知母提取物在製備改善胰島素抵抗藥物中的應用的製作方法
2023-10-10 17:31:09 1
專利名稱：知母提取物在製備改善胰島素抵抗藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物製藥及分子生物學技術領域。
二、技術背景胰島素抵抗是指靶細胞對胰島素的敏感性下降，需要更多的胰島素才能維護正常的血糖濃度，表現為外周組織尤其是肌肉、脂肪組織對葡萄糖的利用障礙。發病早期胰腺β細胞可以代嘗性地增加胰島素的分泌量以彌補其效應不足，但隨著胰島β細胞功能的逐步衰竭，即代償機制的喪失，就會表現出胰島素抵抗，高胰島素症，高血糖等繼而引發糖尿病。現代醫學表明，胰島素抵抗是眾多心血管疾病及糖尿病的共同危險因素，會引起多種代謝相關疾病。
UCP2是胰島素分泌的負調節分子。它介導了線粒體內膜的質子滲漏，這已被一系列的研究所證明，這些研究的對象涵蓋了原脂質體、線粒體以及完整細胞(Krauss S，et al.Proc.Natl.Acad.Sci，U.S.A.99118-122，2002)。在胰島β細胞中，UCP2介導的質子滲漏使得糖生成的ATP數量降低，從而負調節胰島素分泌。ob/ob小鼠是肥胖導致的糖尿病動物模型，在該小鼠胰島中，UCP2表達顯著升高。另外，高血糖也能導致胰島內UCP2表達升高。更重要的是，在ob/ob小鼠中敲除UCP2，胰島素分泌的第一相能得到恢復，並且血清中胰島素含量升高，高血糖症狀也得到改善(Zhang CY，et.al.Cell 105745-755，2001)。這些結果充分說明，UCP2在高血糖以及肥胖導致的胰島功能異常中發揮了重要作用。因此，設法抑制UCP2在的表達在製備改善胰島素抵抗的藥物中具有廣闊的前景。
知母為百合科植物知母(Anemarrhena asphodeloides)的乾燥根莖，具有滋陰降火，潤燥滑腸的功效，臨床為多味治療消渴症方劑的君藥；中醫講究「陰陽調和」，認為疾病是由於寒熱失調所引起的，然而這些理論過於虛幻，缺少現代分子生物學研究支持。因此，我們以知母提取物為研究對象，充分運用分子生物學的實驗手段證實了知母可以通過抑制UCP2的表達從而改善胰島素抵抗的目的，為改善並治療胰島素抵抗提供了新的效果顯著的藥物。
發明內容
本發明的需要解決的問題是利用知母提取物抑制UCP2蛋白的表達並將知母提取物開發成改善胰島素抵抗的藥物。
1.本發明所述知母提取物的製備，知母的主要成分是皂苷、黃酮、雙苯吡酮、木質素等。
2.知母水提物通過特異性抑制UCP2蛋白的表達，從而達到治療胰島素抵抗的實驗方法知母水提物給小鼠灌胃2次，間隔8h，用量為90mg/kg；發現在第2次灌胃後6小時後處死小鼠，UCP2的信使核糖核酸在腎臟中的表達量下降了約30％。
3.知母水提取物可以製備成一種改善胰島素抵抗的藥物。
本發明首次闡明了知母水提取物具有特異性抑制UCP2的效應。目前中醫和現代分子生物學的研究還沒有很好的結合起來，中藥作用的特異性靶位點更是知之甚少。本研究室首次提出UCP2是胰島素分泌的負調控因子(Zhang CY，et.al.Cell 105745-755，2001)，在肥胖導致的胰島功能異常中扮演了重要角色。在此基礎上，又進一步發現知母的提取物作用的靶位點就是UCP2，通過特異性抑制UCP2的表達來提高胰島素分泌，從而達到改善胰島素抵抗的目的。可製備成一種改善胰島素抵抗的藥物。
對胰島素抵抗的治療目前臨床上多以西藥為主，不僅有副作用，用久了還會產生「治療失效」；中藥作為我國的傳統治療藥物，從臨床和實驗研究的角度，均證實其藥性溫和持久且副作用小(W.L.Li，et al.J Ethnopharmacol，921，2004)，因而知母開發作為改善胰島素抵抗的藥物具有巨大的應用前景，是一種原料價格低廉、生產工藝簡單、副作用小的改善胰島素抵抗的藥物。
四
圖1為給藥2次後用普通PCR(RT-PCR)定性檢測小鼠腎臟中UCP2信使核糖核酸的表達情況(從左向右1-5為對照組，6-10為給藥組)；圖2為給藥2次後用定量PCR(Real-time PCR)檢測分析小鼠腎臟中UCP2信使核糖核酸表達的變化的結果圖。
五具體實施例方式
材料與來源試劑，Trizol購自Invitrogen公司；逆轉錄酶和Tag酶購於大連寶生物工程有限公司。
手術器械剪刀，彎頭小鑷等購自江蘇思來科技有限公司。
其它器材Heidolph DIAX900勻漿器；ABI Prism 7000 Sequence DetectionSystem PCR儀；C57BL/6小鼠購於南京大學模式動物中心實施例1.知母提取物的濃縮方法150g知母加入1L的蒸餾水，加熱至沸騰後，煎煮2h，留取上清，殘渣重複上述過程一次。兩次上清轉至旋轉蒸發儀60℃蒸發4h後，低溫凍幹；於4℃保存。
2.小鼠給藥及組織的分離保存實驗用小鼠為SPF級的野生型雄性小鼠，品系C57BL/6，8周齡，飼養於南京市鼓樓醫院動物實驗中心。用灌胃針按90mg/kg藥量灌胃給藥2次，時間間隔8h；對照組小鼠用等體積的生理鹽水灌胃。第2次灌胃後6h處死小鼠；取小鼠腎臟組織，生理鹽水漂洗乾淨，立即放於凍存管中，於液氮中保存備用。
3.組織RNA的提取、RT-PCR和real-time PCR取適量組織加1ml Trizol量於Heidolph DIAX900組織勻漿器將組織充分勻漿(3檔90秒)，將勻漿液轉入潔淨的1.5ml離心管中，加入200μl氯仿，13200rpm離心10分鐘，小心吸取上清至另一潔淨的1.5ml離心管中，加入等體積的異丙醇，13200rpm離心10分鐘，棄上清，75％乙醇洗滌沉澱，室溫乾燥，20μl DEPC水溶解，紫外分光法檢測濃度和純度。2μg RNA用於逆轉錄，反應體系為20μl，含2μg RNA，1mMdNTP，RNA酶抑制劑1 U/μl，Oligo(dT)18引物2.5 pmol/μl，AMV逆轉錄酶0.5U/μl，輕輕混勻，42℃1小時，冰上放置2分鐘，所得cDNA可用於real-timePCR。real-time PCR為20μl反應體系，分別含0.5μl(檢測GAPDH)和1.5μl(檢測UCP2)cDNA，2mM MgCl2，0.2mM dNTP，各1pmol/μl上、下遊引物及相應的探針，0.025U/μlTag酶，混勻。PCR反應條件95℃5分鐘；95℃30秒，60℃1分鐘(40個循環)；4℃5分鐘。引物和探針序列如下GAPDH上遊引物5』-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3下遊引物5』-CCTGCTTCACCACCTTCTTGA-3
探針序列5』-CCGCCTGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3』UCP2上遊引物5』-CCAATGTTGCCCGWAATG-3』，下遊引物5』-TGAGGTTGGCTTTCAGGAG-3探針序列5』-CTGGTGACCTATGACCTCATCAAAG-3』結果用ABI Prism 7000 SDS Software分析，見附圖。
從附圖可以看出，給藥組小鼠腎臟中的UCP2的信使核糖核酸的表達量有顯著的降低，說明該知母提取物可以通過抑制小鼠基因UCP2的表達從而達到提高胰島素分泌進而改善胰島素抵抗的效果。
權利要求
1.一種知母提取物，其特徵是從中藥知母中提取，其主要成分是皂苷、黃酮、雙苯吡酮、木質素。
2.根據權利要求1所述知母提取物的提取方法，其特徵是150g知母加入1L的蒸餾水，加熱至沸騰後，煎煮2h，留取上清，殘渣重複上述過程一次。兩次上清轉至旋轉蒸發儀60℃蒸發4h後，低溫凍幹；於4℃保存。
3.根據權利要求1所述的知母提取物在製備改善胰島素抵抗藥物中的應用。
4.根據權利要求1所述的知母水提物特異性抑制UCP2蛋白的表達，其特徵是知母提取物給小鼠灌胃2次，間隔8h，用量為90mg/kg；在第2次灌胃後6小時後處死小鼠，UCP2的信使核糖核酸在腎臟中的表達量下降30％。
全文摘要
本發明屬於生物製藥及分子生物學技術領域，包括用知母水提物給小鼠灌胃的方法，發現能夠通過特異性抑制解偶聯蛋白2(uncoupling protein 2，UCP2)的表達，從而治療胰島素抵抗。本發明將知母經過水煎煮，用旋轉蒸發儀濃縮以及減壓凍幹，得到晶體狀濃縮提取物。用該提取物配置成一定濃度的水溶液給小鼠灌胃，發現能夠顯著的抑制小鼠腎臟中UCP2的表達。本發明闡明了知母水提物能夠特異抑制UCP2蛋白在腎臟中的表達，可開發為改善和治療胰島素抵抗的藥物。
文檔編號A61K125/00GK1943705SQ20061009725
公開日2007年4月11日 申請日期2006年10月26日 優先權日2006年10月26日
發明者姜曉宏, 張辰宇, 項陽, 孫凌冰, 張紅傑, 孫國勳, 鄒季虹, 徐琛 申請人:南京大學