一種誘導黃瓜大孢子離體單倍體胚胎發生的培養基及應用的製作方法

2023-10-06 20:04:29

專利名稱：一種誘導黃瓜大孢子離體單倍體胚胎發生的培養基及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物細胞工程中誘導單倍體胚胎發生的培養基。特別是涉及一種誘導大孢子離體單倍體胚胎發生的培養基及在誘導黃瓜大孢子離體單倍體胚胎發生的應用。
背景技術：
黃瓜是我國人民喜食的蔬菜品種之一。黃瓜的雜交育種已取得很大成績，先後育成的四代黃瓜品種津研、津雜、津春、津優，已佔全國黃瓜種植面積的80％以上。目前採用的常規雜交育種方法，首先需要培育性狀優良的自交系親本，由於雜種後代的不斷分離，獲得一個穩定的自交系需要進行至少6～8代的連續自交和選擇，一般花費3-4年時間，到最終育成一個雜交品種通常需要5～8年的時間，費時、費力。
單倍體育種技術是縮短育種周期，提高育種效率的有效手段。單倍體植株加倍獲得的雙單倍體植株(加倍的單倍體)不僅育性恢復，而且在遺傳上是純合穩定的，以性狀表現優良的雙單倍體植株作為親本材料，與常規育種相結合，進行雜交品種選育，可以大大縮短育種年限，1～2年即可獲得穩定的純系。育成一個雜交品種可以由原來的5～8年縮短到3～4年，顯著提高育種效率。另外，通過單倍體技術獲得的DH(加倍單倍體)群體，對分子遺傳圖譜構建及分子標記的研究具有特殊的應用價值。因此單倍體技術對育種和遺傳學研究都具有十分重要的意義。
單倍體技術已在大麥和水稻等禾本科作物、白菜和油菜等十字花科作物及辣椒等作物上大規模應用，在育種實踐中顯示出了明顯優勢。
黃瓜單倍體植株自然發生率極低，低於0.1％，無法應用於育種實踐。為了大量獲得單倍體，研究者採用了人工誘導單倍體的方法。Truong-Andre(1988)，杜勝利等(1997)報導了以輻射花粉授粉途徑誘導黃瓜單倍體發生子房以輻射花粉授粉後，摘取2-6周的授粉子房，撥出胚珠進行培養，獲得了黃瓜單倍體植株，但每千個胚珠只能產生3個單倍體植株，無法應用於育種。Sasser和Lazarte，(1982)報導以花葯培養的方法誘導黃瓜單倍體發生，獲得再生植株，但其較多可能由體細胞發育而來，沒有進行再生植株的倍性鑑定。Dirks和Robert(1996)申報美國專利，在世界上首次通過未受精子房培養的方法誘導黃瓜單倍體胚胎發生，獲得黃瓜單(雙單)倍體植株，單倍體胚胎再生頻率為80％。但其存在以下不足①試驗材料均為歐洲光滑類型黃瓜，而歐洲光滑類型黃瓜與中國刺瘤類型黃瓜基因型差異較大，我們所作研究主要針對中國刺瘤類型黃瓜，因此其方法在應用上存在局限性；②黃瓜單倍體胚胎發生誘導培養基根據材料的單性結實能力須做調整單性結實能力強的品種需添加細胞分裂素，低濃度生長素；非單性結實的品種需添加生長素。說明該誘導培養基誘導黃瓜單倍體胚胎發生受基因型差異影響較大；③單倍體胚胎再生頻率為80％，但大部分再生小植株為單倍體，需秋水仙鹼誘導加倍獲得二倍體植株，才能應用於育種，而加倍過程時間較長，且對再生植株產生傷害，造成死苗。Gemes和Juhasz(2002)報導在培養初期短期高溫處理，有利於未受精子房培養誘導黃瓜單倍體發生，單倍體胚胎發生頻率為7.1％-18.4％，沒有報導植株再生頻率以及再生植株的倍性情況。目前國內外尚未見關於黃瓜單倍體誘導的其它研究。

發明內容
本發明的目的是提供一種誘導黃瓜大孢子離體單倍體胚胎發生的培養基。
本發明的第二個目的是提供一種誘導黃瓜大孢子離體單倍體胚胎發生的培養基的應用。
本發明的技術方案概述如下一種誘導黃瓜大孢子離體單倍體胚胎發生的培養基，包括以下組分KNO3300～2000mg；CaCl2.H2O 100～300mg；MgSO4.7H2O 50～300mg；KH2PO4100～420mg；(NH4)2SO450～400mg；MnSO45～20mg；ZnSO45～15mg；H3BO36～15mg；KI0.5～1.5mg；FeSO4.7H2O 27.8mg；Na2EDTA.2H2O 37.3mg；肌醇 50～200mg；維生素B10.1～2.0mg；維生素B60.5～4.0mg；煙酸 0.5～5.0mg；甘氨酸 1～5mg；生長素 0.2～1.0mg；細胞分裂素 1.0～3.0mg；蔗糖 30g；瓊脂 7g；PH5.8，加水至一升，按常規方法製成培養基。
一種誘導黃瓜大孢子離體單倍體胚胎發生的培養基，優選的組分為KNO3為750mg，CaCl2H2O為165mg，MgSO4.7H2O為75mg，KH2PO4為170mg，(NH4)2SO4為120mg，MnSO4為10.5mg，ZnSO4為8.6mg；H3BO3為7.2mg，KI為0.83mg，FeSO4.7H2O 27.8mg；Na2EDTA.2H2O 37.3mg；肌醇為130mg，維生素B1為0.5mg，維生素B6為1.0mg，煙酸為2.0mg，甘氨酸為2.0mg，生長素為0.4mg，細胞分裂素為2.5mg；蔗糖30g，瓊脂7g；PH5.8，加水至一升，按常規方法製成培養基。
在上述組分中還可以加入維生素H0.1-2.0mg，抗壞血酸1-5mg，水解乳蛋白0.2-1.0mg。
所述生長素為吲哚乙酸或萘乙酸或二氯苯氧乙酸。
所述細胞分裂素為6-苄基腺嘌呤或激動素或玉米素。
一種誘導黃瓜大孢子離體單倍體胚胎發生的培養基的應用，包括如下步驟將供體基因型材料種植於溫室或大棚，取開花前2-3天的未受精子房，表面滅菌後，橫切，厚2-3mm的組織接種於權利要求1所述的培養基中，置於培養室23℃～27℃，最好選25℃，每天12～16小時光照，最好選14小時，每天8～12小時黑暗，最好選10小時，光照強度1500～1700勒克斯，最好為1600勒克斯，進行培養，40天後陸續觀察到胚胎或愈傷組織出現，即誘導了黃瓜大孢子離體單倍體胚胎發生。將幼小胚胎或愈傷組織繼代到分化培養基中成苗。
本發明的一種誘導黃瓜大孢子(未受精子房)離體單倍體胚胎發生的培養基命名為C99。
本發明的特點是1.本發明的培養基組成成分不同於以往研究報導；2.應用本發明的培養基培養中國刺瘤型黃瓜品種，植株再生頻率達15％，且再生植株中自然加倍而成的雙單倍體植株頻率高於80％，顯著高於以往文獻報導。3.本發明的一種誘導黃瓜大孢子離體單倍體胚胎發生的培養基，特別適於接種國內刺瘤類型黃瓜，可用於溫室、大棚、露地品種黃瓜大孢子離體單倍體誘導，經田間篩選後可直接作為育種材料，應用於育種。


圖1為應用本發明培養基培養6天的大孢子(未受精子房)切片圖。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。
實施例1一種誘導黃瓜大孢子離體單倍體胚胎發生的培養基，包括以下組分KNO3為750mg，CaCl2.H2O為165mg，MgSO4.7H2O為75mg，KH2PO4為170mg，(NH4)2SO4為120mg，MnSO4為10.5mg，ZnSO4為8.6mg；H3BO3為7.2mg，KI為0.83mg，FeSO4.7H2O 27.8mg；Na2EDTA.2H2O 37.3mg，肌醇為130mg，維生素B1為0.5mg，維生素B6為1.0mg，煙酸為2.0mg，甘氨酸為2.0mg，吲哚乙酸為0.4mg，6-苄基腺嘌呤為2.5mg，蔗糖30g，瓊脂7g，PH5.8，加水至一升，按常規方法製成培養基。
實施例2一種誘導黃瓜大孢子離體單倍體胚胎發生的培養基，包括以下組分KNO3為550mg，CaCl2.H2O為165mg，MgSO4.7H2O為190mg，KH2PO4為100mg，(NH4)2SO4為120mg，MnSO4為10.5mg，ZnSO4為8.6mg；H3BO3為7.2mg，KI為0.83mg，FeSO4.7H2O 27.8mg；Na2EDTA.2H2O 37.3mg，肌醇為130mg，維生素B1為0.5mg，維生素B6為1.0mg，煙酸為2.0mg，甘氨酸為2.0mg，萘乙酸為0.3mg，激動素為2.0mg，蔗糖30g，瓊脂7g，PH5.8，加水至一升，按常規方法製成培養基。
實施例3一種誘導黃瓜大孢子離體單倍體胚胎發生的培養基，包括以下組分KNO3為300mg，CaCl2.H2O為300mg，MgSO4.7H2O為50mg，KH2PO4為150mg，(NH4)2SO4為400mg，MnSO4為5mg，ZnSO4為5mg；H3BO3為6mg，KI為1.0mg，FeSO4.7H2O 27.8mg；Na2EDTA.2H2O 37.3mg，肌醇為200mg，維生素B1為0.1mg，維生素B6為0.5mg，煙酸為3.0mg，甘氨酸為1.0mg，萘乙酸為0.2mg，激動素為1.0mg，蔗糖30g，瓊脂7g，PH5.8，加水至一升，按常規方法製成培養基。
實施例4一種誘導黃瓜大孢子離體單倍體胚胎發生的培養基，包括以下組分KNO3為2000mg，CaCl2.H2O為100mg，MgSO4.7H2O為300mg，KH2PO4為100mg，(NH4)2SO4為50mg，MnSO4為20mg，ZnSO4為15mg；H3BO3為15mg，KI為0.5mg，FeSO4.7H2O 27.8mg；Na2EDTA.2H2O 37.3mg，肌醇為50mg，維生素B1為2.0mg，維生素B6為4.0mg，煙酸為0.5mg，甘氨酸為5.0mg，二氯苯氧乙酸為1.0mg，玉米素為3.0mg，蔗糖30g，瓊脂7g，PH 5.8，加水至一升，按常規方法製成培養基。
實施例5一種誘導黃瓜大孢子離體單倍體胚胎發生的培養基，包括以下組分KNO3為750mg，CaCl2.H2O為165mg，MgSO4.7H2O為75mg，KH2PO4為420mg，(NH4)2SO4為150mg，MnSO4為15mg，ZnSO4為10mg，H3BO3為7.2mg，KI為1.5mg，FeSO4.7H2O 27.8mg，Na2EDTA.2H2O 37.3mg，肌醇為150mg，維生素B1為1.0mg，維生素B6為2.0mg，煙酸為5.0mg，甘氨酸為5.0mg，吲哚乙酸為0.8mg，6-苄基腺嘌呤為2.5mg，維生素H為0.1mg，抗壞血酸為1mg，水解乳蛋白為1.0mg，蔗糖30g，瓊脂7g，PH5.8，加水至一升，按常規方法製成培養基。
實施例6一種誘導黃瓜大孢子離體單倍體胚胎發生的培養基，包括以下組分KNO3為750mg，CaCl2H2O為165mg，MgSO4.7H2O為75mg，KH2PO4為420mg，(NH4)2SO4為150mg，MnSO4為15mg，ZnSO4c為10mg，H3BO3為7.2mg，KI為1.5mg，FeSO4.7H2O 27.8mg，Na2EDTA.2H2O 37.3mg，肌醇為150mg，維生素B1為1.0mg，維生素B6為2.0mg，煙酸為5.0mg，甘氨酸為5.0mg，吲哚乙酸為0.8mg，6-苄基腺嘌呤為2.5mg，維生素H為2.0mg，抗壞血酸為5mg，水解乳蛋白為0.2mg，蔗糖30g，瓊脂7g，PH5.8，加水至一升，按常規方法製成培養基。
實施例7一種誘導黃瓜大孢子離體單倍體胚胎發生的培養基的應用，包括如下步驟1、取材將供體基因型材料種植於溫室、大棚內，以花冠微露黃色、閉和而即將開始展開的未受精子房為材料，將材料分為大(開花前1天)，中(開花前2-3天)，小(開花前4天)三種類型，大和中兩種類型子房可誘導黃瓜單倍體產生。
2、滅菌先用75％乙醇表面滅菌30s，然後用20％次氯酸鈣滅菌15分鐘，再用無菌水衝洗3-4次，去除材料表面的細菌、真菌等微生物，使其成為無菌材料。
3、接種將無菌材料橫切或縱切，厚2-3mm的組織接種於實施例1所述的培養基中，因材料基因型不同，切片方式對單倍體胚胎再生頻率會產生影響，須選擇適宜的切片方式，置於培養室25℃，每天14小時光照/10小時黑暗，光照強度1600勒克斯培養。
4、培養結果培養40-50天後，可見幼小胚芽或愈傷團出現，二者均可在原培養基上繼續培養，形成小植株，或將愈傷團繼代至分化培養基上，分化形成大量胚芽，繼續培養形成小植株。
5、細胞學觀察將不同培養天數的子房取樣，製作石蠟切片觀察。胚胎分化在培養的初期即開始啟動，圖1為培養6天的大孢子(未受精子房)切片圖，圖中心處為胚囊內分化的單倍體原胚，分化細胞起源於胚囊內，未見珠被等體細胞增生。
6、倍性鑑定單倍體與雙單倍體再生小植株的田間形態差異明顯單倍體植株葉片小，花瓣小且深裂，植株弱小，移栽較難成活，不育；雙單倍體小植株形態表現與正常二倍體植株相同，葉片正常，花瓣大、淺裂，植株健壯，移栽易成活，育性恢復，後代性狀表現一致，不發生分離。此種方法對於小植株倍性鑑定簡便、易行。葉片保衛細胞葉綠體數目、細胞染色體異染色質數量與植株倍性具有相關性，可作為倍性鑑定的依據。
7、再生頻率單(雙單)倍體植株再生率可達15％(每100個子房數)。黃瓜大孢子離體單倍體胚胎發生已形成完整的培養體系，工作程序簡化，平均每人每天可接種500個子房，獲得約75株再生小植株，為單倍體技術應用於育種提供了技術保障。
本試驗研究結果摘錄如下

說明方法1為實施例7所述方法；方法2為採用Gemes和Juhasz(2002)文獻報導所述方法和培養基。
由上表可見，採用方法1的植株再生率和雙單倍體植株率明顯高於文獻報導方法的應用結果。
實施例8一種誘導黃瓜大孢子離體單倍體胚胎發生的培養基的應用，包括如下步驟將供體基因型材料種植於溫室或大棚，取開花前2天的未受精子房，表面滅菌後，橫切，厚2-3mm的組織接種於實施例2所述的培養基中，置於培養室23℃，每天12小時光照/12小時黑暗，光照強度1500勒克斯培養，40天後陸續觀察到胚胎或愈傷組織出現，即誘導了黃瓜大孢子離體單倍體胚胎發生。將幼小胚胎或愈傷組織繼代到分化培養基中成苗。
實施例9一種誘導黃瓜大孢子離體單倍體胚胎發生的培養基的應用，包括如下步驟將供體基因型材料種植於溫室或大棚，取開花前2天的未受精子房，表面滅菌後，橫切，厚2-3mm的組織接種於實施例3所述的培養基中，置於培養室27℃，每天16小時光照/8小時黑暗，光照強度1700勒克斯培養，40天後陸續觀察到胚胎或愈傷組織出現，即誘導了黃瓜大孢子離體單倍體胚胎發生。將幼小胚胎或愈傷組織繼代到分化培養基中成苗，最終獲得單(雙單)倍體植株。
分化培養基組成及成分MS大量元素，MS微量元素，MS有機，MS鐵鹽，6-苄基腺嘌呤0.1mg/L，蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，餘量為水，PH5.8。
附MS培養基成分(包含MS大量元素，MS微量元素，MS有機，MS鐵鹽)NH4NO31650mg/L；KNO31900mg/L；KH2PO4170mg/L；CaCl2.2H2O 440mg/L；MgSO4.7H2O370mg/L；FeSO4.7H2O 27.8mg/L；Na2EDTA.2H2O 37.3mg/L；MnSO44H2O 22.3mg/L；ZnSO4.7H2O 8.6mg/L；H3BO36.2mg/L；KI 0.83mg/L；Na2MoO4.2H2O 0.25；CuSO4.5H2O0.025mg/L；CoCl2.6H2O 0.025；肌醇100mg/L；甘氨酸2mg/L；維生素B10.4mg/L；維生素B60.5mg/L；煙酸0.5mg/L。
權利要求
1.一種誘導黃瓜大孢子離體單倍體胚胎發生的培養基，其特徵是包括以下組分KNO3300～2000mg；CaCl2.H2O 100～300mg；MgSO4.7H2O 50～300mg；KH2PO4100～420mg；(NH4)2SO450～400mg；MnSO45～20mg；ZnSO45～15mg；H3BO36～15mg；KI0.5～1.5mg；FeSO4.7H2O27.8mg；Na2EDTA.2H2O37.3mg；肌醇50～200mg；維生素B10.1～2.0mg；維生素B60.5～4.0mg；煙酸0.5～5.0mg；甘氨酸1～5mg；生長素0.2～1.0mg；細胞分裂素1.0～3.0mg；蔗糖30g；瓊脂7g；PH 5.8，加水至一升，按常規方法製成培養基。
2.根據權利要求1所述一種誘導黃瓜大孢子離體單倍體胚胎發生的培養基，其特徵是所述KNO3為750mg，所述CaCl2H2O為165mg，所述MgSO4.7H2O為75mg，所述KH2PO4為170mg，所述(NH4)2SO4為120mg，所述MnSO4為10.5mg，所述ZnSO4為8.6mg；所述H3BO3為7.2mg，所述KI為0.83mg，肌醇為130mg，維生素B1為0.5mg，維生素B6為1.0mg，煙酸為2.0mg，甘氨酸為2.0mg，生長素為0.4mg，細胞分裂素為2.5mg。
3.根據權利要求1或2所述一種誘導黃瓜大孢子離體單倍體胚胎發生的培養基，其特徵是包括維生素H 0.1-2.0mg，抗壞血酸1-5mg，水解乳蛋白0.2-1.0mg。
4.根據權利要求1或2所述一種誘導黃瓜大孢子離體單倍體胚胎發生的培養基，其特徵是所述生長素為吲哚乙酸或萘乙酸或二氯苯氧乙酸。
5.根據權利要求1或2所述一種誘導黃瓜大孢子離體單倍體胚胎發生的培養基，其特徵是所述細胞分裂素為6-苄基腺嘌呤或激動素或玉米素。
6.一種誘導黃瓜大孢子離體單倍體胚胎發生的培養基的應用，其特徵是包括如下步驟將供體基因型材料種植於溫室或大棚，取開花前2-3天的未受精子房，表面滅菌後，橫切，厚2-3mm的組織接種於權利要求1所述的培養基中，置於培養室23℃～27℃，每天12～16小時光照/8～12小時黑暗，光照強度1500～1700勒克斯培養，40天後陸續觀察到胚胎或愈傷組織出現，將幼小胚胎或愈傷組織繼代到分化培養基中成苗，即誘導了黃瓜大孢子離體單倍體胚胎發生。
7.根據權利要求6所述一種誘導黃瓜大孢子離體單倍體胚胎發生的培養基的應用，其特徵是所述培養室的溫度為25℃，所述光照時間為14小時，所述黑暗時間為10小時，所述光照強度為1600勒克斯。
全文摘要
本發明公開了一種誘導黃瓜大孢子離體單倍體胚胎發生的培養基及應用，培養基包括不同含量的KNO
文檔編號C12N5/04GK1737122SQ200510014670
公開日2006年2月22日 申請日期2005年7月29日 優先權日2005年7月29日
發明者杜勝利, 魏愛民, 韓毅科, 張歷, 王豔飛 申請人:天津科潤農業科技股份有限公司