法具體如下：取所述重組腺病毒質粒，用限制性內切酶PacI進行線性化，然後轉染HEK293細胞，當細胞有CPE現象且有>50％脫壁時收集細胞，1500g離心5min並收集細胞，然後在乾冰浴及37℃水浴之間快速反覆凍融三次，1000g離心15min，收集上清液，即為含有所述重組腺病毒的病毒液。本發明還保護一種產品，其活性成分為抑制整合素α5的編碼基因表達的物質；所述產品的用途為如下(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(f)中的至少一種：(a)預防和/或治療動脈粥樣硬化；(b)抑制湍流的如下作用：促使血管內皮細胞中激活狀態的整合素α5的含量增加；(c)抑制湍流的如下作用：促進血管內皮細胞與THP-1細胞的粘附作用；(d)抑制湍流的如下作用：促進血管內皮細胞中的炎症小體激活；(e)抑制湍流的如下作用：促進血管內皮細胞中的Caspase-1p20和IL-1βp17增加；(f)抑制湍流的如下作用：促進血管內皮細胞中的VCAM-1和/或ICAM-1增加。所述產品可以進行局部或全身給藥，給藥方式可為口服或注射。同時可以全身服用降低膽固醇的製劑以幹預脂筏結構，增加產品療效。所述整合素α5具體可為序列表的序列1所示的蛋白質或序列表的序列3所示的蛋白質。所述整合素α5的編碼基因具體可為序列表的序列2所示的DNA分子或序列表的序列4自5』末端第223-3384位核苷酸所示的DNA分子。所述抑制整合素α5的編碼基因表達的物質具體可為序列表的序列6所示的siRNA、編碼序列表的序列6所示的siRNA的DNA分子或具有編碼序列表的序列6所示的siRNA的DNA分子的重組載體。所述編碼序列表的序列6所示的siRNA的DNA分子包括如下兩個元件：序列表的序列5自5』末端第1-21位核苷酸和序列表的序列5自5』末端第28-48位核苷酸。所述編碼序列表的序列6所示的siRNA的DNA分子具體可如序列表的序列5所示。所述「具有編碼序列表的序列6所示的siRNA的DNA分子的重組載體」具體可為重組腺病毒質粒或重組腺病毒。所述重組腺病毒質粒具體可為如下重組質粒：(1)將序列表的序列5所示的DNA分子插入pYr-1.1載體的BsaI酶切位點，得到中間質粒；(2)使所述中間質粒甲與腺病毒骨架載體pAd/BL-DEST發生LR重組，得到具有序列5所示雙鏈DNA分子和wtAd5(ΔE3)的基因組DNA的腺病毒質粒，即為重組腺病毒質粒。所述重組腺病毒具體可為將所述重組腺病毒質粒線性化後轉染哺乳動物細胞，然後收集細胞並破碎，收集上清液即為含有所述重組腺病毒的病毒液。所述重組腺病毒的製備方法具體如下：取所述重組腺病毒質粒，用限制性內切酶PacI進行線性化，然後轉染HEK293細胞，當細胞有CPE現象且有>50％脫壁時收集細胞，1500g離心5min並收集細胞，然後在乾冰浴及37℃水浴之間快速反覆凍融三次，1000g離心15min，收集上清液，即為含有所述重組腺病毒的病毒液。本發明還保護序列表的序列6所示的siRNA。本發明對於動脈粥樣硬化的治療和預防具有重大價值。附圖說明圖1為血流剪切力對原代培養的內皮細胞中整合素α5(Integrinα5)脂筏轉位的調節。圖2為血流剪切力對原代培養的內皮細胞中整合素α5(Integrinα5)活性的調節。圖3為實施例2的步驟一的2的結果。圖4為實施例2的步驟一的3的結果。圖5為實施例2的步驟二的結果。圖6為實施例2的步驟三的結果。圖7為實施例2的步驟三的結果。圖8為實施例3的結果。具體實施方式以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重複實驗，結果取平均值。實施例中的檢測中，所採用的二抗均購自CellSignaling公司，兔源二抗的貨號為7074s，鼠源二抗的貨號為7076s。基於人的整合素α5基因見序列表的序列2，編碼序列表的序列1所示的蛋白質。實施例1、相關機理的發現發明人通過對內皮細胞進行層流和湍流兩種剪切力刺激後，利用定量蛋白質組學結合生物信息學分析比較內皮細胞表面脂筏相關蛋白質的變化，來探究介導兩種剪切力不同作用的分子和機制。其中，在兩種剪切力處理後，挑選出具有統計學差異的蛋白，其中最為顯著的是整合素α5(Integrinα5)，在利用分子生物學技術對蛋白質組學數據進行驗證後，發明人對其功能和發揮作用的機制進行了進一步探討。發明人的研究結果首次發現，在湍流的作用下，整合素α5向脂筏轉位(即在血管內皮組織中的整合素α5向脂筏富集；脂筏中的整合素α5的存在形式為激活狀態的整合素α5)，脂筏幫助其功能上進行激活，從而激活炎症小體，釋放炎症因子IL-1β，上調內皮細胞表面的粘附分子ICAM-1(細胞間粘附分子)、VCAM-1(血管細胞粘附分子)，從而增加內皮細胞表面的炎症細胞的粘附，造成動脈粥樣硬化的啟動。而相反，在層流的作用下，整合素α5從脂筏中轉位出來(即在血管內皮組織中的整合素α5向非脂筏富集；非脂筏中的整合素α5的存在形式為非激活狀態的整合素α5)，激活被下調，抑制其介導的炎症反應。因此，在全身或者湍流作用的血管局部對整合素α5或者決定其功能激活的脂筏進行幹預，對於局部內皮細胞激活及斑塊產生可能具有保護作用。圖1為血流剪切力對原代培養的內皮細胞中整合素α5(Integrinα5)脂筏轉位的調節；A為湍流(OSS)引起整合素α5(α5)由非脂筏(Non-raft)轉位向脂筏(Raft)，B為層流(LSS)引起整合素α5(α5)由脂筏(Raft)轉位向非脂筏(Non-raft)。圖2為血流剪切力對原代培養的內皮細胞中整合素α5(Integrinα5)活性的調節；A為湍流(OSS)引起整合素α5(α5)隨時間逐漸激活，B為層流(LSS)引起整合素α5(α5)活性被抑制。實施例2、細胞實驗整合素α5的特異性中合抗體(特異結合激活狀態的整合素α5)；購自美國Abcam公司，貨號為ab72663。β-環狀糊精(β-cyclodextrin簡稱β-CD)：Sigma公司，貨號H107。Caspase-1抑制劑：Biovision公司，貨號A1902。THP-1細胞(人單核細胞型淋巴瘤)：ATCC編號TIB-202。用螢光標記物(BCECF-AM,Invitrogen)對THP-1細胞進行標記後，得到標記後的THP-1細胞。用離體的人臍帶製備人血管內皮細胞：製備方法見參考文獻：ZhuY,LinJH,LiaoHL,FriedliO,Jr.,VernaL,MartenNW,StrausDS,StemermanMB.Ldlinducestranscriptionfactoractivatorprotein-1inhumanendothelialcells.Arteriosclerosis,thrombosis,andvascularbiology.1998；18:473-480。一、整合素α5的特異性中合抗體的作用效果(westernblot檢測)1、分組處理在37℃、5％CO2培養箱中進行，平時採用含15％(體積比)FBS的M199培養基，處理前4小時(處理包括給藥處理和剪切力處理，當某一組同時包括給藥處理和剪切力處理時，以在前處理的時間點計)更換為含2％(體積比)FBS的M199培養基：第一組(ctrl)：取100cm細胞培養皿，在每個皿內放置一個無菌玻璃片，在無菌玻璃片上接種人血管內皮細胞培養35小時；第二組(OSS)：取100cm細胞培養皿，在每個皿內放置一個無菌玻璃片，在無菌玻璃片上接種人血管內皮細胞，培養25小時，然後取出無菌玻璃片，對無菌玻璃片上附著的細胞進行流體剪切力刺激(湍流，0.5±4dyn/cm2，10小時)；第三組(OSS+Ab)：取100cm細胞培養皿，在每個皿內放置一個無菌玻璃片，在無菌玻璃片上接種人血管內皮細胞，培養24小時(此時細胞長滿玻璃片，約3×106個細胞)，然後每皿加入整合素α5的特異性中合抗體並使其濃度為5μg/ml，培養1小時，然後取出無菌玻璃片，對無菌玻璃片上附著的的細胞進行流體剪切力刺激(湍流，0.5±4dyn/cm2，10小時)；第四組(OSS+Ab)：取100cm細胞培養皿，在每個皿內放置一個無菌玻璃片，在無菌玻璃片上接種人血管內皮細胞，培養24小時(此時細胞長滿玻璃片，約3×106個細胞)，然後每皿加入整合素α5的特異性中合抗體並使其濃度為10μg/ml，培養1小時，然後取出無菌玻璃片，對無菌玻璃片上附著的的細胞進行流體剪切力刺激(湍流，0.5±4dyn/cm2，10小時)。2、westernblot檢測激活狀態的整合素α5、Caspase-1p20和IL-1βp17Caspase-1p20為pro-Caspase-1的活性形式，IL-1βp17為pro-IL-1β的活性形式。Caspase-1p20和IL-1βp17含量增高代表炎症小體激活。完成步驟1的分組處理後，分別提取細胞膜總蛋白和全細胞總蛋白。westernblot檢測細胞膜總蛋白中激活狀態的整合素α5的含量(採用的一抗為兔源integrinα5antibody，購自CellSignaling公司，貨號4705)，採用Flot2作為內參蛋白(檢測內參蛋白的一抗為兔源flotillin-2antibody，購自SantaCruz公司，貨號sc-28320)。westernblot檢測全細胞總蛋白中pro-Caspase-1和Caspase-1p20的含量(採用的一抗為兔源Caspase-1antibody，購自CellSignaling公司，貨號3866)、pro-IL-1β和IL-1βp17的含量(鼠源IL-1βantibody，購自CellSignaling公司，貨號12242)，採用β-actin作為內參蛋白(檢測內參蛋白的一抗為鼠源β-actinantibody，購自SantaCruz公司，貨號sc-81178)。結果見圖3。第一組和第二組的細胞膜總蛋白中，激活狀態的整合素α5含量在OSS的處理下被上調。整合素α5的特異性中合抗體通過與整合素α5結合降低了激活狀態的整合素α5含量，且特異性抗體加入量越多激活狀態的整合素α5含量越低，呈現劑量效應。與第一組相比第二組的全細胞總蛋白中Caspase-1p20和IL-1βp17含量增加，即OSS促使炎症小體激活，加入整合素α5的特異性中合抗體後，Caspase-1p20和IL-1βp17含量相對第二組降低，且同樣呈現劑量效應。結果表明：湍流(OSS)引起炎症小體激活，IL-1β釋放增加，整合素α5的特異性中合抗體能夠阻斷OSS的效應。3、westernblot檢測VCAM-1和ICAM-1完成步驟1的分組處理後，提取全細胞總蛋白。westernblot檢測全細胞總蛋白中VCAM-1的含量(採用的一抗為兔源VCAM-1antibody，購自CellSignaling公司，貨號12367)和ICAM-1的含量(採用的一抗為鼠源ICAM-1antibody，購自BD公司，貨號611704)，採用β-actin作為內參蛋白(檢測內參蛋白的一抗為鼠源β-actinantibody，購自SantaCruz公司，貨號sc-81178)。結果見圖4。與第一組相比第二組的全細胞總蛋白中VCAM-1和ICAM-1含量增加，加入整合素α5的特異性中合抗體後，VCAM-1和ICAM-1含量相對第二組降低，且同樣呈現劑量效應。結果表明：湍流(OSS)引起人血管內皮細胞表面粘附分子ICAM-1、VCAM-1表達增加，阻斷整合素α5能夠阻斷湍流的效應。二、整合素α5的特異性中合抗體的作用效果(THP-1細胞與人血管內皮細胞粘附實驗)在37℃、5％CO2培養箱中進行，平時採用含15％(體積比)FBS的M199培養基，處理前4小時(處理包括給藥處理和剪切力處理，當某一組同時包括給藥處理和剪切力處理時，以在前處理的時間點計)更換為含2％(體積比)FBS的M199培養基：第一組(ctrl)：取6孔板，在每個孔內放置一個無菌蓋玻片，在無菌蓋玻片上接種人血管內皮細胞，培養35小時，然後每孔加入2×106個標記後的THP-1細胞，37℃孵育30分鐘，然後用PBS緩衝液洗滌以除去未被粘附的THP-1細胞，用螢光顯微鏡觀察；第二組(α5Ab)：取6孔板，在每個孔內放置一個無菌蓋玻片，在無菌蓋玻片上接種人血管內皮細胞，培養24小時(此時細胞長滿玻璃片，約1.2×106個細胞)，然後每孔加入整合素α5的特異性中合抗體並使其濃度為10μg/ml，培養1小時，然後更換為新的培養基並培養10小時，然後每孔加入2×106個標記後的THP-1細胞，37℃孵育30分鐘，然後用PBS緩衝液洗滌以除去未被粘附的THP-1細胞，用螢光顯微鏡觀察；第三組(OSS)：取6孔板，在每個孔內放置一個無菌蓋玻片，在無菌蓋玻片上接種人血管內皮細胞，培養25小時，取出無菌蓋玻片，對無菌蓋玻片上附著的的細胞進行流體剪切力刺激(湍流，0.5±4dyn/cm2，刺激10小時)，然後將每個無菌蓋玻片放入新的6孔板的每個孔中，然後每孔加入2×106個標記後的THP-1細胞，37℃孵育30分鐘，然後用PBS緩衝液洗滌以除去未被粘附的THP-1細胞，用螢光顯微鏡觀察；第四組(OSS+α5Ab)：取6孔板，在每個孔內放置一個無菌蓋玻片，在無菌蓋玻片上接種人血管內皮細胞，培養24小時(此時細胞長滿玻璃片，約1.2×106個細胞)，然後每孔加入整合素α5的特異性中合抗體並使其濃度為10μg/ml，培養1小時，取出無菌蓋玻片，對無菌蓋玻片上附著的的細胞進行流體剪切力刺激(湍流，0.5±4dyn/cm2，刺激10小時)，然後將每個無菌蓋玻片放入新的6孔板的每個孔中，然後每孔加入2×106個標記後的THP-1細胞，37℃孵育30分鐘，然後用PBS緩衝液洗滌以除去未被粘附的THP-1細胞，用螢光顯微鏡觀察。結果見圖5。湍流(OSS)引起THP-1細胞與內皮細胞之間的粘附增加，加入整合素α5的特異性中合抗體可以抵抗OSS引起的粘附增加，即阻斷整合素α5能夠阻斷湍流的效應。三、環糊精的作用效果(westernblot檢測)在37℃、5％CO2培養箱中進行，平時採用含15％(體積比)FBS的M199培養基，處理前4小時(處理包括給藥處理和剪切力處理，當某一組同時包括給藥處理和剪切力處理時，以在前處理的時間點計)更換為含2％(體積比)FBS的M199培養基：第一組(ctrl)：取100mm培養皿，每個皿內置一個無菌玻璃片，在無菌玻璃片上接種人血管內皮細胞，培養36小時，取樣(提取全細胞總蛋白，westernblot檢測全細胞總蛋白中VCAM-1的含量和ICAM-1的含量)；第二組(β-CD)：取100mm培養皿，每個皿內置一個無菌玻璃片，在無菌玻璃片上接種人血管內皮細胞，培養24小時(此時細胞長滿玻璃片，約3×106個細胞)，然後每皿加入β-CD並使其濃度為5mmol/L，培養2小時，然後更換新的培養基並培養10小時，取樣(提取全細胞總蛋白，westernblot檢測全細胞總蛋白中VCAM-1的含量和ICAM-1的含量)；第三組(OSS)：取100mm培養皿，每個皿內放置一個無菌玻璃片，在無菌玻璃片上接種人血管內皮細胞，培養26小時，取出無菌玻璃片，對無菌玻璃片上附著的細胞進行流體剪切力刺激(湍流，0.5±4dyn/cm2，刺激10小時)，取樣(提取全細胞總蛋白，westernblot檢測全細胞總蛋白中VCAM-1的含量和ICAM-1的含量)；第四組(OSS+β-CD)：取6孔板，在每個孔內放置一個無菌玻璃片，在無菌玻璃片上接種人血管內皮細胞，培養24小時(此時細胞長滿玻璃片，約3×106個細胞)，然後每皿加入β-CD並使其濃度為5mmol/L，培養2小時，然後更換新的培養基並培養2小時，取出無菌玻璃片，對無菌玻璃片以及其上附著的的細胞進行流體剪切力刺激(湍流，0.5±4dyn/cm2，刺激10小時)，取樣(提取全細胞總蛋白，westernblot檢測全細胞總蛋白中VCAM-1的含量和ICAM-1的含量)。westernblot檢測方法見步驟一的3。結果見圖6。四、環糊精的作用效果(THP-1細胞與人血管內皮細胞粘附實驗)在37℃、5％CO2培養箱中進行，平時採用含15％(體積比)FBS的M199培養基，處理前4小時(處理包括給藥處理和剪切力處理，當某一組同時包括給藥處理和剪切力處理時，以在前處理的時間點計)更換為含2％(體積比)FBS的M199培養基：第一組(ctrl)：取6孔板，在每個孔內放置一個無菌蓋玻片，在無菌蓋玻片上接種人血管內皮細胞，培養36小時，然後每孔加入2×106個標記後的THP-1細胞，37℃孵育30分鐘，然後用PBS緩衝液洗滌以除去未被粘附的THP-1細胞，用螢光顯微鏡觀察；；第二組(β-CD)：取6孔板，在每個孔內放置一個無菌蓋玻片，在無菌蓋玻片上接種人血管內皮細胞，培養24小時(此時細胞長滿玻璃片，約1.2×106個細胞)，然後每孔加入β-CD並使其濃度為5mmol/L，培養2小時，然後更換為新的培養基並培養10小時，然後每孔加入2×106個標記後的THP-1細胞，37℃孵育30分鐘，然後用PBS緩衝液洗滌以除去未被粘附的THP-1細胞，用螢光顯微鏡觀察；第三組(OSS)：取6孔板，在每個孔內放置一個無菌蓋玻片，在無菌蓋玻片上接種人血管內皮細胞，培養26小時，取出無菌蓋玻片，對無菌蓋玻片上附著的的細胞進行流體剪切力刺激(湍流，0.5±4dyn/cm2，刺激10小時)，然後將每個無菌蓋玻片放入新的6孔板的每個孔中，然後每孔加入2×106個標記後的THP-1細胞，37℃孵育30分鐘，然後用PBS緩衝液洗滌以除去未被粘附的THP-1細胞，用螢光顯微鏡觀察；第四組(OSS+β-CD)：取6孔板，在每個孔內放置一個無菌蓋玻片，在無菌蓋玻片上接種人血管內皮細胞，培養24小時(此時細胞長滿玻璃片，約1.2×106個細胞)，然後每孔加入β-CD並使其濃度為5mmol/L，培養2小時，取出無菌蓋玻片，對無菌蓋玻片上附著的的細胞進行流體剪切力刺激(湍流，0.5±4dyn/cm2，刺激10小時)，然後將每個無菌蓋玻片放入新的6孔板的每個孔中，然後每孔加入2×106個標記後的THP-1細胞，37℃孵育30分鐘，然後用PBS緩衝液洗滌以除去未被粘附的THP-1細胞，用螢光顯微鏡觀察。結果見圖7。圖6和圖7的結果表明，湍流(OSS)引起內皮細胞表面粘附分子ICAM-1、VCAM-1表達增加，單核細胞與內皮細胞之間的粘附增加，通過β-環狀糊精破壞脂筏能夠阻斷湍流的效應。實施例3、在體實驗腺病毒骨架載體pAd/BL-DEST：購自長沙贏潤生物技術有限公司。GFP腺病毒質粒rAd-NC-shRNA：購自長沙贏潤生物技術有限公司，貨號rAdNC03。LDLR-/-小鼠(種系名稱：B6.129S7-Ldlrtm1Her/J)：購自美國TheJacksonLaboratory公司，產品儲存號002207。HEK293細胞：ATCC編號CRL-1573。pYr-1.1載體(全稱為pYr-1.1-hU6-EGFP)：長沙贏潤生物技術有限公司，貨號VRY0359。一、製備重組腺病毒1、基於小鼠的整合素α5基因(又稱ITGA5基因，見序列表的序列4，序列4自5』末端第223-3384位核苷酸為開放閱讀框；編碼序列表的序列3所示的蛋白質)，設計1個RNAi靶點(靶點為序列4自5』末端第948-968位核苷酸)。2、基於步驟1選擇的靶點，設計併合成一個雙鏈DNA分子，如序列表的序列5所示。序列5：5』-GCAGATCTCGGAGTCCTATTACTCGAGTAATAGGACTCCGAGATCTGCTTTTTT-3』。序列表的序列5所示的DNA編碼序列表的序列6所示的siRNA。序列6：5』-GCAGAUCUCGGAGUCCUAUUA-3』。3、將步驟二合成的DNA分子插入pYr-1.1載體的BsaI酶切位點，得到中間質粒。4、使步驟3得到的中間質粒甲與腺病毒骨架載體pAd/BL-DEST發生LR重組，得到具有序列5所示雙鏈DNA分子和wtAd5(ΔE3)的基因組DNA的腺病毒質粒。5、製備病毒液將步驟4得到的腺病毒質粒用限制性內切酶PacI進行線性化，然後將6微克線性化的質粒轉染1.5×106個HEK293細胞，在37℃、5％CO2條件下培養，當細胞有明顯的CPE現象且有>50％脫壁時收集細胞，1500g離心5min並收集細胞，然後在乾冰浴及37℃水浴之間快速反覆凍融三次，1000g離心15min，收集上清液，即為病毒液甲。用GFP腺病毒質粒rAd-NC-shRNA代替腺病毒質粒甲進行上述操作，得到病毒液乙。6、小鼠實驗取LDLR-/-小鼠，對左頸總動脈分支中頸內動脈、枕動脈進行結紮，在距離頸內動脈分叉處1.5cm左右用動脈夾夾閉左頸總動脈近心端，同時夾閉甲狀腺上動脈，在頸外動脈剪開小切口，放出頸總動脈夾閉段的殘留血液，用32G胰島素注射器吸取冰浴的病毒液經切口插入並注射5×108pfu重組腺病毒，孵育40分鐘，孵育完成後吸出腺病毒，並快速短暫鬆開近心端止血夾衝洗殘留腺病毒，之後結紮頸外動脈切口近心端，鬆開全部動脈夾，縫合切口。完成手術後，小鼠進行連續一周的高脂餵養(高脂飼料購自美國ResearchDier公司，貨號為D12109)，取小鼠的左頸總動脈部分，用不同一抗孵育過夜，然後用二抗孵育，核染色，在螢光共聚焦顯微鏡下觀察得到的結果。採用的一抗為兔源VCAM-1antibody或鼠源ICAM-1antibody，採用的二抗為購自美國earthox公司的cy3affinipuregoatanti-rabbitigG(貨號E031620-01)或cy3affinipuregoatanti-mouseigG(貨號E031610-01)。結果見圖8。結果表明，抑整合素α5基因表達後，湍流引起的局部內皮細胞激活明顯被抑制。