肝癌相關基因dlk1及其應用的製作方法

2023-10-24 18:55:07

專利名稱：肝癌相關基因dlk1及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學和基因工程領域，具體地，本發明涉及肝癌相關基 因DLK1、以其mRNA序列為耙點的一組siRNA、及其在製備診斷肝癌試劑、製備
基因治療肝癌的藥物中的應用。
背景技術：
目前我國有慢性肝炎患者約1200萬例，每年死於肝病約30萬，其50%為原 發性肝癌，約佔全世界肝癌死亡人數的45%左右。絕大多數與HBV、 HCV感染有 關。肝癌發病率在我國居2-3位，主要在青壯年男性發病，在華東地區的發病 率明顯高於其他地區，近年來，有持續上升趨勢。在上海，肝癌的發病率居第 三位，僅次於肺癌和胃癌。最新資料顯示這個比例還有繼續上升的趨勢。現在， 肝癌，特別是肝炎病毒引起的肝癌己經嚴重危害了我國人民生命安全。因此， 非常有必要對肝癌發生的分子機製作深入的研究。
隨著人類基因組測序的完成，基因組學的研究重點已經轉移到以解析基因 功能為主的功能基因組學研究。功能基因組學的重點是以疾病為中心，全力解 決人類疾病相關基因研究中的重大科學問題。肝癌在我國素有"國病"之稱， 經過半個世紀的探索，對於肝癌的早期診斷和治療雖然有了一定的認識，但肝 癌預後仍然很差，特別是對其發病機制的了解及治療藥物的新耙點方面，更是 知之甚少。因此，尋找與腫瘤相關的基因，特別是尋找新的抑癌基因是近年來 腫瘤研究的熱點。DLKl基因定位於染色體14q32上。DLK1是在胞外區域包含6個EGF樣重複序列的糖基化Delta樣跨膜蛋白。DLK1首先是在脂肪前體細胞中 發現，與脂肪細胞的分化緊密相關。DLK1基因具有抑制脂肪前體細胞向脂肪細 胞分化的功能。近年來，有研究發現DLK1在神經母細胞瘤細胞和小細胞肺癌細 胞株等腫瘤細胞中存在表達，表明DLK1基因可能與腫瘤發生相關；同時在老鼠 的胎肝細胞和膽汁淤積引起的肝纖維化細胞中均發現DLK1的表達。在我們的前 期肝癌及癌旁表達譜分析的研究中，發現DLK1基因在肝癌中的表達較癌旁組織 中明顯增加，提示DLK1基因可能對肝癌的發生相關。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種肝癌相關基因DLK1的mRNA序列， 蓋基因定位在人染色體14q32上，可用於製備治療原發性肝癌的RNA 幹擾藥物。
為解決上述技術問題，本發明提供肝癌相關基因DLK1的mRNA序列。 本發明還提供一種表達載體，含有所述以DLK1上mRNA為靶點的 siRNA序列。
本發明還提供一種含有所述表達載體的宿主細胞。
在本發明的再一方面，還提供了一種用於治療肝癌的試劑盒，其 含有所述的以DLK1上mRNA為靶點的siRNA。
在本發明的又一方面，還提供了一種用於治療肝癌的生物晶片， 其含有以DLK1上mRNA為靶點的siRNA。
在本發明的又一方面，還提供了肝癌相關基因DLK1在製備診斷 肝癌及腫瘤的試劑，和製備基因治療肝癌及腫瘤的藥物中的應用。
本發明由於對DLK1基因進行了體外動物細胞試驗，證實DLK1缺失能夠導
致肝腫瘤細胞顯著縮小，認為DLK1基因在進行製備治療肝癌的基因藥物中有巨 大作用，可以成為基因治療的靶點。


圖l是實施例l中pSUPER DLK874和pSUPER DLK1011的RNA幹擾效率示意圖， 其中，pSUPER為空載對照，pSUPER Luc+為陰性對照； 圖2是實施例2中三次克隆實驗中的一次的實驗照片；
圖3是實施例2中從上到下為H印3B、 H印G2和Huh-7細胞在三次獨立實驗中的 克隆數目統計圖，其中，*表示與對照組比較時 值<0.05;
圖4是實施例3中DLKl表達穩定下調的Huh-7細胞株的鑑定示意圖，其中，P -ac t i n作為各樣品蛋白上樣量對照；
圖5是實施例3中DLKl表達穩定下調Huh-7細胞株的生長曲線比較示意圖，其 中，細胞活力在450nm波長處測量，每點上下所標的黑色刻度線標誌為其標準差；
圖6是實施例4中DLKl表達下調的Huh-7細胞在裸鼠體內的成瘤性降低示意 圖；上圖為4周後攜帶腫瘤的裸鼠照片，皮下的腫瘤呈圓塊狀；下圖為4周後取 下的皮下腫瘤照片，其中Huh-7 p1011 A4細胞在六周後仍無腫瘤形成；
圖7是實施例5中S固C-7721瞬間轉染pcDNA3. 0和pcDNA3. 0-DLK1後的生長曲 線示意圖8是實施例5中SMMC-7721瞬間轉染pc腿3. 0和pcDNA3. 0-DLK1後的 Western Blotting分析鑑定圖，其中DLKl為轉染pcDNA3. 0-DLK1質粒，3. O為轉 染pcDNA3.0質粒，blank為沒有轉染的SMMC-7721細胞，0 -actin作為各樣品蛋 白上樣量對照。
具體實施例方式
下面結合附圖對本發明作進一步詳細的說明。
本發明的實施例如下所示
實施例1 構建並鑑定DLK1的RNAi質粒
在本實施例中，引入pSUPER質粒，以構建能夠對細胞進行比較穩定轉染的 RNAi的質粒。該質粒含有H1-RNA多聚酶III基因啟動子，將能轉錄出含有短鏈 髮夾結構RNA (shRNA)的cDNA序列寡核苷酸插入pSUPER質粒的該啟動子之後， 使此載體在轉染入細胞後能在細胞內穩定合成發卡樣結構的shRNA，即達到比較 穩定的沉默目的基因的作用。
在本實施例中所用的寡核苷酸序列如下
1、 pSUPER Luc+:
正向弓l物gatccccctt acgctgagta cttcgattca agagatcgaa gtactcagcg taagtttttg gaaa
反向引物- agcttttcca aaaacttacg ctgagtactt cgatctcttg aatcgaagta ctcagcgtaa gggg
2、 pSUPER DLK874:
正向引物gatccccggt ctcacctgtg tcaagattca agagatcttg acacaggtga gacctttttg gaaa
反向弓l物agcttttcca aaaaggtctc acctgtgtca agatctcttg aatcttgaca caggtgagac cggg
3、 pSUPER DLK1011:
正向弓l物s gatccccggt gtccatgaaa gagctcttca agagagagct ctttcatagg cacctttttg gaaa
反向弓l物s agcttttcca aaaaggtgtc catgaaagag ctctctcttg aagagctctt tcataggcac cggg
其中pSUPER Luc+質粒，其RNAi所針對的片段為改良過的北美螢火蟲 (Photinuspyralis)螢光素酶基因的19個鹼基片段。該基因Luc+是具有種屬 特異性的報告基因，在哺乳動物細胞中不存在該基因也不表達。因此，本實施 例中pSUPER Luc+質粒為RNAi幹擾體系的參照，以排除pSUPER Luc+質粒在RNAi 過程中可能出現的非特異的實驗結果。而pSUPER DLK874和pSUPER DLK1011質 粒幹擾的靶序列分別針對DLK1基因序列第874和第1011個鹼基開始的連續19 個鹼基片段。
將靶序列對應的cDNA序列分別插入到正向引物(Forward primer)和反向 引物(Reverse primer)的前段空缺內，同時將該cDNA的互補cDNA序列插入 後段空缺，形成完整的正向引物，共64個鹼基。在得到人工合成DNA序列後， 對正向引物和反向引物進行退火和磷酸化，隨後連接入pSUPER載體，再經過轉 化進行陽性克隆的篩選。
利用pSUPER質粒內部固定的限制性內切酶位點Ecor I和Hind III，對 pSUPER Luc+質粒進行酶切鑑定。
陽性克隆酶切後的條帶大小約為360bp，而陰性克隆酶切後為300bp。所挑 選的8個pSUPER Luc+克隆中左起第2和3號克隆酶切後的條帶略高於其它條帶， 大小符合陽性克隆的特徵。選擇該兩個克隆經測序鑑定發現3號克隆的序列完 全符合目的序列片段。而4個pSUPER DLKlOll克隆中，左起1、 3、 4號均為陽 性，測序鑑定發現1號克隆的序列完全符合目的序列片段。另外，pSUPERDLK874 質粒的鑑定篩選過程同上。最終得到該三個以pSUPER為載體的RNAi質粒。
將構建好的pSUPER DLK874和pSUPER DLKlOll瞬間轉染入內源性表達DLK1 的HCC細胞Huh-7、H印3B和H印G2中，並以pSUPER Luc+為對照質粒，用Real-time Quantitative PCR鑑定其沉默DLK1基因表達的效果(見圖l)。 圖1中的數據是以各樣品的管家基因e肌動蛋白(e-actin)表達量為參 考經標準化後的相對平均值。本實施例中，DLK1的Real-time Quantitative PCR 引物如下-
正向弓l物5， -gtactcggga aaggactgcc-3，
反向弓l物5， -ctcgcagaaa ttgcctgaga-3，
所用探針為5， -FAM-aggcacccgt ggatgatgag-TAMRA-3，
以上Real-time Quantitative PCR的實驗每個都至少重複進行3次。由圖
1可見，由pSUPER載體介導的RNA幹擾能使目的基因DLKl的表達在上述三種細
胞內下調50—60%。
實施例2瞬間克隆形成試驗(證明HCC細胞的DLKl表達抑制後其克隆形
成能力降低)
在鑑定pSUPER載體介導的RNAi有效的基礎上，對實施例1中的三種內源 性表達DLK1的細胞進行瞬間克隆形成試驗(見圖2、圖3)，並以無內源性DLK1 表達的HCC細胞株Bel-7402細胞作為對照細胞。
將pSUPER空載質粒和pSUPER DLK874、 pSUPER DLK1011質粒與pcDNA3. 0 質粒以10比1的比例分別共轉染入H印3B、 H印G2、 Huh-7和Bel-7402細胞， 此處pcDNA3. 0質粒為轉染後的細胞提供G418抗性。在轉染後，各對照組的分 別取等量細胞分入100mm細胞培養皿中培養，並用含適當濃度的G418的MEM或 者DMEM完全培養液進行篩選並等待耐藥克隆的形成。其中H印G2和G418篩選 濃度為1000 u g/ml， H印3B、 Huh-7和Bel-7402均為600 u g/ml。待3—4周， 克隆形成較為完全後染色並拍照保存。
可以看到，在內源性DLK1被下調後，H印3B、 H印G2和Huh-7細胞形克隆形 成的數目都有明顯下降，即其克隆形成能力被顯著削弱。而沒有內源性表達的
Bel-7402細胞在同樣的實驗中其形克隆形成的數目卻沒有明顯改變。
實施例3 Western Blotting分析(證明Huh-7細胞的DLKl表達被抑制後 其生長增殖能力降低)
以Huh-7細胞為對象，將pSUPER空載質粒和pSUPER DLK874、pSUPER DLK1011 質粒與pcDNA3. 0質粒以10比1的比例分別共轉染入Huh-7細胞，構建DLKl表 達抑制的Huh-7穩定細胞株，並用Western Blotting Analysis對於其中的4 株穩定細胞株在蛋白水平上對DLK1的表達進行鑑定(見圖4)。
圖4中，pSUPER C5為pSUPER空載質粒穩定細胞株；p1011 B3和plOll A4 為穩定轉染pSUPER DLK1011後形成的亞克隆;p874 C2為穩定轉染pSUPER DLK874 後形成的亞克隆。得到兩株DLKl穩定下調的細胞株Huh-7 p874 C2和Huh_7 pl011A4，而穩定株Huh-7 plOll B3中DLK1的表達並沒有下調。
在建立了 DLKl穩定下調細胞株的基礎上，研究了這兩株穩定株的生長屬性 是否受DLK1下調的影響而改變，為此，比較這些細胞及對照的生長曲線。如圖 5所示，當DLKl的表達被下調後，其穩定株的生長增殖能力明顯減弱。與之比 較的空載穩定細胞株pSUPER C5和內源性DLKl表達沒有被下調的對照穩定細胞 株pl011B3，它們兩者的生長狀態良好。雖然它們之間也略有差異，即pSUPER C5要比plOll B3生長增殖能力稍微更強一些，但是這兩者總的要比p874 C2和 plOll A4的生長增殖能力都要顯著得多。該實驗經重複三次後，得到相似的結 果。
實施例4無胸腺的BLAB/cA裸鼠體內實驗(證明Huh-7細胞的DLKl表達 被抑制後其在動物體內成瘤能力降低)
本實施例共取32隻裸鼠，分成四組，每組八隻，分別於皮下注射相同量(2 X106)的Huh-7 pSUPER C5、 plOll B3、 p874 C2和pl011 A4細胞。注射後四周觀察裸鼠的生存狀態及所成腫瘤的形態指標(見圖6)。
經觀察發現，DLK1被穩定下調的Huh-7 p874 C2細胞在裸鼠皮下所成的腫 瘤要比對照組Huh-7 pSUPER C5和pl011 B3細胞在裸鼠下所成的腫瘤在體積上 顯著減小，而且Huh-7 p1011 A4在觀察注射腫瘤細胞後六周仍然未見肉眼可見 腫瘤形成，解剖證實該注射Huh-7 plOll A4細胞的8隻裸鼠確實沒有腫瘤形成。 注射Huh-7 pSUPER C5、 p1011 B3、 p874 C2細胞後的所有裸鼠在四周後都形成 了腫瘤，而且注射了Huh-7 pSUPER C5和pl011 B3細胞所形成的腫瘤經解剖分 離後顯示其所成腫瘤實體的體積比Huh-7 p874 C2的更大(見圖6)，並且該兩 組腫瘤實體本身沒有顯著性差異。但注射了Huh-7 pSUPER C5和pl011 B3細胞 的裸鼠與注射了Huh-7 p874 C2和pl011 A4細胞的裸數的體重淨重、進食能力 和精神狀態在4周後沒有顯著差異，所有裸鼠在實驗中止即解剖前全部存活。
本實施例結果顯示對於內源性表達DLK1的肝癌細胞株在模型動物皮下進行 的成瘤實驗中，DLK1對於腫瘤細胞的成瘤能力起了重要的增強作用。由於DLK1 被穩定下調的細胞成瘤作用大幅度降低，甚至其中一例了Huh-7 p1011 A4細胞 的8隻裸鼠都沒有長出肉眼可見的腫瘤，因此本實施例證明了 Huh-7細胞的DLK1 表達被抑制後其在動物體內成瘤能力降低。
實施例5 DLK1促進SMMC-7721細胞的生長
以上實施例均採用了 RNAi的手段使DLK1的表達受到抑制，觀察到DLK1的 表達抑制後，肝癌細胞生長增殖能力、克隆形成和成瘤能力都有顯著的降低， 這提示DLK1對於肝癌細胞的生長增殖及成瘤性起著某種維持或限制的作用。本 實施例用以驗證DLK1是否可以直接起到癌基因的作用來促進腫瘤細胞的增殖。
在無內源性DLK1表達的S固C-7721細胞中，瞬間轉入之前所構建的過表達 DLKl全長蛋白的pcDNA3.0-DLK1質粒，並以pcDNA3. 0空載質粒為對照，觀察細胞的生長增殖曲線(見圖7)。 Western Blotting Analysis中的樣品為生長曲 線所用同一批轉染了 pcDNA3. 0和pcDNA3. 0-DLK1質粒的SMMC-7721細胞，各樣 品上樣量均為20 u g，以鑑定轉染質粒後DLKl在S醒C-7721細胞中表達的效率 (見圖8)。
在本實施例中，在SMMC-7721細胞中進行了該兩個質粒的瞬間轉染，轉染 試劑為Lipofectamine 2000 (Invitrogen)，在轉染4一5小時後將含有轉染試劑 的培養液撤去，更換成新鮮的DMEM完全培養液，以儘量減少轉染試劑的毒性對 於細胞的損傷。繼續培養至次日，計數後分入96孔板內生長，每孔均勻分入1000 個細胞。經過8天的觀察，發現轉染了 DLK1的S醒C-7721細胞比轉染了空載質 粒的細胞生長顯著增快。
本實施例結果表明DLK1能顯著增強無內源性DLK1表達的HCC細胞株 SMMC-7721的生長增殖能力。
序 歹U 表
上海人類基因組研究中心
肝癌相關基因DLK1及其應用
NP-11134
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1
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〈212> RNA
Homo sapiens
1
g卿gcgcagcgcgcagcccggtgcagccctggctttcccctcgctgcgcgcccgcgccc60
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腿
Homo sapiens
〈400> 23
UGCUGMGGUGGUCAUGUCGAUCdTdT
權利要求
1、肝癌相關基因DLK1，其特徵在於它定位於人染色體14q32上，它具有如SEQ ID NO1所示的mRNA序列。
2、 一種表達載體，其特徵在於含有以權利要求1所述的mRNA 核糖核酸序列為靶點的寡核苷酸siRNA序列。
3、 一種含有如權利要求2所述表達載體的宿主細胞。
4、 一種用於治療肝癌的試劑盒，其特徵在於所述試劑盒含有如 權利要求1所述的mRNA核糖核酸序列為靶點的寡核苷酸siRNA序列。
5、 一種用於診斷肝癌的生物晶片，其特徵在於所述生物晶片的 載體含有如權利要求1所述的mRNA核糖核酸序列為靶點的寡核苷酸 s週A序歹U。
6、 一組以肝癌相關基因DLK1為靶點的核糖核酸序列，用於製備 治療原發性肝癌的RNA幹擾藥物，其特徵在於它的寡核苷酸序列如 下siRNAl:S:GAUUCUGCGAGGAUGACAAUGUUdTdT(SEQ ID NO:2) AS:AACA跳UCAUCCUCGCAGAAUCdTdT(SEQ ID NO :3) siRNA2:S:GAUGGCCUC畫GAAUGCUCCUGUGdTdT(SEQ ID NO:4) AS:CACAGGAGCAUUCAUAGAGGCCAUCdTdT(SEQ ID NO:5) siRNA3:S:CAGGCAA,CUGCGAGAUCGUGdTdT(SEQ ID NO: 6)see original document page 3S:GAUCGACAUGACCACCUUAGCAdTdT(SEQ ID NO:22) AS:UGCUGAAGGUGGUCAUGUCGAUCdTdT(SEQ ID NO:23)。
7、如權利要求1所述的肝癌相關基因DLKl在製備診斷肝癌及腫 瘤的試劑，和製備基因治療肝癌及腫瘤的藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了DLK1基因在製備治療原發性肝癌的RNA幹擾藥物中的應用，提供了以所述DLK1基因為靶點的siRNA序列，包含以所述DLK1基因為靶點的siRNA序列的載體、宿主細胞，還提供了治療及診斷肝癌的生物晶片及試劑盒。以DLK1基因為製備治療原發性肝癌基因藥物的靶點，使得攻克肝癌成為可能。
文檔編號C12N15/12GK101200719SQ200610119409
公開日2008年6月18日 申請日期2006年12月11日 優先權日2006年12月11日
發明者新 張, 韓澤廣, 健 黃 申請人:上海人類基因組研究中心