聚乙二醇修飾的幹擾素組合物及其使用方法

2023-10-07 18:29:04

專利名稱：聚乙二醇修飾的幹擾素組合物及其使用方法
技術領域：
本發明涉及治療肝炎病毒感染的抗病毒藥物領域。
背景技術：
C型肝炎病毒(HCV)感染是美國最普遍的慢性血液傳播感染。雖然新的感染人數下降了，但慢性感染的負擔相當大，疾病控制中心估計在美國有三千九百萬(1.8％)感染者。慢性肝病在美國成年人的死亡原因中排名第十，每年導致大約25,000人死亡，或佔總死亡人數的約1％。研究表明，40％的慢性肝病與HCV有關，估計每年導致8,000到10,000人死亡。HCV相關的終末期肝病是成年肝移植患者中最頻繁的指徵。
幹擾素-α(IFN-α)治療是治療C型肝炎病毒感染的選擇之一。然而，約50％的患者未能達到持續的病毒學應答。因為IFN-α的血清半衰期為8到8.5個小時，要維持較高的血清水平就要反覆給藥IFN-α。例如，可接受的劑量方案是每周給藥IFN-α三次(TIW)，持續24-48周。已設想與如此反覆給藥相關的藥物水平的峰和谷會在治療期間造成幹擾素的嚴重副作用。
在本領域中需要一種具有IFN-α的優異抗病毒活性的藥學製劑，它有期望的藥代動力學性質，可降低給藥方案的頻率，在血液中維持足夠高的藥物濃度而同時可以降低病毒負荷)。
引用的文獻美國專利號，5,252,714；5,382,657；5,539,063；5,559,213；5,672,662；5,747,646；5,766,581；5,792,834；5,795,569；5,798,232；5,824,784；5,834,594；5,849,860；5,928,636；5,951,974；5,595,732；5,981,709；5,985,265；6,005,075；6,180,096；6,250,469；6,277,830。PCT公布號WO 99/37779。Chamov等.(1994)Bioconj.Chem.5133-140；Harris等.(2001)Clin.Pharmacokinet.40539-551；Reddy(2000)Ann.Pharmacother.34915-923；Bailon等.(2001)Bioconj.Chem.12195-202；Reddy等.(2002)Adv.Drug Deliv.Rev.54571-586。
發明概述本發明提供了連接到具有平均分子量約30kD的線形聚乙二醇(PEG)分子的幹擾素-α(IFN-α)和含有同樣部分的組合物。本發明還提供了用主題PEG-修飾的IFN-α治療病毒感染的方法。


圖1描述了共有幹擾素IFN-αcon1的胺基酸序列(SEQ ID NO1)。
圖2是描述命名為PEG-Alfacon的聚乙二醇化(pegylated)的共有幹擾素-α進行體積排阻色譜的色譜圖。
圖3是描述命名為PEG-Alfacon的PEG化的共有幹擾素-α的SDS-PAGE電泳(還原性和非還原性)分析的結果的照片。
圖4是描述PEG-Alfacon、CIFN(Infergen)和兩個化合物的混合物的反相HPLC色譜的色譜圖。
圖5是描述用PEG化的幹擾素-α類似物(IM-001，IM-003，IM-005和IM-006)，Pegasys和PEG-Intron對大鼠皮下注射給藥的血清濃度-時間曲線圖。
圖6是用PEG-Alfacon(製備號IM-006)對大鼠皮下注射給藥的血清濃度-時間曲線的半對數圖。
圖7是用PEG-Alfacon對獼猴進行皮下(Sub-Q)給藥的藥代動力學分布的半對數圖。
圖8是以A549細胞/EMCV測定測量的Infergen、PEG-Alfacon-1、PEG-Intron和Pegasys的抗病毒活性的對數圖，活性以每毫克國際單位的活性表示，使之符合世界衛生組織(WHO)提供的人類白細胞衍生的幹擾素-α的參考標準。圖8描述了A549細胞所得結果進行的分析。
圖9是以HeLa細胞/EMCV測定測量的Infergen、PEG-Alfacon-1、PEG-Intron和Pegasys的抗病毒活性的對數圖，活性以每毫克國際單位的活性表示，使之符合世界衛生組織(WHO)提供的人類白細胞衍生的幹擾素-α的參考標準。圖9描述了用HeLa細胞所得結果進行的分析。
圖10是以ME180細胞/EMCV試驗測量的Infergen、PEG-Alfacon-1、PEG-Intron和Pegasys的抗病毒活性的對數圖，活性以每毫克國際單位的活性表示，使之符合世界衛生組織(WHO)提供的人類白細胞衍生的幹擾素-α的參考標準。圖10描述了用ME180細胞所得結果進行的分析。
圖11描述了六個受試者/組的平均PEG-alfacon血清藥代動力學分布。
圖12A和B描述了以劑量組的劑量校正Cmax(pg/ml；圖12A)和AUC0-最終(pg*h/ml；圖12B)對體重指數(BMI)值作的圖。
圖13描述了4-6個受試者的平均藥代動力學分布和相應的用1-區室模型得到的配合曲線。
圖14A-14G描述了各種劑量方案的模擬血清藥代動力學分布。在圖14A-14G中的每組使用不同的適合於1-區室模型的數據表。圖14A描述了每10天給藥60μg的劑量方案的模擬血清藥代動力學分布。圖14B描述了每10天給藥100μg的劑量方案的模擬血清藥代動力學分布。圖14C描述了每10天給藥150μg的劑量方案的模擬血清藥代動力學分布。圖14D描述了每10天給藥200μg的劑量方案的模擬血清藥代動力學分布。圖14E描述了每7天給藥100μg的劑量方案的模擬血清藥代動力學分布。圖14F描述了每7天給藥150μg的劑量方案的模擬血清藥代動力學分布。圖14G描述了每7天給藥200μg的劑量方案的模擬血清藥代動力學分布。
圖15描述了6個受試者/劑量組的血清2』，5』-寡聚腺苷酸合成酶(OAS)的平均百分率(％)的變化。每個劑量組接受的皮下PEG-alfacon的劑量圖符號中確定。以15μg皮下Infergen幹擾素alfacon-1治療組在圖符號中確定為「對照」。
圖16描述了以基線(預處理)值百分率表示，測量和預測的OAS血清值的百分率(％)變化，它來自使用最小應答固定在在0的Emax模型對平均血清分布的藥代動力學/藥效學(PK-PD)建模。
發明特徵本發明的特徵在於單PEG化的共有幹擾素(CIFN)分子由單個CIFN多肽和單個聚乙二醇(PEG)部分組成，其中聚乙二醇部分是線形、分子量約30kD並直接或間接地通過一穩定的共價鍵連接到CIFN多肽中的N-末端殘基或CIFN多肽中的賴氨酸殘基。
在一些實施方案中，PEG部分既可連接到CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基也可連接到CIFN多肽中的賴氨酸殘基的ε-氨基上。在其它實施方案中，連接包括在PEG部分與CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基之間的醯胺鍵。在另外的實施方案中，連接包括在PEG部分的丙醯基與CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基之間的醯胺鍵。在額外的實施方案中，醯胺鍵是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯與CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基縮合形成，從而在PEG部分和CIFN多肽之間形成水解穩定的連接。
在一些實施方案中，PEG部分連接到CIFN多肽中的N-末端殘基。在其它實施方案中，PEG部分連接到CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基。在另外的實施方案中，連接包括在PEG部分與CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基之間的醯胺鍵。在更另外的實施方案中，連接包括在PEG部分的丙醯基與CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基之間的醯胺鍵。在額外的實施方案中，醯胺鍵是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯與CIFN多肽的N-末端殘基的α-氨基縮合形成。
在一些實施方案中，PEG部分連接到CIFN多肽中的賴氨酸殘基上。在其它實施方案中，PEG部分連接到CIFN多肽中的賴氨酸殘基的ε-氨基。在另外的實施方案中，連接包括在PEG部分與CIFN多肽中的賴氨酸基的ε-氨基之間的醯胺鍵。還有其它一些實施方案中，連接包括在PEG部分的丙醯基與CIFN多肽中的賴氨酸基的ε-氨基之間的醯胺鍵。在額外的實施方案中，醯胺鍵是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯與CIFN多肽中的賴氨酸殘基的ε-氨基縮合形成。
在一些實施方案中，PEG部分與CIFN多肽中表面暴露的賴氨酸殘基相連。在其它實施方案中，PEG部分與CIFN多肽增加表面暴露的賴氨酸殘基的ε-氨基相連。在另外的實施方案中，連接包括在PEG部分與CIFN多肽中表面暴露的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的醯胺鍵。在更另外的實施方案中，連接包括在PEG部分的丙醯基與CIFN多肽中表面暴露的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的醯胺鍵。在額外的實施方案中，醯胺鍵是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯與CIFN多肽中表面暴露的賴氨酸殘基的ε-氨基縮合形成。
在一些實施方案中，PEG部分與CIFN多肽中選自下列的賴氨酸基相連lys31，lys50，lys71，lys84，lys121，lys122，lys134，lys135和lys165。在其它實施方案中，PEG部分與CIFN多肽中選自下列的賴氨酸殘基的ε-氨基相連lys31，lys50，lys71，lys84，lys121，lys122，lys134，lys135和lys165。在另外的實施方案中，連接包括在PEG部分與CIFN多肽中選擇的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的醯胺鍵。在更另外的實施方案中，連接包括在PEG部分的丙醯基與CIFN多肽中選擇的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的醯胺鍵。在額外的實施方案中，醯胺鍵是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯與CIFN多肽中選擇的賴氨酸殘基的ε-氨基縮合形成。
在一些實施方案中，PEG部分與CIFN多肽中選自下列的賴氨酸相連lys50，lys71，lys134，lys135和lys165。在其它實施方案中，PEG部分與CIFN多肽中選自下列的賴氨酸的ε-氨基相連lys50，lys71，lys134，lys135和lys165。在另外的實施方案中，連接包括在PEG部分與CIFN多肽中選擇的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的醯胺鍵。在更另外的實施方案中，連接包括在PEG部分的丙醯基與CIFN多肽中選擇的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的醯胺鍵。在額外的實施方案中，醯胺鍵是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯與CIFN多肽中選擇的賴氨酸殘基的ε-氨基縮合形成。
在一些實施方案中，PEG部分與CIFN多肽中選自下列的賴氨酸相連lys121，lys134，lys135和lys165。在其它實施方案中，PEG部分與CIFN多肽中選自下列的賴氨酸的ε-氨基相連lys121，lys134，lys135和lys165。在另外的實施方案中，連接包括在PEG部分與CIFN多肽中選擇的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的醯胺鍵。在更另外的實施方案中，連接包括在PEG部分的丙醯基與CIFN多肽中選擇的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的醯胺鍵。在額外的實施方案中，醯胺鍵是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯與CIFN多肽中選擇的賴氨酸殘基的ε-氨基縮合形成。
在上述的單PEG化的CIFN分子方面，本發明考慮了每個這樣的分子的實施方案，其中CIFN多肽是選自幹擾素-α-con1，幹擾素-α-con2和幹擾素-α-con3，CIFN多肽的胺基酸序列披露於美國專利號4,695,623。
本發明的特徵也在於含有一群單PEG化的共有幹擾素(CIFN)分子的組合物，其中這群分子由一種或多種分子組成，其中每種分子由單個CIFN多肽和單個PEG部分組成，其中PEG部分為線形、分子量約30kD並直接或間接地通過共價鍵連接到CIFN多肽中的N-末端殘基或賴氨酸殘基。在其它實施方案中，該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分與CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基之間的醯胺鍵。在更另外的實施方案中，該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分的丙醯基與CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基之間的醯胺鍵。在額外的實施方案中，該群分子中每一種分子的醯胺鍵是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯與CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基縮合形成。
在一些實施方案中，該群分子由一種或多種分子組成，其中每種分子由單個CIFN多肽和單個PEG部分組成，其中PEG部分為線形、分子量約30kD並直接或間接地通過共價鍵連接到CIFN多肽中的N-末端殘基或表面暴露的賴氨酸殘基。在其它實施方案中，該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分與CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基或表面暴露的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的醯胺鍵。在更另外的實施方案中，該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分的丙醯基與CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基或表面暴露的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的醯胺鍵。在額外的實施方案中，該群分子中每一種分子的醯胺鍵是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯與CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基或表面暴露的賴氨酸殘基的ε-氨基縮合形成。
在一些實施方案中，該群分子由一種或多種分子組成，其中每種分子由單個CIFN多肽和單個PEG部分組成，其中PEG部分為線形、分子量約30kD並直接或間接地通過共價鍵連接到CIFN多肽中的N-末端殘基或選自下列的賴氨酸殘基lys31，lys50，lys71，lys84，lys121，lys122，lys134，lys135和lys165。在其它實施方案中，該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分與CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基之間的醯胺鍵。在更另外的實施方案中，該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分的丙醯基與CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基之間的醯胺鍵。在額外的實施方案中，該群分子中每一種分子的醯胺鍵是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯與CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基縮合形成。
在一些實施方案中，該群分子由一種或多種分子組成，其中每種分子由單個CIFN多肽和單個PEG部分組成，其中PEG部分為線形、分子量約30kD並直接或間接地通過共價鍵連接到CIFN多肽中的N-末端殘基或選自下列的賴氨酸殘基lys50，lys71，lys134，lys135和lys165。在其它實施方案中，該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分與CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基之間的醯胺鍵。在更另外的實施方案中，該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分的丙醯基與CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基之間的醯胺鍵。在額外的實施方案中，該群分子中每一種分子的醯胺鍵是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯與CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基縮合形成。
在一些實施方案中，該群分子由一種或多種分子組成，其中每種分子由單個CIFN多肽和單個PEG部分組成，其中PEG部分為線形、分子量約30kD並直接或間接地通過共價鍵連接到CIFN多肽中的N-末端殘基或選自下列的賴氨酸殘基lys121，lys134，lys135和lys165。在其它實施方案中，該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分與CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基之間的醯胺鍵。在更另外的實施方案中，該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分的丙醯基與CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基之間的醯胺鍵。在額外的實施方案中，該群分子中每一種分子的醯胺鍵是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯與CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基縮合形成。
在一些實施方案中，該群分子由一種或多種單PEG化的CIFN組成，其中PEG部分連接到CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基。在其它實施方案中，在該群分子的每一種分子中，PEG部分連接到CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基上。在另外的實施方案中，該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分與CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基之間的醯胺鍵。在更另外的實施方案中，該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分的丙醯基與CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基之間的醯胺鍵。在額外的實施方案中，該群分子中每一種分子的醯胺鍵是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯與CIFN多肽的N-末端殘基的α-氨基縮合形成。
在一些實施方案中，該群分子由一種或多種單PEG化的CIFN組成，其中PEG部分連接到CIFN多肽中的賴氨酸殘基。在其它實施方案中，在該群分子的每一種分子中，PEG部分連接到CIFN多肽中的賴氨酸殘基的ε-氨基上。在另外的實施方案中，在該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分與CIFN多肽的賴氨酸殘基的ε-氨基上之間的醯胺鍵。還有其它一些實施方案中，在該群分子中每一類分子的連接包括在PEG部分的丙醯基與CIFN多肽的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的醯胺鍵。在額外的實施方案中，在該群分子中每一類分子的醯胺鍵是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯與CIFN多肽中的賴氨酸殘基的ε-氨基縮合形成。
在一些實施方案中，該群分子由一種或多種單PEG化的CIFN組成，其中PEG部分與CIFN多肽中表面暴露的賴氨酸殘基相連。在其它實施方案中，該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分與CIFN多肽中表面暴露的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的醯胺鍵。在更另外的實施方案中，該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分的丙醯基與CIFN多肽中表面暴露的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的醯胺鍵。在額外的實施方案中，該群分子中每一種分子的醯胺鍵是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯與CIFN多肽這中表面暴露的賴氨酸殘基的ε-氨基縮合形成。
在一些實施方案中，該群分子由一種或多種單PEG化的CIFN組成，其中PEG部分與CIFN多肽中選自下列的賴氨酸殘基相連lys31，lys50，lys71，lys84，lys121，lys122，lys134，lys135和lys165。在其它實施方案中，在該群分子的每一種分子中，PEG部分與CIFN多肽中選自下列的賴氨酸的ε-氨基相連lys31，lys50，lys71，lys84，lys121，lys122，lys134，lys135和lys165。在另外的實施方案中，該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分與CIFN多肽中選擇的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的醯胺鍵。在更另外的實施方案中，該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分的丙醯基與CIFN多肽中選擇的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的醯胺鍵。在額外的實施方案中，該群分子中每一種分子的醯胺鍵是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯與CIFN多肽中選擇的賴氨酸殘基的ε-氨基縮合形成。
在一些實施方案中，該群分子由一種或多種單PEG化的CIFN組成，其中PEG部分與CIFN多肽中選自下列的賴氨酸殘基相連lys50，lys71，lys134，lys135和lys165。在其它實施方案中，在該群分子的每一種分子中，PEG部分與CIFN多肽中選自下列的賴氨酸殘基的ε-氨基相連lys50，lys71，lys134，lys135和lys165。在另外的實施方案中，該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分與CIFN多肽中選擇的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的醯胺鍵。還有其它一些實施方案中，該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分的丙醯基與CIFN多肽中選擇的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的醯胺鍵。在額外的實施方案中，該群分子中每一種分子的醯胺鍵是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯與CIFN多肽中選擇的賴氨酸殘基的ε-氨基縮合形成。
在一些實施方案中，該群分子由一種或多種單PEG化的CIFN組成，其中PEG部分與CIFN多肽中選自下列的賴氨酸殘基相連lys121，lys134，lys135和lys165。在其它實施方案中，在該群分子的每一種分子中，PEG部分與CIFN多肽中選自下列的賴氨酸殘基的ε-氨基相連lys121，lys134，lys135和lys165。在另外的實施方案中，該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分與CIFN多肽中選擇的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的醯胺鍵。還有其它一些實施方案中，該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分的丙醯基與CIFN多肽中選擇的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的醯胺鍵。在額外的實施方案中，該群分子中每一種分子的醯胺鍵是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯與CIFN多肽中選擇的賴氨酸殘基的ε-氨基縮合形成。
在上述的每一種由包含與CIFN多肽的N-末端殘基或賴氨酸殘基相連的PEG部分的單聚乙二醇化CIFN分子組成的分子群方面，本發明考慮了以下分子群的實施方案即該分子群由第一個和第二個單PEG化的CIFN分子組成，其中第一個單PEG化的CIFN分子所含的PEG部分與第一個CIFN多肽中的N-末端殘基相連，而第二個單PEG化的CIFN分子所含的PEG部分與第二個CIFN多肽中的賴氨酸殘基相連，並且其中第一個和第二個CIFN多肽可以相同或不同。
在上述的每一種由包含與CIFN多肽的N-末端殘基或賴氨酸殘基相連的PEG部分的單聚乙二醇化CIFN分子組成的分子群方面，本發明考慮了以下分子群的實施方案即該分子群由第一個、第二個和第三個單PEG化的CIFN分子組成，其中第一個單PEG化的CIFN分子所含的PEG部分與第一個CIFN多肽中的N-末端殘基相連，第二個單PEG化的CIFN分子所含的PEG部分與第二個CIFN多肽中的第一個賴氨酸殘基相連，第三個單PEG化的CIFN分子所含的PEG部分與第三個CIFN多肽中的第二個賴氨酸殘基相連，其中第一個、第二個和第三個CIFN多肽可以相同或不同，而第二個CIFN多肽中連接點的位置與第三個CIFN多肽中連接點的位置不相同。
在上述的每一種由包含與CIFN多肽的N-末端殘基或賴氨酸殘基相連的PEG部分的單聚乙二醇化CIFN分子組成的分子群方面，本發明考慮了以下分子群的實施方案即該分子群由第一個、第二個、第三個和第四個單PEG化的CIFN分子組成，其中第一個單PEG化的CIFN分子所含的PEG部分與第一個CIFN多肽中的N-末端殘基相連，第二個單PEG化的CIFN分子所含的PEG部分與第二個CIFN多肽中的第一個賴氨酸殘基相連，第三個單PEG化的CIFN分子所含的PEG部分與第三個CIFN多肽中的第二個賴氨酸殘基相連，第四個單PEG化的CIFN分子所含的PEG部分與第四個CIFN多肽中的第三個賴氨酸殘基相連，其中第一個、第二個、第三個和第四個CIFN多肽可與任何其它CIFN多肽相同或不同，而在第二個、第三個和第四個CIFN多肽中連接點的位置也與任何其它CIFN多肽中的連接點的位置不相同。
在上述的每一種由包含與CIFN多肽的N-末端殘基或賴氨酸殘基相連的PEG部分的單聚乙二醇化CIFN分子組成的分子群方面，本發明考慮了以下分子群的實施方案即該分子群由第一個、第二個、第三個、第四個和第五個單PEG化的CIFN分子組成，其中第一個單PEG化的CIFN分子所含的PEG部分與第一個CIFN多肽中的N-末端殘基相連，第二個單PEG化的CIFN分子所含的PEG部分與第二個CIFN多肽中的第一個賴氨酸殘基相連，第三個單PEG化的CIFN分子所含的PEG部分與第三個CIFN多肽中的第二個賴氨酸殘基相連，第四個單PEG化的CIFN分子所含的PEG部分與第四個CIFN多肽中的第三個賴氨酸殘基相連，第五個單PEG化的CIFN分子所含的PEG部分與第五個CIFN多肽中的第四個賴氨酸殘基相連，其中第一個、第二個、第三個、第四個和第五個CIFN多肽可與任何其它CIFN多肽相同或不同，而在第二個、第三個、第四個和第五個CIFN多肽中連接點的位置也與任何其它CIFN多肽的連接點的位置不相同。
在上述的每一種由包含與CIFN多肽的N-末端殘基或賴氨酸殘基相連的PEG部分的單聚乙二醇化CIFN分子組成的分子群方面，本發明考慮了以下分子群的實施方案即該分子群由第一個、第二個、第三個、第四個、第五個和第六個單PEG化的CIFN分子組成，其中第一個單PEG化的CIFN分子所含的PEG部分與第一個CIFN多肽中的N-末端殘基相連，第二個單PEG化的CIFN分子所含的PEG部分與第二個CIFN多肽中的第一個賴氨酸殘基相連，第三個單PEG化的CIFN分子所含的PEG部分與第三個CIFN多肽中的第二個賴氨酸殘基相連，第四個單PEG化的CIFN分子所含的PEG部分與第四個CIFN多肽中的第三個賴氨酸殘基相連，第五個單PEG化的CIFN分子所含的PEG部分與第五個CIFN多肽中的第四個賴氨酸殘基相連，第六個單PEG化的CIFN分子所含的PEG部分與第六個CIFN多肽中的第五個賴氨酸殘基相連，其中第一個、第二個、第三個、第四個、第五個和第六個CIFN多肽可與任何其它CIFN多肽相同或不同，而在第二個、第三個、第四個、第五個和第六個CIFN多肽中連接點的位置也與任何其它CIFN多肽的連接點的位置不相同。
在上述的每一中包含與CIFN多肽的賴氨酸殘基相連的PEG部分的單聚乙二醇化CIFN分子組成的分子群方面，本發明考慮的實施方案的特徵在於許多種類的單聚乙二醇化、賴氨酸衍生的CIFN分子，其中每一種的特徵在於連接點與其它任何種類的連接點不相同，該方式與上述包括單聚乙二醇化、N-末端衍生的CIFN分子的群體的實施方案類似。尤其是本發明的實施方案的特徵在於許多種類的單聚乙二醇化、賴氨酸衍生的CIFN分子可通過修改與上述包括單聚乙二醇化、N-末端衍生的CIFN分子的群體有關的實施方案，去除其中所含的N-末端衍生種類得到。
在上述的每一種單聚乙二醇化CIFN分子群體方面，本發明考慮的實施方案在於每個分子群體中的分子含有選自幹擾素α-con1、幹擾素α-con2和幹擾素α-con3的CIFN多肽。
本發明另外的特徵在於用CIFN多肽與線形、分子量約為30kD的α-甲氧基、ω-丙醯基聚乙二醇的琥珀醯亞胺酯(mPEGspa)反應的方法產生的產物，其中反應物最初以CIFN∶mPEGspa的摩爾比為約1∶1到1∶5存在，反應在pH約7到9進行，然後回收反應的單PEG化的CIFN產物。在一實施方案中，反應物最初以CIFN∶mPEGspa的摩爾比為約1∶3存在，反應在pH約8進行。在另一實施方案中，本發明產品由需要毒理學和臨床研究的、放大的方法生產，反應物最初以CIFN∶mPEGspa的摩爾比為約1∶2存在，反應在pH約8.0進行。
在上述的產物生產方法方面，本發明考慮的實施例在於CIFN反應物是選自幹擾素α-con1、幹擾素α-con2和幹擾素α-con3。
在一些方面，本發明的單PEG化的CIFN分子或群體表現出比批准的治療慢性C型肝炎的市場產品PEGASAYSPEG-幹擾素-α2a至少大10倍的抗病毒活性。在其它方面，本發明的單PEG化的CIFN分子或群體表現出與INFERGEN的Alfacon-1大致相同的抗病毒活性。
本發明額外的特徵在於含有上述的這種分子的任何單PEG化的CIFN分子或分子群體的藥學組合物和藥學上可接受的載體。在一些實施方案中，該藥學組合物包含本發明單PEG化的CIFN分子或群體的量可在患者中有效地治療病毒疾病。在其它實施方案中，該藥學組合物包含本發明單PEG化的CIFN分子或群體的量可在患者中有效地治療肝炎病毒疾病。在其它實施方案中，該藥學組合物包含的本發明單PEG化的CIFN分子或群體的量可在患者中有效地治療C型肝炎病毒(HCV)疾病。
定義用於文中的術語「治療」「治療的」等指獲得所需要的藥理或生理學效果。按照完全或部分阻止疾病或症狀，該效果是預防性的和/或按照部分或完全治癒疾病和/或可歸因於疾病的負作用，該效果是治療性的。用在文中的「治療」包含在哺乳動物，特別是在人中治療疾病，並且包括(a)阻止疾病或在易患疾病但尚未診斷出現的疾病症狀(例如包括與原發性疾病相關或由其導致的疾病(如可導致慢性HCV感染的肝纖維變性))；(b)抑制疾病，即阻止其發展；和(c)緩解疾病，即導致疾病消退。
術語「個體」、「宿主」、「受試者」和「患者」可在文中互換使用，並指哺乳動物，包括但不限於靈長類動物(包括猿和人)。
用在文中的術語「藥代動力學分布」指在向受試者給予IFN-α後，將IFN-α的血清濃度對時間作圖得到的曲線分布。「曲線下的面積」或「AUC」指在向受試者給予IFN-α後，將IFN-α的血清濃度對時間作圖產生的曲線下的積分面積。
術語「肝炎病毒感染」指甲型、乙型、丙型、丁型或戊型肝炎病毒中一種或多種的感染，血液傳播的肝炎病毒感染是尤其令人感興趣的，特別是C型肝炎病毒感染。
在進一步描述本發明之前，要了解的是本發明並不限於所描述的特定的實施方案，這種實施方案當然是可以變化的。還需要了解的是既然本發明的範圍僅受附加的權利要求限制，用在文中的術語僅是為了描述特定的實施方案而非限制性的。
在提供值的範圍的地方，應了解在該範圍上下限之間的每個插入值(除非文中另有明確規定，該插入值到下限單位的十分之一)和在所述範圍中任何其它規定的值或插入值均包括在本發明內。以在規定的範圍內任何具體的排它性限制為條件，這些小範圍的上下限可以獨立地包括在該小範圍內並包括於本發明。在規定的範圍包括限制的一個或兩個時，排除包括限制的一個或兩個的範圍也包括在本發明內。
除非另有定義，所有文中所用的技術和科學術語均與本發明所屬技術領域的普通技術人員通常理解的意思相同。雖然任何類似或等同于于文中所描述的方法和材料均可用於實踐和測試本發明，優選的方法和材料是現在描述的。文中提及的所有出版物均納入本文作為參考來披露和描述與所引用的出版物有關的方法和/或材料。
必須注意的是，除非文中另有明確規定，用在文中和附加的權利要求中的單數形式「一個」、「和」與「該」均包括複數對象。因此，例如「一修飾的IFN-α多肽」包括許多這種多肽，「一PEG分子」包括參考一個或多個PEG分子和本領域技術人員所知道的其等效物等等。
文中提供討論的出版物僅是因為其公開早於本申請的提交日。不應認為由於在先發明而使本發明不具資格先於這種出版物。此外，所提供的出版物日期可能與實際發表日期不符，這需要獨立地證實。
發明詳述本發明提供線形聚乙二醇(PEG)修飾的IFN-α。特別是本發明提供與單個PEG分子相連的IFN-α多肽(即，IFN-α多肽是「單PEG化的」)。本發明的PEG修飾的IFN-α的藥代動力學分布是其有效地治療病毒感染，特別是肝炎病毒感染。因此，本發明進一步提供了治療肝炎病毒感染的方法。這些方法一般包括向感染或易於感染肝炎病毒的個人施用加有效量的PEG-修飾的IFN-α。
PEG-修飾的IFN-α本發明提供用平均分子量小於約40kD的聚乙二醇(PEG)分子修飾的IFN-α。本發明特別提供與小於約40kD的PEG單分子相連的IFN-α多肽，與約30kD的PEG分子相連是尤其有興趣的，更特別是線形30kD的PEG分子與IFN-α相連，與CIFN相連也是特別令人感興趣的。
IFN-α用在文中的術語「幹擾素-α」指抑制病毒複製、細胞增殖和調節免疫應答的相關多肽的一族。術語「IFN-α」包括天然產生、非天然產生IFN-α多肽和保留親本天然產生或非天然產生IFN-α的抗病毒活性的天然產生、非天然產生IFN-α類似物。
合適的α幹擾素包括，但不限於天然產生的IFN-α(包括，但不限於自然存在的IFN-α2a、IFN-α2b)；重組幹擾素-α2b，例如獲得自Schering公司(Kenilworth，N.J.)的IntronA幹擾素；重組幹擾素-α2a，例如獲得自Hoffmann-La Roche(Nutley，N.J.)的Roferon幹擾素；重組幹擾素-α2c，例如獲得自Boehringer IngelheimPharmaceutical，Inc.(Ridgefield，Coma.)的Beroforα2幹擾素；幹擾素-αn1，即天然α幹擾素的純化混合物，例如獲得自Sumitomo(Japan)的Sumiferon或Glaxo-Wellcome Ltd.，London，Great Britain的WellferonS幹擾素α-n1(INS)；和由Interferon Sciences生產獲得自Purdue Frederick Co.，Norwalk，Conn.商品名為Alferon的天然α幹擾素的幹擾素α-n3混合物。
用在文中的術語「IFN-α」也包括共有IFN-α。用在文中的術語「共有IFN-α」指非天然產生的多肽，包括對所有天然產生的人白細胞IFN-α亞型序列而言常見的那些胺基酸殘基和包括主要出現在一個或多個不存在對於所有亞型常見的胺基酸的位置的胺基酸，只要該多肽在不存在對所有亞型常見的胺基酸的位置排斥任何不存在於至少一種天然產生的亞型中的胺基酸殘基。對所有天然產生的人白細胞IFN-α亞型序列常見的胺基酸殘基(「常見胺基酸殘基」)和主要出現在非常見殘基的胺基酸殘基(「共有胺基酸殘基」)是本領域已知的。圖1為IFN-αcon1的胺基酸序列。因此，共有幹擾素是全合成的I型幹擾素，它是通過掃描幾個幹擾素-α非等位亞型並將最頻繁觀察到的胺基酸安排在各位置而開發的。
共有IFN-α(也指「CIFN」、「IFN-con」和「IFN-αcon」)包括，但不限於命名為IFN-con1(有時指「CIFN-αcon1」、「IFN-αcon1」或「IFN-con1」或「αcon」)，IFN-con2和IFN-con3(見美國專利號4,695,623和4,897,471)和Infergen(Amegen，ThousandOaks，Calif.)的胺基酸序列。共有幹擾素一般通過確定天然產生的幹擾素α的共有序列來限定。在一些實施方案中，PEG-修飾的CIFN，特別是Infergen是特別有興趣的。
IFN-α多肽可用任何已知的方法生產。編碼IFN-con的DNA序列可由上述專利或其它標準方法合成。在許多實施方案中，IFN-α多肽是轉化或轉染入細菌宿主例如大腸桿菌或真核宿主細胞(例如，酵母菌、哺乳動物細胞，例如CHO細胞等)的製造DNA序列的表達產品。在這些實施方案中，IFN-α是「重組IFN-α」。當宿主細胞是細菌宿主細胞時，IFN-α修飾為含有N-末端甲硫氨酸。在大腸桿菌中生產的IFN-α一般通過本領域技術人員已知的過程純化，IFN-con1的純化一般描述於Klein等((1988)J.Chromatog.454205-215)。
細菌產生的IFN-α可含有與N-末端胺基酸殘基有關的同種型的混合物。例如，純化的IFN-con可含有與N-末端甲硫氨酸狀況有關的同種型的混合物。例如，在一些實施方案中，IFN-con含有N-末端甲硫氨醯IFN-con，N末端未封閉的脫甲硫氨醯IFN-con和具有封閉的N末端的脫甲硫氨醯IFN-con的混合物。含有甲硫氨醯IFN-con1，脫甲硫氨醯IFN-con1和具有封閉的N末端的脫甲硫氨醯IFN-con1的混合物的純化的IFN-con1作為一非限制性例子，Klein等((1990)Arch.Biochemistry Biophys.276531-537)。此外，IFN-con可含有特定的、分離的同種型。IFN-con的同種型可用本領域技術人員所已知的技術，例如等電聚焦來相互分離。
需要了解的是文中描述的IFN-α含有一種或多種修飾的胺基酸殘基，例如糖基化，化學修飾等。
連接位點PEG既可直接偶合(即，無連接基團)，也可通過一接頭(如下所詳述的)偶合到IFN-α多肽上的氨基基團。
在一些實施方案中，PEG化的IFN-α是在IFN-α多肽的氨基末端(N-末端)或接近氨基末端PEG化的，例如，PEG部分結合到IFN-α多肽的從胺基酸1到胺基酸4的胺基酸殘基上，或從胺基酸5到約10。
在其它的實施方案中，PEG化的IFN-α是在胺基酸殘基從約10到28PEG化的。
在其它的實施方案中，PEG化的IFN-α是在胺基酸殘基從100到114PEG化的。
在感興趣的特定實施方案中，當IFN-α是CIFN時，PEG分子連接到CIFN多肽的NH2末端胺基酸殘基。在這些實施方案中，PEG部分是具有平均分子量約30kD的線形PEG部分。
在一些實施方案中，PEG化的IFN-α含有在賴氨酸殘基的ε-氨基PEG化的CIFN。圖1是顯示了賴氨酸殘基的位置的示範性的IFN-α的胺基酸序列。
PEG部分一般連接到表面暴露的賴氨酸(「lys」)殘基。賴氨酸是否暴露於表面可用任何已知的方法確定。一般而言，親水性分析(例如，Kyte-Doolittle和Hoppe-Woods分析)和/或用合適的電腦程式對表面形成區域進行預測(例如，Emini表面形成概率分析)是本領域技術人員所熟知的。合適的電腦程式包括PeptideStructure等。此外，由於在NMR圖譜中特定官能團的質子的化學位移，NMR研究可鑑定表面可接近的殘基和它們是如何受包括的「移位試劑」的影響。在其它情況中，殘基與溶劑或環境的不可接近性或可接近性可由螢光來評估。還有在其它的情況中，可接近賴氨酸的表面暴露情況可由其與水溶性試劑(例如，三硝基苯磺酸酯或TNBS)的化學反應性來確認。
在一些實施方案中，本發明提供PEG-修飾的CIFN，其中PEG部分與選自下列的賴氨酸殘基相連lys31，lys50，lys71，lys84，lys121，lys122，lys134，lys135和lys165。在這些實施方案中，PEG部分是平均分子量約30kD的線形PEG部分。
在其它的實施方案中，本發明提供PEG-修飾的CIFN，其中PEG部分與選自下列的賴氨酸殘基相連lys50，lys71，lys134，lys135和lys165。在這些實施方案中，PEG部分是平均分子量約30kD的線形PEG部分。
在其它的實施方案中，本發明提供PEG-修飾的CIFN，其中PEG部分與選自下列的賴氨酸殘基相連lys121，lys134，lys135和lys165。在這些實施方案中，PEG部分是平均分子量約30kD的線形PEG部分。
IFN-α的群體本發明進一步提供含有單PEG化的IFNα分子群體的組合物，其中該群體由一種或多種上述的單PEG化的IFNα分子組成。如上所述，本發明的PEG修飾的IFNα在每個IFN-α多肽分子中含有單個PEG分子。在一些實施方案中，一主題組合物含有修飾的IFN-α多肽群體，各具有連接到多肽的單個胺基酸殘基的單個PEG分子。
在這些實施方案中，該群體含有在與第一個胺基酸殘基上的PEG分子相連的第一個IFN-α多肽和至少一個在第二個胺基酸殘基上的PEG分子相連的第二個IFN-α多肽的混合物，其中第一個和第二個IFN-α多肽可以相同或不同，並且在第一個IFN-α多肽的胺基酸序列中的第一個胺基酸殘基的位置不同於在第二個IFN-α多肽的胺基酸序列中的第二個胺基酸殘基的位置。含有在其氨基末端連接有線形PEG分子的PEG-修飾的IFN-α多肽群體和在其賴氨酸殘基上連接有PEG分子的IFN-α多肽的主題組合物可作為非限制性例子。
總體上，一給定的修飾的IFN-α種類代表在一群體中的所有單PEG化的IFNα多肽分子群中約佔0.5％到99.5％，例如一給定的修飾的IFN-α種類代表在一群體中所有單PEG化的IFN-α多肽分子群約佔0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％。在一些實施方案中，主題組合物含有單PEG化的IFN-α多肽群體，該群體含有至少約70％、80％、90％、95％或至少99％IFN-α多肽在同一部位連接PEG，例如在N-末端胺基酸。
在感興趣的特殊實施方案中，主題組合物含有單PEG化的CIFN分子群，群體由一種或多種分子組成，其中每種分子是單個CIFN多肽直接或間接地共價連接到分子量約30kD的單個線形PEG部分，並且既可以連接到CIFN多肽中的賴氨酸殘基又可連接到CIFN多肽的N-末端胺基酸殘基。
在許多實施方案中，與PEG相連的胺基酸殘基是N-末端胺基酸殘基。在其它實施方案中，PEG部分是連接(直接或通過接頭)到表面暴露的賴氨酸殘基。在另外的實施方案中，PEG部分是連接(直接或通過接頭)到選自下列的CIFN多肽的賴氨酸殘基lys31，lys50，lys71，lys84，lys121，lys122，lys134，lys135和lys165。在進一步的實施方案中，PEG部分是連接(直接或通過連接物)到選自下列的CIFN多肽的賴氨酸殘基上lys50，lys71，lys134，lys135和lys165。在另外的的實施方案中，PEG部分是連接(直接或通過接頭)到選自下列的CIFN多肽的賴氨酸殘基lys121，lys134，lys135和lys165。
作為例子，主題組合物含有單PEG化CIFN多肽分子群由第一種和第二種單PEG化的CIFN多肽組成，其中具有PEG部分的第一種單PEG化的CIFN多肽與第一個CIFN多肽的N-末端胺基酸殘基相連，而具有PEG部分的第二種單PEG化的CIFN多肽與第二個CIFN多肽的第一個賴氨酸殘基相連，其中第一個和第二個CIFN多肽可以相同或不同。主題組合物可進一步含有至少一種額外的具有PEG部分的單PEG化的CIFN多肽與CIFN多肽中的賴氨酸殘基相連，其中在每種額外的單PEG化的CIFN多肽中連接位點的位置與任何其它種類的連接位點的位置不相同。該例子的所有種類中，PEG部分是具有平均分子量約30kD的線形PEG部分。
作為另一個例子，主題組合物含有的單PEG化CIFN多肽分子群由第一種和第二種單PEG化的CIFN多肽組成，其中具有PEG部分的第一種單PEG化的CIFN多肽與第一個CIFN多肽的N-末端胺基酸殘基相連，而具有PEG部分的第二種單PEG化的CIFN多肽與第二個CIFN多肽的第一個表面暴露的賴氨酸殘基相連，其中第一個和第二個CIFN多肽可以相同或不同。主題組合物可進一步含有至少一種額外的具有PEG部分的單PEG化的CIFN多肽與CIFN多肽的暴露於表面的賴氨酸殘基相連，其中在每種額外的單PEG化的CIFN多肽中連接位點的位置與任何其它種類的連接位點的位置不相同。該例子的所有種類中，PEG部分是具有平均分子量約30kD的線形PEG部分。
作為另一個例子，主題組合物含有單PEG化CIFN多肽分子群由第一種和第二種單PEG化的CIFN多肽組成，其中具有PEG部分的第一種單PEG化的CIFN多肽與第一個CIFN多肽的N-末端胺基酸殘基相連，而具有PEG部分的第二種單PEG化的CIFN多肽與第二個CIFN多肽的選自下列之一的第一個賴氨酸殘基相連lys31，lys50，lys71，lys84，lys121，lys122，lys134，lys135和lys165，其中第一個和第二個CIFN多肽可以相同或不同。主題組合物可進一步含有具有PEG部分的第三種單PEG化的CIFN多肽與第三個CIFN多肽中的選自下列之一的第二個賴氨酸殘基相連lys31，lys50，lys71，lys84，lys121，lys122，lys134，lys135和lys165，而第三個CIFN多肽可以與第一個和第二個CIFN多肽相同或不相同，其中第三個CIFN多肽的胺基酸序列中的第二個賴氨酸殘基的位置與第二個CIFN多肽的胺基酸序列中的第一個賴氨酸殘基的位置不同。主題組合物可進一步含有至少一種額外的具有PEG部分的單PEG化的CIFN多肽與選自下列之一的賴氨酸相連lys31，lys50，lys71，lys84，lys121，lys122，lys134，lys135和lys165，其中在每種額外的單PEG化的CIFN多肽中連接位點的位置與任何其它種類的連接位點的位置不同。該例子的所有種類中，PEG部分是具有平均分子量約30kD的線形PEG部分。
作為另一個例子，主題組合物含有單PEG化CIFN多肽分子群由第一種和第二種單PEG化的CIFN多肽組成，其中具有PEG部分的第一種單PEG化的CIFN多肽與第一個CIFN多肽的N-末端胺基酸殘基相連，而具有PEG部分的第二種單PEG化的CIFN多肽與第二個CIFN多肽中的選自下列之一的第一個賴氨酸殘基相連lys50，lys71，lys134，lys135和lys165，其中第一個和第二個CIFN多肽可以相同或不同。主題組合物可進一步含有具有PEG部分的第三種單PEG化的CIFN多肽與第三個CIFN多肽中的選自下列之一的第二個賴氨酸殘基相連lys50，lys71，lys134，lys135和lys165，而第三個CIFN多肽可以與第一個和第二個CIFN多肽相同或不相同，其中第三個CIFN多肽的胺基酸序列中的第二個賴氨酸殘基的位置與第二個CIFN多肽的胺基酸序列中的第一個賴氨酸殘基的位置不相同。主題組合物可進一步含有至少一個額外的具有PEG部分的單PEG化的CIFN多肽與選自下列之一的賴氨酸相連lys50，lys71，lys134，lys135和lys165，其中在每種額外的單PEG化的CIFN多肽中連接位點的位置與任何其它種類的連接位點的位置不同。該例子的所有種類中，PEG部分是具有平均分子量約30kD的線形PEG部分。
作為另一個例子，主題組合物含有單PEG化CIFN多肽分子群由第一種和第二種單PEG化的CIFN多肽組成，其中具有PEG部分的第一種單PEG化的CIFN多肽與第一個CIFN多肽的N-末端胺基酸殘基相連，而具有PEG部分的第二種單PEG化的CIFN多肽與第二個CIFN多肽中的選自下列之一的第一個賴氨酸殘基相連lys121，lys134，lys135和lys165，其中第一個和第二個CIFN多肽可以相同或不同。主題組合物可進一步含有具有PEG部分的第三種單PEG化的CIFN多肽與第三個CIFN多肽中的選自下列之一的第二個賴氨酸殘基相連lys121，lys134，lys135和lys165，而第三個CIFN多肽可以與第一個和第二個CIFN多肽相同或不相同，其中第三個CIFN多肽的胺基酸序列中的第二個賴氨酸殘基的位置與第二個CIFN多肽的胺基酸序列中的第一個賴氨酸殘基的位置不相同。主題組合物可進一步含有至少一種額外的具有PEG部分的單PEG化的CIFN多肽與選自下列之一的賴氨酸相連lys121，lys134，lys135和lys165，其中在每種額外的單PEG化的CIFN多肽中連接位點的位置與任何其它種類的連接位點的位置不同。該例子的所有種類中，PEG部分是具有平均分子量約30kD的線形PEG部分。
作為另一個非限制性例子，主題組合物含有單PEG化CIFN多肽分子群由第一種和第二種單PEG化的CIFN多肽組成，其中具有PEG部分的第一種單PEG化的CIFN多肽與第一個CIFN多肽中的第一個賴氨酸殘基相連，具有PEG部分的第二種單PEG化的CIFN多肽與第二個CIFN多肽中的第二個賴氨酸殘基相連，第一個和第二個CIFN多肽可以相同或不同，其中在第一個CIFN多肽的胺基酸序列中的第一個賴氨酸的位置與第二個CIFN多肽的胺基酸序列中的第二個賴氨酸的位置不向同。主題組合物可進一步含有至少一種額外的具有PEG部分的單PEG化的CIFN與CIFN多肽的賴氨酸殘基相連，其中在每種額外的單PEG化的CIFN多肽中連接位點的位置與任何其它種類的連接位點的位置不相同。該例子的所有種類中，PEG部分是具有平均分子量約30kD的線形PEG部分。
作為另一個非限制性例子，主題組合物含有單PEG化CIFN多肽分子群由第一種和第二種單PEG化的CIFN多肽組成，其中具有PEG部分的第一種單PEG化的CIFN多肽與第一個CIFN多肽中的選自下列之一的第一個賴氨酸殘基相連lys31，lys50，lys71，lys84，lys121，lys122，lys134，lys135和lys165，具有PEG部分的第二種單PEG化的CIFN多肽與第二個CIFN多肽中的選自下列之一的第二個賴氨酸殘基相連lys31，lys50，lys71，lys84，lys121，lys122，lys134，lys135和lys165，其中第一個和第二個CIFN多肽可以相同或不同，並且在第二個CIFN多肽的胺基酸序列中的第二個賴氨酸殘基的位置與第一個CIFN多肽中的第一個賴氨酸殘基的位置不相同。組合物可進一步含有至少一種額外的具有PEG部分的單PEG化的CIFN多肽與選自下列之一的賴氨酸相連lys31，lys50，lys71，lys84，lys121，lys122，lys134，lys135和lys165，其中在每種額外的單PEG化的CIFN多肽中連接位點的位置與任何其它種類的連接位點的位置不同。該例子的所有種類中，PEG部分是具有平均分子量約30kD的線形PEG部分。
作為另一個非限制性例子，主題組合物含有單PEG化CIFN多肽分子群由第一種和第二種單PEG化的CIFN多肽組成，其中具有PEG部分的第一種單PEG化的CIFN多肽與第一個CIFN多肽中的選自下列之一的第一個賴氨酸殘基相連lys31，lys50，lys71，lys84，lys121，lys122，lys134，lys135和lys165，具有PEG部分的第二種單PEG化的CIFN多肽與第二個CIFN多肽中的選自下列之一的第二個賴氨酸殘基相連lys31，lys50，lys71，lys84，lys121，lys122，lys134，lys135和lys165，其中第一個和第二個CIFN多肽可以相同或不同，並且在第二個CIFN多肽的胺基酸序列中的第二個賴氨酸殘基的位置與第一個CIFN多肽中的第一個賴氨酸殘基的位置不相同。組合物可進一步含有至少一種額外的具有PEG部分的單PEG化的CIFN多肽與選自下列之一的賴氨酸相連lys31，lys50，lys71，lys84，lys121，lys122，lys134，lys135和lys165，其中在每種額外的單PEG化的CIFN多肽中連接位點的位置與任何其它種類的連接位點的位置不相同。該例子的所有種類中，PEG部分是具有平均分子量約30kD的線形PEG部分。
作為另一個非限制性例子，主題組合物含有單PEG化CIFN多肽分子群由第一種和第二種單PEG化的CIFN多肽組成，其中具有PEG部分的第一種單PEG化的CIFN多肽與第一個CIFN多肽中的選自下列之一的第一個賴氨酸殘基相連lys50，lys71，lys134，lys135和lys165，具有PEG部分的第二種單PEG化的CIFN多肽與第二個CIFN多肽中的選自下列之一的第二個賴氨酸殘基相連lys50，lys71，lys134，lys135和lys165，其中第一個和第二個CIFN多肽可以相同或不同，並且在第二個CIFN多肽的胺基酸序列中的第二個賴氨酸殘基的位置與第一個CIFN多肽中的第一個賴氨酸殘基的位置不相同。組合物可進一步含有至少一種額外的具有PEG部分的單PEG化的CIFN多肽與選自下列之一的賴氨酸相連lys50，lys71，lys134，lys135和lys165，其中在每種額外的單PEG化的CIFN多肽中連接位點的位置與任何其它種類的連接位點的位置不相同。該例子的所有種類中，PEG部分是具有平均分子量約30kD的線形PEG部分。
作為另一個非限制性例子，主題組合物含有的單PEG化CIFN多肽分子群由第一種和第二種單PEG化的CIFN多肽組成，其中具有PEG部分的第一種單PEG化的CIFN多肽與第一個CIFN多肽中的選自下列之一的第一個賴氨酸殘基相連lys121，lys134，lys135和lys165，具有PEG部分的第二種單PEG化的CIFN多肽與第二個CIFN多肽中的選自下列之一的第二個賴氨酸殘基相連lys121，lys134，lys135和lys165，其中第一個和第二個CIFN多肽可以相同或不同，並且在第二個CIFN多肽的胺基酸序列中的第二個賴氨酸殘基的位置與第一個CIFN多肽中的第一個賴氨酸殘基的位置不相同。組合物可進一步含有至少一種額外的具有PEG部分的單PEG化的CIFN多肽與選自下列之一的賴氨酸相連lys121，lys134，lys135和lys165，其中在每種額外的單PEG化的CIFN多肽中連接位點的位置與任何其它種類的連接位點的位置不相同。該例子的所有種類中，PEG部分是具有平均分子量約30kD的線形PEG部分。
作為另一個非限制性例子，主題組合物含有單PEG化CIFN多肽分子群由第一種和第二種單PEG化的CIFN多肽組成，其中具有PEG部分的第一種單PEG化的CIFN多肽與第一個CIFN多肽中表面暴露的第一個賴氨酸殘基相連，具有PEG部分的第二種單PEG化的CIFN多肽與第二個CIFN多肽中表面暴露的第二個賴氨酸殘基相連，第一個和第二個CIFN多肽可以相同或不同，其中在第一個CIFN多肽的胺基酸序列中暴露於表面的第一個賴氨酸的位置與第二個CIFN多肽的胺基酸序列中暴露於表面的第二個賴氨酸的位置不相同。對象組合物可進一步含有至少一種額外的具有PEG部分的單PEG化的CIFN與CIFN多肽表面暴露的賴氨酸殘基相連，其中在每種額外的單PEG化的CIFN多肽中連接位點的位置與任何其它種類的連接位點的位置不相同。該例子的所有種類中，PEG部分是具有平均分子量約30kD的線形PEG部分。
連接基團在一些實施方案中，PEG經由連接基團與IFN-α相連。連接基團是任何生物相容的連接基團，其中「生物相容」表明該混合物或基團基本上是無毒的並可在體內使用而不給受試者造成明顯的不良應答，例如損傷、患病、疾病、不期望的免疫應答或死亡。PEG可通過，例如醚鍵、酯鍵、硫醚鍵或醯胺鍵與連接基團相連。合適的生物相容連接基團包括，但不限於酯基團，醯胺基團，亞胺基團，氨基甲酸基團，羧基，羥基，糖類，琥珀醯亞胺基團(包括，例如琥珀醯亞胺琥珀酸酯(SS)、琥珀醯亞胺丙酸活化酯(SPA)、琥珀醯亞胺丁酸(SBA)、琥珀醯亞胺羧甲酸酯(SCM)、琥珀醯亞胺琥珀醯胺(SSA)或N-羥基琥珀醯亞胺(NHS))，環氧化物基團，氧羰基咪唑基團(包括例如碳醯二咪唑(CDI))，硝基苯基團(包括，例如硝基苯碳酸酯(NPC)或三氯苯基碳酸酯(TPC))，甲苯磺酸酯(trysylate)基團，醛基，異氰酸酯基團，乙烯碸基團，酪氨酸基團，半胱氨酸基團，組氨酸基團或伯胺。
在許多實施方案中，PEG是與IFN-α多肽上的伯胺基團反應的單甲氧基PEG分子。通過還原性烷基化用單甲氧基PEG修飾多肽的方法是本領域已知的。見，例如，Chamow等(1994)Bioconj.Chem.5133-140。
在非限制性例子中，PEG經SPA連接基團與IFN-α相連。PEG的SPA酯和製備相同物質的方法描述於美國專利號5,672,662。SPA連接在IFN-α多肽上提供游離胺基團的連接。
例如，PEG分子通過包括醯胺鍵的連接共價相連，該醯胺鍵在PEG部分的丙醯基和IFN-α多肽中的表面暴露的賴氨酸殘基的ε氨基之間。該鍵，例如可以通過PEG的α甲氧基、ω丙酸活化酯(mPEGspa)的形成。
作為非限制性例子，單PEG化CIFN有約30kD的線形PEG部分通過共價鍵連接到CIFN多肽，其中共價連接是在PEG部分的丙醯基和CIFN多肽中表面暴露的賴氨酸殘基的ε氨基之間的醯胺鍵，其中表面暴露的賴氨酸殘基是選自下列lys50，lys71，lys134，lys135和lys165，醯胺鍵是通過PEG的α甲氧基、ω丙酸活化酯的縮合形成的。
作為另一個非限制性例子，單PEG化CIFN有約30kD的線形PEG部分通過共價鍵連接到CIFN多肽，其中共價鍵是在PEG部分的丙醯基和CIFN多肽中表面暴露的賴氨酸殘基的ε氨基之間的醯胺鍵，其中表面暴露的賴氨酸殘基是選自下列lys121，lys134，lys135和lys165，醯胺鍵是通過PEG的α甲氧基、ω丙酸活化酯的縮合形成的。
將PEG分子連接到IFN-α多肽的方法是本領域已知的，並且可使用任何已知的方法。見，例如Park等，Anticancer Res.，1373-376(1981)；Zaplipsky和Lee，《聚乙二醇化學生物技術和生物醫學的應用》(Polyethylene GlycolChemistryBiotechnical and Biomedical Applications)，J.M.Harris編.，Plenum出版社，NY，21章(1992)和美國專利號5,985,265。
聚乙二醇聚乙二醇於室溫溶於水，其通用結構式為R-O-(CH2-CH2O)n-R，其中R是氫或保護基團(例如烷基或烷醇基團)，n是從1到1000的整數。R是保護基團，其一般有1到8個碳。
在許多實施方案中，PEG有至少一個羥基(例如末端羥基)，該羥基經修飾產生與氨基反應的功能性基團，例如，賴氨酸殘基的ε氨基、多肽N-末端的游離氨基或任何其它的氨基，例如天冬醯胺、穀氨醯胺、精氨酸或組氨酸的氨基。
在其它的實施方案中，PEG衍生以致它能與IFN-α多肽中的游離羧基反應，例如IFN-α多肽的羧基末端的游離羧基。合適的與IFN-α的羧基末端的游離羧基反應的PEG衍生物包括，但不限於PEG-胺和PEG的肼衍生物(例如，PEG-NH-NH2)。
在其它實施方案中，PEG衍生以致它含有末端硫代羧酸基團-COSH，該基團可選擇性地與氨基反應產生醯胺衍生物。由於硫代酸的反應性質，可以獲得某些氨基而跳過其它氨基的選擇性。例如，在適當的pH條件下，-SH在與N-末端氨基反應中表現出充分的離去基團能力使得賴氨酸殘基中的ε氨基被質子化並維持非親核性。另一方面，在合適的pH條件下進行的反應可以選擇性地使一些可接近的賴氨酸殘基反應。
在其它的實施方案中，PEG包括反應性酯，例如在PEG鏈的末端的N-羥基琥珀醯亞胺。這種含有N-羥基琥珀醯亞胺的PEG分子在特定的pH條件下(例如，中性pH6.5-7.5)與選擇的氨基反應。例如，可在中性pH條件下選擇性地修飾N-末端氨基。然而，如果試劑的反應性是極端的，可接近的賴氨酸-NH2基團也可反應。
在其它的實施方案中，PEG在其鏈的末端含有充足活性的N-羥基琥珀醯亞胺酯，由於在PEG鏈的末端和酯之間有合適的間隔物(例如丙醯基)使得該酯不能快速水解並在特定的pH條件下(從中性到鹼性，即pH7.0-9.0)更加選擇性地反應。例如，多肽鏈中的某些賴氨酸的ε氨基可用N-羥基琥珀醯亞胺丙酸酯活化的PEG選擇性地修飾。選擇使用具體的方法以產生確定的組合物和活性的產物。
PEG可直接或通過一接頭與IFN-α多肽接合。在一些實施方案中，向IFN-α多肽加入接頭以形成接頭修飾的IFN-α多肽。這樣的接頭可提供各種功能度(例如，反應基團例如巰基、氨基或羧基)將PEG試劑偶合到接頭修飾的IFN-α多肽。
在一些實施方案中，接合到IFN-α多肽的PEG是線形的。在其它的實施方案中，接合到IFN-α多肽的PEG是支鏈的。支鏈的PEG衍生物例如那些描述於美國專利號5,643,575，「star-PEG’s」和多臂PEG’s例如描述於Shearwater Polymers，Inc.目錄「聚乙二醇衍生物1997-1998」(Polyethylene Glycol Derivatives 1997-1998)。Star PEGs在技術上的描述包括，例如，美國專利號6,046,305。
在特別感興趣的實施方案中，接合到IFN-α多肽的PEG是線形的。
本發明的PEG修飾的IFN-α多肽含有分子量低於40kD的單個PEG分子。在文中使用並且是本領域熟知的「30kDa」PEG的平均分子量為30kDa。一般使用平均分子量約為2kDa到30kDa的PEG。例如，線形PEG分子的分子量約為20kD到40kD，22kD到28kD，24kD到36kD，26kD到34kD或28kD到32kD。在特定的實施方案中，PEG的分子量約為30kD並且是線形的。
PEG分子的分子量可使用合適的分子量標記由凝膠過濾柱層析來確定，或通過MALDI-TOF質譜來確定。
PEG修飾的IFN-α本發明的PEG修飾的IFN-α的分子量低於與支鏈的40kDaPEG的單個分子相連的IFN-α2a的分子量。Pegasys是與支鏈的40kDaPEG單個分子相連的示範性的IFN-α2a(Reddy等(2002)Adv.Drug Deliv.Rev.54571-586)。PEG修飾的IFN-α多肽的分子量小於Pegasys的分子量，約為5kDa到20kDa，6kDa到15kDa，8kDa到12kDa或7kDa到10kDa。在許多實施方案中，PEG修飾的IFN-α多肽的分子量小於Pegasys的分子量，約為8kDa到12kDa。
PEG修飾的IFN-α的分子量是否小於Pegasys的分子量可用測定蛋白質分子量的標準方法方便地確定。這樣的方法包括，但不限於高效液相色譜(HPLC)，反相HPLC，體積排阻色譜，十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳，HPLC體積排阻色譜(SEC)，HPLC/SEC/雷射掃描和基質輔助的雷射吸收離子化飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)。要確定PEG修飾的IFN-α的分子量是否低於Pegasys的分子量，優選使二者在同樣的條件下經體積排阻HPLC。
本發明的PEG修飾的IFN-α多肽的分子量小於約60kDa，一般約為40kDa到55kDa或45kDa到50kDa。在一些實施方案中，PEG修飾的IFN-α多肽的分子量約為50kDa，例如約從48kDa到52kDa。
製備PEG-IFN-α結合物如上所述，PEG部分可直接或通過一接頭連接到N-末端或接近N-末端的胺基酸殘基，或在內部(例如，在表面暴露的賴氨酸殘基)。接合可在溶液或固相中進行。
將PEG部分連接IFN-α多肽的N-末端或接近N-末端的胺基酸殘基的方法是本領域已知的。見美國專利號5,985,265。
在一些實施方案中，使用了選擇性獲得N-末端化學修飾的IFN-α的已知方法。例如，通過還原性烷基化進行蛋白質修飾的方法是可用的，該方法利用不同類型的伯胺基團(賴氨酸對N-末端)的差別反應性在特定的蛋白質中衍生。在合適的反應條件下，用含有聚合物的羰基基團在N-末端達到基本上選擇性衍生的蛋白質。反應在利用賴氨酸的ε-氨基和蛋白質的N-末端的α-氨基之間的pKa差別的pH條件下進行。通過這種選擇性衍生作用可以控制PEG部分與IFN-α的連接聚合物的接合主要發生在IFN-α的N-末端且其它反應基團(例如，賴氨酸側鏈氨基基團)不發生顯著的修飾作用。
如果需要，可用任何已知的方法將PEG化的IFN-α和未PEG化的IFN-α分開，這些方法包括，但不限於離子交換色譜，體積排阻色譜和其聯合使用。例如，當PEG-IFN-α結合物是單PEG化的IFN-α，產物首先用離子交換色譜分離得到具有電荷特徵的單PEG化物質的物質(其它具有相同表觀電荷的多PEG化物質也可能存在)，然後使用體積排阻色譜分離單PEG化物質。
在一些實施方案中，修飾的IFN-α通過將IFN-α多肽與α-甲氧基、ω-丙醯基聚乙二醇(mPEgspa)的琥珀醯亞胺酯反應來製備。一般而言，用IFN-α和mPEGspa的摩爾比約為1∶1到1∶5進行反應。反應通常在pH約為7到9的溶液中進行。
在特定的實施方案中，CIFN與分子量約為30kDa的線形mPEGspa反應，其中用CIFN∶mPEGspa的摩爾比約為1∶1到1∶5進行反應，反應的pH約為7到9。在一特定的實施方案中，CIFN∶mPEGspa的摩爾比約為1∶2並且反應的pH約為8。
在一些實施方案中，本發明提供的修飾的CIFN是通過將CIFN與分子量約為30kDa的線形α-甲氧基、ω-丙醯基聚乙二醇(mPEgspa)的琥珀醯亞胺酯反應的方法生產的，其中用CIFN∶mPEGspa的摩爾比約為1∶1到1∶5進行反應，反應的pH約為7到9。在一特定的實施方案中，本發明提供的修飾的CIFN是通過將CIFN與線形、分子量約為30kDa的α-甲氧基、ω-丙醯基聚乙二醇(mPEgspa)的琥珀醯亞胺酯反應的方法生產的，其中用CIFN∶mPEGspa比率約為1∶3進行反應，反應的pH約為8。
PEG修飾的IFN-α的藥代動力學性質本發明的PEG修飾的IFN-α多肽具有至少約8小時、10小時、12小時、15小時、17小時、20小時或25小時或更長的血清半衰期(例如平均血清滯留時間)。
PEG修飾的IFN-α的血清清除率與未修飾的IFN-α的血清清除率相比降低了，例如，PEG修飾的IFN-α的血清清除率比具有相同的胺基酸序列的未修飾的IFN-α的血清清除率至少低約20％、50％、75％或90％。
本發明的PEG修飾的IFN-α在曲線的面積(AUV；以hr×mg/ml表示)示於圖5、6或7。
在許多實施方案中，本發明的PEG修飾的IFN-α多肽具有和與分子量為40kDa的支鏈PEG分子相連的幹擾素-α2a基本上相似的藥代動力學分布。因此，例如，在48周期間將本發明的PEG修飾的IFN-α以180μg劑量每周給藥一次產生與在48周期間將Pegasys以180μg劑量每周給藥一次相同的藥代動力學分布。
PEG修飾的IFN-α的抗病毒和抗增殖性質在一些實施方案中，本發明的PEG修飾的IFN-α多肽(或含有PEG化的IFN-α多肽的IFN多肽的主題群體)表現出比PEGASYSPeg-幹擾素-α2a大至少5倍的抗病毒活性。在一些實施方案中，本發明的單PEG化的IFN-α分子或群體表現出比PEGASYSPeg-幹擾素-α2a大至少5倍、10倍、15倍或20倍的抗病毒活性。在一些實施方案中，單PEG化的CIFN分子或群體表現出比PEGASYSPeg-幹擾素-α2a大至少5倍、10倍、15倍或20倍的抗病毒活性。比較抗病毒活性的基礎可是任何已知的測定，包括，但不限於實施例1所描述的MDBK/VSV測定。
在一些實施方案中，本發明的PEG修飾的IFN-α多肽(或含有PEG化的IFN-α多肽的IFN多肽的主題群體)保留至少5％、7％、10％、12％、15％、20％或更多的親本(非PEG化的)IFN-α多肽的抗病毒活性。在一些實施方案中，PEG-Alfacon1分子保留至少5％、7％、10％、12％、15％、20％或更多的INFERGENAlfa-1的抗病毒活性。比較抗病毒活性的基礎可以是任何已知的測定，包括，但不限於實施例1所描述的MDBK/VSV測定。
在一些實施方案中，本發明的PEG修飾的IFN-α多肽(或含有PEG化的IFN-α多肽的IFN多肽的主題群體)表現出比PEGASYSPeg-幹擾素-α2a大至少5倍的抗增殖活性。在一些實施方案中，本發明的單PEG化的IFN-α分子或群體表現出比PEGASYSPeg-幹擾素-α2a大至少5倍、10倍、15倍或20倍的抗增殖活性。在一些實施方案中，單PEG化的CIFN分子或群體對象表現出比PEGASYSPeg-幹擾素-α2a大至少5倍、10倍、15倍或20倍的抗增殖活性。比較抗增殖活性的基礎可是任何已知的測定，包括，但不限於實施例1所描述的Daudi細胞測定。
製劑上述組合物可用熟知的試劑和方法配製。組合物可以具有藥學上可接受的賦形劑的製劑提供。種類繁多的藥學上可接受的賦形劑是本領域已知的且無需在此詳細討論。各種出版物詳細描述了藥學上可接受的賦形劑，包括，例如A.Gennaro(2000)《雷明頓藥劑學的科學與實踐》(RemingtonThe Science and Practice ofPharmacy)，第二十版，Lipplncott，Williams和Wilkins；《藥物劑型和給藥體系》(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems)(1999)H.C.Ansel等編.，第七版.，Lippincott，WilliamsWilkins；和《藥用輔料手冊》(Handbook ofPharmaceutical Excipients)(2000)A.H.Kibbe等編.，第三版.Amer.Pharmaceutical Assoc。
藥學上可接受的賦形劑(例如載體、佐劑、運載體或稀釋劑)是方便地公開可用的。此外，藥學上可接受的輔助物質，例如pH調節劑和緩衝劑、張力調整劑、穩定劑、溼潤劑等是方便地公開可用的。
在一些實施方案中，PEG化的IFN-α配製在水性緩衝液中。合適的水性緩衝液包括，但不限於乙酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽和磷酸鹽緩衝液，其強度從5mM到10mM不等。在一些實施方案中，水性緩衝液包括用作等滲溶液的試劑。這種試劑包括，但不限於氯化鈉和糖，例如甘露醇、右旋糖、蔗糖等。在一些實施方案中，水性緩衝液可進一步包括非離子表面活性劑，例如聚山梨醇酯20或80。製劑可任選進一步包括防腐劑。合適的防腐劑包括，但不限於苯甲醇、苯酚、氯丁醇、苯扎氯胺等。在許多情況下，製劑保存於2-8℃。製劑也可凍幹，在這種情況下製劑一般包括防凍劑，例如蔗糖、海藻糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇等。凍幹的製劑即使在環境溫度中也可保存更長的時期。
在主題方法中，活性藥物可以任何可導致所期望的治療效果的方便方式向宿主給藥。因此，藥劑可摻入各種用於治療性給藥的製劑中。更特別的是，本發明的藥劑可與合適的、藥學上可接受的運載體或稀釋劑聯合配製入藥學組合物，並可製成固體、半固體、液體或氣體形式，例如片劑、膠囊、粉劑、顆粒、軟膏劑、溶液、栓劑、注射劑、吸入劑和氣溶膠。
給藥可以各種方式實現，包括口服、含服、直腸、腸胃外、腹膜內、皮內、經皮、氣管內等。
在藥物劑型中，藥劑可以其藥學上可接受的鹽形式給藥，或者也可單獨使用或與其它的藥學活性化合物關聯使用和聯合使用。以下的方法和賦形劑僅是例子而非限制。
對口服製劑而言，藥物可以單獨使用或與合適的添加劑聯合使用來製成片劑、粉劑、顆粒或膠囊，例如，常規的添加劑(例如蔗糖、甘露醇、玉米澱粉或馬鈴薯澱粉)；粘合劑(例如結晶纖維素、纖維素衍生物、阿拉伯膠、玉米澱粉或明膠)；崩解劑(例如玉米澱粉、馬鈴薯澱粉或羧甲基纖維素鈉)；潤滑劑(例如滑石粉或硬脂酸鎂)；如果需要可以與稀釋劑、緩衝劑、潤溼劑、防腐劑和矯味劑聯合使用。
將藥劑溶解、懸浮或乳化於水性或非水性溶劑中配製成用於注射的製劑，這些溶劑為，例如植物油或其它類似的油、合成的脂肪族酸甘油酯、高級脂肪酸或丙二醇的酯；如果需要可與常規的添加劑，例如增溶劑、等滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩定劑和防腐劑聯合使用。
此外，將藥物與各種基質(base)，例如乳化基質或水溶性基質混合製成栓劑。本發明的化合物經栓劑進行直腸給藥。栓劑可以包括載體，例如可可奶油、carbowax(聚乙二醇製劑的商品名)和聚乙二醇，這些載體在體溫下溶解，而在室溫下是固化的。
也可提供用於口服或直腸給藥的單位劑型，例如糖漿、酏劑和混懸劑，其中每個劑量單位(例如茶匙、湯匙、片劑或栓劑)含有預定量的組合物，而組合物中含有一種或多種抑制劑。類似地用於注射或靜脈內給藥的單位劑型可含有組合物中的抑制劑作為無菌水、常規的鹽水或其它藥學上可接受的運載體中的溶液。
用在文中的術語「單位劑型」指適用於人和動物受試者的單一劑量的物理上離散單位，每個單位含有預定量的本發明化合物，其量經計算可充分地與藥學上可接受的稀釋劑、運載體或載體結合產生所期望的效果。本發明新穎的單位劑型的規格取決於所採用的特定的化合物、欲達到的效果和宿主中每個化合物相關的藥效學。
主題PEG修飾的IFN-α的有效劑量約為每劑量50μg到300μg、或90μg到180μg。主題PEG修飾的IFN-α的有效劑量約為每劑量0.5μg/公斤體重到3.5μg/公斤體重。
治療肝炎病毒感染的方法本發明提供治療肝炎病毒感染的方法。方法一般包括向個體施加有效劑量的本發明PEG修飾的IFN-α多肽。
在一些實施方案中，主題PEG修飾的IFN-α的「有效量」是指一段時期內有效地達到在個體的血清中病毒滴定度降低1.5-log、2-log、2.5-log、3-log、3.5-log、4-log、4.5-log或5-log，該時期指在開始劑量方案之後的約12到48小時、約48小時到3天、約3到7天、約7天到2周、約2到4周、約4到8周、約8到12周、約12到16周、約16到24周或約24到48周。
慢性C型肝炎患者一般具有105-107基因組拷貝/ml水平的循環病毒。主題PEG修飾的IFN-α的有效量是有效地將HCV滴定度降至約5×104到105、約104到5×104或約5×103到104基因組拷貝/ml血清的量。
在一些實施方案中，主題PEG修飾的IFN-α的有效量是在開始劑量方案之後的12到48小時或16到24小時的時期內可有效地將HCV滴定度降至約5×104到105、約104到5×104或5×103到104基因組拷貝/ml血清的量。
在一些實施方案中，本發明的PEG修飾的IFN-α的有效量是將病毒的滴定度降至檢測不到的水平的量，例如降至約1000到5000、約500到1000或約100到500基因組拷貝/ml血清。在一些實施方案中，主題PEG修飾的IFN-α多肽的有效量是將病毒的滴定度降至低於100基因組拷貝/ml血清的量。
在一些實施方案中，本發明的PEG修飾的IFN-α的有效量是達到維持病毒應答的量，例如在停止治療之後的至少約1、2、3、4、5個月或更優選至少6個月時間在患者的血清內無可檢測到的HCV RNA(例如，低於約500、400、200或100基因組拷貝/ml血清)。
本發明的PEG修飾的IFN-α提供了PEG修飾的IFN-α在血清中的血清濃度。本發明的PEG修飾的IFN-α的血清濃度維持約24到48小時、約2到4天、約4到7天、約1到2周、約2到4周、約4到6周、約6到8周、約8到12周、約12到16周、約16到24周或約24到48周。
在一些實施方案中，主題PEG修飾的IFN-α提供PEG修飾的IFN-α的血清濃度為或接近患者可耐受的最大水平。所達到的血清濃度約為10到1000、約10到500、約20到250、約30到100或約50到75國際單位(IU)/ml。血清濃度維持約24到48小時、約2到4天、約4到7天、約1到2周、約2到4周、約4到6周、約6到8周、約8到12周、約12到16周、約16到24周或約24到48周。
在一些實施方案中，本發明的PEG修飾的IFN-α以有效達到並維持主題PEG修飾的IFN-α的血清濃度的劑量給藥，該濃度為最大耐受劑量(MTD)的約65％到70％、約70％到75％、約75％到80％、約80％到85％、約85％到90％、約90％到95％或約95％到100％。因此，從劑量方案開始的約6到12小時、約12到24小時或24到48小時內，達到的主題PEG修飾的IFN-α的血清濃度為最大耐受劑量(MTD)的約65％到70％、約70％到75％、約75％到80％、約80％到85％、約85％到90％、約90％到95％或約95％到100％。所達到的血清濃度可維持約7天到2周、約2到4周、約4到6周、約6到8周、約8到12周、約12到16周、約16到24周或約24到48周。
PEG修飾的IFN-α的給藥劑量範圍為約50μg到300μg，例如約50μg到70μg、約70μg到90μg、約90μg到100μg、約100μg到120μg、約120μg到150μg、約150μg到170μg、約170μg到200μg、約200μg到230μg、約230μg到270μg或約270μg到300μg。
如上所述，PEG修飾的IFN-α的給藥量以微克表示。此外，劑量也可以單位或國際單位(IU)活性來表示。體外測定單位或IU作為幹擾素抑制合適的病毒(例如，心內膜心肌炎病毒(EMC)、皰疹性口炎病毒和Semliki森林病毒)在感染適當的細胞系(例如，人類肺癌細胞系，A549；HEP/C等)後的細胞病變效應的能力。抗病毒活性以如WHO提供的人幹擾素α為參考標準來測定。這些方法在許多參考文獻中詳述，包括下列的Familletti，P.C.，Rubinstein，S和Pestka，S.(1981)「一種方便和快速地用於幹擾素的細胞病變效應測定方法」(A convenient and rapid cytopathic effectinhibition assay for interferon)，Methods in Enzymol，第78卷(S.Pestka編)，Academic Press，New York，第387-394頁。
在一些實施方案中，本發明提供治療肝炎病毒感染的方法，該方法包括施用有效量的主題PEG修飾的IFN-α來降低病毒負荷。
本發明的PEG修飾的IFN-α可以每日給藥、一周兩次、一周一次、每兩周一次或每周三次給藥進行約24小時到48小時、約2到4天、約4到7天、約1到2周、約2到4周、約4到6周、約6到8周、約8到12周、約12到16周、約16到24周或約24到48周。
在特定的實施方案中，本發明的PEG修飾的IFN-α可以每周一次給藥頻率進行約2到4周、約4到6周、約6到8周、約8到12周、約12到16周、約16到24周或約24到48周。
在一些實施方案中，本發明的PEG修飾的IFN-α可以每周約45μg到270μg或約180μg或約120μg的劑量皮下給藥約2到4周、約4到6周、約6到8周、約8到12周、約12到16周、約16到24周或約24到48周。每周的劑量可以用快速灌注劑注射給藥或用泵控制的連續輸注系統給藥。
在一些實施方案中，主題PEG修飾的IFN-α以聯合治療的方式給藥，例如，施用另一種抗病毒藥劑或其它的治療劑(1)基本上是同時和以不同的製劑給藥；(2)基本上是同時和以同一製劑給藥；(3)以不同的製劑在不同的時間給藥。以下將詳細討論聯合治療。
聯合治療在一些實施方案中，提供聯合治療的方法包括施用本發明的組合物和一種額外的治療劑(例如IFN-γ和/或利巴韋林)。
在一些實施方案中，額外的治療劑可以在PEG修飾的IFN-α治療的全程給藥，治療開始和結束階段相符。在其它的實施方案中，額外的治療劑可以在與PEG修飾的IFN-α治療相重疊的時間給藥，例如用額外的治療劑治療在PEG修飾的IFN-α治療開始之前開始並在PEG修飾的IFN-α治療結束之前結束；用額外的治療劑治療在PEG修飾的IFN-α治療開始之後開始並在PEG修飾的IFN-α治療結束之後結束；用額外的治療劑的治療在PEG修飾的IFN-α治療開始之後開始並在PEG修飾的IFN-α治療結束之前結束或用額外的治療劑治療在PEG修飾的IFN-α治療開始之前開始並在PEG修飾的IFN-α治療結束之後結束。
在其它的實施方案中，額外的治療劑治療在PEG修飾的IFN-α治療開始之前施用並在PEG修飾的IFN-α治療開始之時結束，例如，額外的治療劑用在「引發」劑量方案中。
利巴韋林和其它的抗病毒藥物利巴韋林，l-β-D-核糖呋喃基-lH-1，2，4-三唑-3-氨甲醯(獲得自ICNPharmaceuticals，Inc.，Costa Mesa，Calif.)描述於Merck索引，化合物號8199，第十一版。其生產和製劑描述於美國專利號4,211,771。本發明也考慮了使用利巴韋林的衍生物(見，例如美國專利號6,277,830)。利巴韋林口服的劑量約為每天400、約800或約1200mg。
其它的抗病毒劑可以在本發明治療方法中給藥。例如，抑制肌苷單磷酸脫氫酶(IMPDH)的化合物可能具有潛在的直接施加抗病毒的活性，這種化合物可與文中所述的IFN-α組合物聯合給藥。有效抑制C型肝炎N53蛋白酶的藥物可與文中所述的IFN-α組合物聯合給藥。C型肝炎NS3蛋白酶抑制劑可抑制病毒的複製。其它藥物，例如HCV NS3解螺旋酶的抑制劑也是用於聯合治療的有吸引力的藥物，並且也考慮了用在文中所述的聯合治療。核酶(例如HeptazymeTM)和硫代磷酸寡核苷酸是與HCV蛋白質序列互補的並且抑制病毒核心蛋白的表達，二者也適合用於文中所述的聯合治療。此外，利巴韋林的合適的類似物，包括對映異構體和免疫增強劑例如Zadaxin也適用於文中所述的聯合治療。
確定療效主題方法是否有效治療肝炎病毒感染，特別是HCV感染可通過測量病毒負荷或測量與HCV感染相關的參數來確定，該參數包括，但不限於肝纖維變性。
病毒負荷可通過測量血清中病毒的滴定度或水平來測定。這些方法包括，但不限於定量聚合酶鏈式反應(PCR)和分支DNA(bDNA)測試。例如，已開發了用於測定HCVRNA的病毒負荷(滴定度)的定量測定。許多這樣的測定是可市售的，包括定量反轉錄PCR(RT-PCR)(Amplicor HCV MonitorTM，Roche Molecular Systems，New Jersey)；和分支DNA(脫氧核糖核酸)信號擴增測定(QuantiplexTMHCV RNA測定(bDNA)，ChironCorp.，Emeryville，California)。見，例如Gretch等(1995)Ann.Intern.Med.123321-329。
如上所註明的，主題方法是否有效治療肝炎病毒感染，例如HCV感染中可通過測量與肝炎病毒感染相關的參數來確定，例如肝纖維變性。肝纖維變性的降低通過分析肝活檢樣品來測定。肝活檢的分析包括對兩種主要成分的評價以「級」評價的炎症壞死(necroinflammation)作為測定嚴重性和正在進行的疾病活性，和以「階段」評價的纖維病變的損傷和實質或血管重塑作為長期疾病進展的反映。見，例如Brunt(2000)Hepatol.31241-246；和METAVIR(1994)Hepatology.2015-20。以肝活檢分析為基礎給予評分。許多標準化的評分系統提供定量評價纖維變性的程度和嚴重性。這些包括METAVIR，Knodell，Scheuer，Ludwig和Ishak評分系統。
肝纖維變性的血清標記也可作為主題治療方法的效果的指示來測定。肝纖維變性的血清標記包括，但不限於透明質酸鹽，N-末端前膠原III肽，IV型膠原的7S結構域，C-末端前膠原I肽和層粘連蛋白。其它肝纖維變性的生化標記包括α-2-巨球蛋白，觸珠蛋白，γ球蛋白，載脂蛋白A和γ穀氨醯轉肽酶。
作為非限制性例子，用標準測定法測量血清丙氨酸轉氨酶(ALT)的水平。總體上，ALT水平低於每ml血清約45國際單位認為是正常的。在一些實施方案中，IFNα的有效量是將ALT水平降至低於約45IU/ml血清的有效量。
適合治療的受試者臨床診斷為感染肝炎病毒(例如HAV、HBV、HCV、δ等)，特別是HCV的個體適合用本發明的方法治療。感染HCV的個體在其血液中鑑定出HCV RNA和/或在其血清中鑑定出抗HCV抗體。這樣的個體包括未經治療的個體(例如，以前未治療過HCV的個體，特別是未接受過基於IFN-α或利巴韋林治療的個體)和之前治療HCV失敗的個體(「治療失敗」患者)。治療失敗患者包括無應答者(例如，以前治療HCV未明顯或充分降低HCV滴定度的個體，特別是以前用IFN-α的單一形式進行的IFN-α單藥治療)；和復發者(例如，以前治療過HCV的個體(特別是以前用IFN-α的單一形式進行的IFN-α單藥治療)，其HCV滴定度顯著降低了，接著又增加了)。
在感興趣的特定實施方案中，個體的HCV滴定度至少約為105、5×105或106HCV基因組拷貝/ml血清。患者可感染任何HCV基因型(基因型1、包括1a和1b、2、3、4、6、7、8、9等和亞型(例如，2a、2b、3a等))，特別是難於治療的基因型，例如HCV基因型1和特定的HCV亞型和準種(quasispecies)。
HCV-陽性的個體(如上所述)也是感興趣的，這些個體是由於慢性HCV感染而表現出嚴重的纖維變性或早期肝硬化(非失代償性的A型Child’s-Pugh或輕一些)，或更晚期的肝硬化(失代償性的B或C類Child’s-Pugh)和儘管之前進行過基於IFN-α療法的抗病毒治療但還是病毒血症的，或不能耐受基於IFN-α的療法或對這樣的療法有禁忌症的個體。在感興趣的特定實施方案中，依照METAVIR評分系統具有3或4期肝纖維變性的HCV-陽性個體是適用本發明的方法治療的。在其它實施方案中，適用本發明方法治療的個體是臨床表現出失代償性肝硬化的患者，包括很晚期的肝硬化患者(包括那些等待肝移植的)。在其它的實施方案中，適用本發明方法治療的患者包括中度纖維變性的患者，其中包括那些早期纖維變性(在METAVIR，Ludwig和Scheuer評分系統中評為1和2期的；或在Ishak評分系統中評為1、2或3期的)的患者。
在某些實施方案中，用於治療HCV患者的特定的藥物治療方案按照患者所表現出來的某些疾病參數來選擇，例如初始病毒負荷，患者感染的HCV的基因型，患者的抗病毒治療史，肝臟組織學和/或患者肝纖維變性的期。在一實施方案中，本發明提供用於治療HCV感染的方法，包括步驟(1)通過Knodell評分3或4測定來鑑定具有晚期或嚴重期肝纖維變性的患者，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約24到60周，或約30周到1年，或約36到50周，或約40到48周，或至少約24周，或至少約30周，或至少約36周，或至少約40周，或至少約48周，或至少約60周。
在另一實施方案中，本發明提供用於治療HCV感染的方法，包括步驟(1)通過Knodell評分3或4測定來鑑定具有晚期或嚴重期肝纖維變性的患者，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約40到50周，或約48周。
在另一實施方案中，本發明提供用於治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑑定患者具有HCV基因型1感染並且初始病毒負荷大於2百萬病毒基因組拷貝/ml患者血清，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約24到60周，或約30周到1年，或約36到50周，或約40到48周，或至少約24周，或至少約30周，或至少約36周，或至少約40周，或至少約48周，或至少約60周。
在另一實施方案中，本發明提供用於治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑑定患者具有HCV基因型1感染並且初始病毒負荷大於2百萬病毒基因組拷貝/ml患者血清，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約40到50周，或約48周。
在另一實施方案中，本發明提供用於治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑑定患者具有HCV基因型1感染同時初始病毒負荷大於2百萬病毒基因組拷貝/ml患者血清並且通過Knodell評分0、1或2測定無肝纖維變性或早期肝纖維變性，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約24到60周，或約30周到1年，或約36到50周，或約40到48周，或至少約24周，或至少約30周，或至少約36周，或至少約40周，或至少約48周，或至少約60周。
在另一實施方案中，本發明提供用於治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑑定患者具有HCV基因型1感染並且初始病毒負荷大於2百萬病毒基因組拷貝/ml患者血清並且通過Knodell評分0、1或2測定是無肝纖維變性或是早期階段，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約40到50周，或約48周。
在另一實施方案中，本發明提供用於治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑑定患者具有HCV基因型1感染並且初始病毒負荷小於或等於2百萬病毒基因組拷貝/ml患者血清，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約20到50周，或約24到48周，或約30到40周，或高至約20周，或高至約24周，或高至約30周，或高至約36周，或高至約48周。
在另一實施方案中，本發明提供用於治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑑定患者具有HCV基因型1感染同時初始病毒負荷小於或等於2百萬病毒基因組拷貝/ml患者血清，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約20到24周。
在另一實施方案中，本發明提供用於治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑑定患者具有HCV基因型1感染同時初始病毒負荷小於或等於2百萬病毒基因組拷貝/ml患者血清，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約24到48周。
在另一實施方案中，本發明提供用於治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑑定患者具有HCV基因型2或3感染，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約24到60周，或約30周到1年，或約36到50周，或約40到48周，或至少約24周，或至少約30周，或至少約36周，或至少約40周，或至少約48周，或至少約60周。
在另一實施方案中，本發明提供用於治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑑定患者具有HCV基因型2或3感染，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約20到50周，或約24到48周，或約30到40周，或高至約20周，或高至約24周，或高至約30周，或高至約36周，或高至約48周。
在另一實施方案中，本發明提供用於治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑑定患者具有HCV基因型2或3感染，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約20到24周。
在另一實施方案中，本發明提供用於治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑑定患者具有HCV基因型2或3感染，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約至少24周。
在另一實施方案中，本發明提供用於治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑑定患者具有HCV基因型4感染，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約24到60周，或約30周到1年，或約36到50周，或約40到48周，或至少約24周，或至少約30周，或至少約36周，或至少約40周，或至少約48周，或至少約60周。
在另一實施方案中，本發明提供用於治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑑定患者具有特徵在於任何HCV基因型5、6、7、8和9的HCV感染，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約20到50周。
在另一實施方案中，本發明提供用於治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑑定患者具有特徵在於任何HCV基因型5、6、7、8和9的HCV感染，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥至少約24周和高至約48周。
在另一實施方案中，本發明提供用於治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑑定未經抗病毒治療的患者具有HCV基因型1感染，，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約24到48周。
在另一實施方案中，本發明提供用於治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑑定未經抗病毒治療的患者具有HCV基因型1感染，，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約48周。
在另一實施方案中，本發明提供用於治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑑定未經抗病毒治療的患者具有HCV基因型1感染，並且初始病毒負荷大於2百萬HCV RNA基因組/ml血清，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約48周。
在另一實施方案中，本發明提供用於治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑑定未經抗病毒治療的患者具有HCV基因型1感染，並且初始病毒負荷小於或等於2百萬HCV RNA基因組/ml血清，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約24到48周。
在另一實施方案中，本發明提供用於治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑑定未經抗病毒治療的患者具有HCV基因型2或3感染，，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約12到24周。
在另一實施方案中，本發明提供用於治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑑定未經抗病毒治療的患者具有HCV基因型4感染，，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約48周。
在另一實施方案中，本發明提供用於治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑑定HCV感染並且抗病毒治療早期階段失敗的患者，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約24到60周。
在另一實施方案中，本發明提供用於治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑑定HCV感染並且IFN-α治療早期階段失敗的患者，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約24到60周。
在另一實施方案中，本發明提供用於治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑑定HCV感染並且用IFN-α2a或2b治療早期階段失敗的患者，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約24到60周。
在另一實施方案中，本發明提供用於治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑑定HCV感染並且用PEGASYSpeg幹擾素α-2a或PEG-INTRONpeg幹擾素α-2b治療早期階段失敗的患者，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約24到60周。
在另一實施方案中，本發明提供用於治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑑定HCV感染並且用共有幹擾素治療早期階段失敗的患者，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約24到60周。
在另一實施方案中，本發明提供用於治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑑定基因型2或3HCV感染並且在對IFN-α治療早期階段應答之後復發的患者，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約24到48周。
在另一實施方案中，本發明提供用於治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑑定基因型1或4HCV感染並且在對IFN-α治療早期階段應答之後復發的患者，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約48周。
在另一實施方案中，本發明提供用於治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑑定HCV感染並且對IFN-α治療早期階段無應答的患者，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約48到60周。
關於每個方法適合疾病參數和/或上述病人的其它特徵，本發明也考慮了在所需的PEG修飾的IFN-α治療過程以有效量的利巴韋林向患者協同給藥。在一實施方案中，主題方法包括在所需的PEG修飾的IFN-α治療過程每天向患者給藥約800到1200mg利巴韋林，每天的劑量任選分為兩個劑量。在另一實施方案中，主題方法包括在所需的PEG修飾的IFN-α治療過程，如果患者體重小於75kg每天向患者給藥(a)1000mg利巴韋林，或如果患者體重大於或等於75kg則每天向患者給藥(b)1200mg利巴韋林，每天的劑量任選分為兩個劑量。
提供了具有單位劑量的主題PEG修飾的IFN-α(例如，口服或注射劑量)的試劑盒。除了含有單位劑量的容器，在這些試劑盒中有描述治療肝炎藥物的用途和附帶的益處的信息性包裝說明書。優選的藥物和單位劑量如上所述。
在一些實施方案中，主題試劑盒包括含有溶液的容器和每周單位劑量給藥一次的說明書，該溶液含有單位劑量的主題PEG修飾的IFN-α和藥學上可接受的賦形劑。說明書可印在貼於容器的標籤上或可以是容器附有的包裝說明書。
實施例提供以下的實施例是向本領域普通技術人員完全披露和描述如何製造及使用本發明，而非限制發明人所認為的其發明的範圍，也非表示以下的實驗是所做的全部或僅有的實驗。發明人保證所用數字(例如，量、溫度等)的精確性，但一些實驗錯誤和偏差應該說明。除非另有說明，份是份(按重量計算)，分子量是平均分子量，溫度是攝氏溫度，壓力是大氣壓的或接近大氣壓。
實施例1PEG修飾的CIFN的製備及藥理學特性簡述用超過2倍摩爾的線形30kDa MPEG(mSPA 30K PEG)的琥珀醯亞胺丙醯基衍生物於20℃處理在含有100mM氯化鈉的20mM磷酸鈉緩衝液中的CIFN(其中約三分之一的蛋白質作為N-封閉的變體，3mg/ml)1小時。原始混合物用SEC分析顯示單PEG化的產物在混合物中約佔52％。主要組分在陽離子交換柱上純化得到97％或更高純度的單PEG化CIFN。該物質(30K的MPEG-單PEG化CIFN)保留了親本CIFN顯著量的抗病毒活性。
按照美國專利號5,985,265中實施例3所描述的方法對CIFN進行N-末端修飾得到N-末端單PEG化CIFN(30K的MPEG-α-氨基-單PEG化的CIFN)，但其中是用30kD(線形)甲氧基聚乙二醇醛代替12kD(直鏈)甲氧基聚乙二醇醛。該物質(30K的MPEG-α-氨基-單PEG化的CIFN)保留了親本CIFN顯著量的抗病毒活性。與下述的醯化反應不同，N-末端的衍生需要超過8倍摩爾的甲氧基PEG-丙醛和氰基硼氫化鈉作為還原劑來實施pH4.0時的烷基化反應。
當在使用大量表達IFN受體的Daudi細胞的體外抗增殖活性模型中測試時，30KMPEG-單PEG化CIFN和30KMPEG-α-氨基-單PEG化CIFN分子顯示基本保留了親本分子(CIFN)的活性並且表現出比Peg-幹擾素α-2a(Pegasys)高20-30倍的活性。評價了30KMPEG-單PEG化的CIFN和30KMPEG-α-氨基-單PEG化的CIFN化合物在大鼠體內的藥代動力學特性。兩種單PEG化的CIFN化合物出人意料地表現出與PEG化的幹擾素α-2a(Pegasys)相似的循環分布。
材料與方法CIFN和PEGCIFN由Amgen生產並純化，收到的終產品作為具有分析證書的濃度為0.2mg/ml的藥物。所得到的琥珀醯亞胺丙醯基甲氧基PEG(線形30kD)產自Shearwater公司，Huntsville，AL，既是研究級(research grade)的也是GMP產品。
用於小規模生產PEG化的CIFN之一的典型方案如下0.2mg/ml的主體蛋白(～750mg)用膜面積為0.038cm2進行超濾。然後產物滲濾入pH調至8.00的含有100mM氯化鈉的25mM磷酸鈉緩衝液。濃縮的物質調整到蛋白質濃度為3mg/ml。CIFN溶液然後在2mMHCl中與超過2摩爾的mSPA 30K PEG試劑混合併於21℃孵育1小時。加入超過試劑量3摩爾的甘氨酸終止反應。然後將反應混合物用pH4.5、50mM乙酸鈉稀釋10倍，並以2.0mg總蛋白/ml樹脂的量上Fractogel柱。柱首先用平衡緩衝液(50mM乙酸鈉，pH4.5)洗滌，接著用含有100mM氯化鈉的50mM乙酸緩衝液和含有250mM氯化鈉的乙酸緩衝液洗滌。單PEG化的產物經超濾/滲濾(UF/DF)，用製劑緩衝液(含有100mM氯化鈉的25mM磷酸鈉，pH7.0)平衡，然後濃縮調整至填充-完成(fill-finish)活性所需要的量。
PEG修飾的IFN-α的生產產生了各種PEG修飾的CIFN製劑。這些具有30kDaPEG單PEG化的CIFN製劑用以下的產品代碼表示，例如IM-002或有時加一前綴，例如IM-396-002。
製劑1(IM-002)濃度為3.02mg/ml的純化的共有α-幹擾素[通過用足夠量的100mM磷酸鈉緩衝液稀釋溶液A(含有100mM氯化鈉、pH7.0的25mM磷酸鈉緩衝液)中的蛋白達到最終pH為6.5來製備]於環境溫度、pH6.5條件下用SPA-線形30kD的mPEG以摩爾比5∶1處理5.5小時。SEC色譜分析顯示單PEG化的產物混合物佔原始混合物的47％。該實驗在接近生理條件下進行。反應條件、產物的抗病毒活性和早期小規模材料的樣品概括於表1和2。早期小規模產物所得的初步抗增殖活性概括於表3。
製劑2(IM-003)濃度為2.73mg/ml的CIFN[通過用足夠量的50mM磷酸鈉二元溶液稀釋溶液A(含有100mM氯化鈉、pH7.0的25mM磷酸鈉緩衝液)中的蛋白達到pH為7.4來製備]於環境溫度和PEG試劑以摩爾比1∶3攪拌3.5小時，然後置於2-8℃約15小時。產物分析顯示單PEG化的產物約佔46％(表1)並且保留14.5％的抗病毒活性(表2)。該實驗在生理條件下進行並且產物保留顯著量的親本IFN活性。製劑2保留了CIFN分子60％的抗增殖活性。
製劑3(IM-004)在含有100mM氯化鈉、pH7.0的25mM磷酸鈉緩衝液中，濃度為3.0mg/ml的CIFN於環境溫度用超過5倍摩爾的PEG試劑處理1.8小時。此反應也可在生理pH條件下進行產生佔原始混合物47.1％產量的單PEG化化合物的混合物(表1)並且該物質的抗病毒活性(表2)和抗增殖活性(表3)顯示該化合物也是可與上述的其它化合物相比的。
製劑4(IM-005)濃度為2.57mg/ml的CIFN[通過用足夠量的15mMNaOH溶液稀釋含有100mM氯化鈉、pH7.0的25mM磷酸鈉緩衝液中的蛋白達到pH為8.0來製備]]於2-8℃、pH8.0±0.2用超過3倍摩爾的PEG試劑處理約15小時。產物混合物的分析顯示單PEG化的化合物產量佔47.0％並且產物保留了親本分子顯著量的抗病毒(CIFN的13.8％，見表2)和抗增殖活性(在早期實驗中CIFN活性的150％，見表3)。該產物最優化的反應條件顯示通過使用摩爾比為1∶2的蛋白與試劑並且接合反應在20度(「℃」)進行1小時可得到相同的產物。產物的產量略有增加(47到52％)。
製劑5(IM-006；也稱為IM-396-006)濃度為2.55mg/ml的CIFN[通過用足夠量的20mMNaOH溶液稀釋含有100mM氯化鈉、pH7.0的25mM磷酸鈉緩衝液中的蛋白達到pH為9.4來製備]]於2-8℃、pH9.4用超過3倍摩爾的PEG試劑處理3小時。單PEG化產物的產量為47.2％(表1)並且保留抗病毒(表2)和抗增殖活性(表3)與上述例子類似。
製劑6(IM-007)濃度為2.57mg/ml的CIFN[通過用足夠量的20mMNaOH溶液稀釋含有100mM氯化鈉、pH7.0的25mM磷酸鈉緩衝液中的蛋白達到pH為8.8來製備]於2-8℃、pH8.8用超過3倍摩爾的PEG試劑處理6小時。該產物所得的結果見表1、2和3。
在以上引用的所有情況中，PEG試劑立刻加入蛋白質溶液並在Roto Mix的平臺上維持混合速率為60-70rpm。
PEG-Alfacon1的按比例擴大生產在接下來需要提供毒理學和臨床研究(用約1g幹擾素藥物開始)的工作中，對上述使用條件進行略微修改來生產PEG-Alfacon1藥物。因此，CIFN先用超濾/滲濾步驟達到約3mg/ml蛋白濃度濃縮入反應緩衝液(25mM磷酸鈉，100mM氯化鈉，pH8.0)。接合反應使用摩爾比為2∶1的PEG試劑與蛋白質於pH8.0進行並於環境溫度孵育1小時。加入過量的甘氨酸終止反應，然後在填充-完成之前使用陽離子交換色譜純化、陰離子交換並配製。這些步驟後得到純度＞90％的單PEG化產物(區域異構體的混合物)。大量不同的產物的純度為93-97％。
陽離子交換色譜反應產物的分離通過將混合物上樣於預先用pH4.5的乙酸緩衝液平衡的Fractogel柱實現。通過用不同鹽濃度的緩衝液洗滌分離產物。單PEG化的異構體作為一個組分分離，然後產物使用含有100mM氯化鈉、pH7.0的25mM磷酸鈉緩衝液進行超濾/滲濾。最終緩衝液交換和稀釋在預先用製劑緩衝液平衡的Q Sepharose柱上通過陰離子交換進行。
聯合十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，反相高效液相色譜(RP-HPLC)和體積排阻色譜(SEC)分析單PEG化的產物混合物。
SDS-PAGE4-12％Bis-Tris NuPaGE丙烯醯胺凝膠用於進行電泳。牛血清白蛋白連同分子量標記用作標準品。條帶通過膠態藍染色法目測。在上樣於凝膠之前還原蛋白質。與CIFN標準品相比，產物如高分子量條帶展開，表現出PEG化。
RP-HPLC分析用Phenomenex Synergi 4μMAX-RP柱。產物用各不相同的TFA-乙腈組合洗脫。檢測在214nm處的DAD1紫外(uv)吸光度和波長為280nm的DAD2來目測個體峰。主峰對應於單PEG化的產物並用作產物的參考峰特徵。該方法用來描述上述製劑1-6。當鑑定最佳的PEG化的產物用於進一步擴大生產時，要修改HPLC分析方法。測試物注射在Zorbax 300 SB-C3柱(4.6×150mm，Agilent Technologies，Palo Alto，CA)上。使用兩種溶液作為流動相(A0.1％的TFA水溶液；B含有0.1％TFA的80％乙腈溶液)。產物用兩種流動相組成的梯度洗脫26分鐘。使用流速1.0mL/分鐘並且以214nm處的uv吸光度檢測樣品。PEG-Alfacon1作為主峰洗脫，保留時間為11.2分鐘(見圖4)。
SEC-HPLC用體積排阻HPLC方法進行PEG化幹擾素的鑑定、純度和強度分析。在早期鑑定製劑1-6中串聯使用Shodex KW-803和Shodex KW-804柱。柱在5mM磷酸鈉緩衝液，於pH7.25，以1ml/分鐘的流速展開。以214nm處的吸收檢測峰。以分子量和流體半徑為基礎判斷異構體的混合物的峰分配，其中該混合物對應於單PEG化產物以單峰洗脫。在PEG-Alfacon1的按比例擴大生產期間，要修改該方法。製劑緩衝液中的產物注射在連接HP型1100HPLC系統的Superose 12HR 10/30柱上。流速調節至0.5ml/分鐘，並在214和280nm處通過紫外吸光度檢測產物。在這些條件下，PEG化的CIFN於19.5分鐘洗脫。
PEG化的產物的分子量用基質輔助的雷射吸收離子化飛行時間質譜(MALDI-TOFMS)進一步分析。
產物的生物學特徵以抗病毒測定、抗增殖活性測定和在大鼠中的藥代動力學進行評價。
30K MPEG-α-氨基-單PEG化的CIFN除了用30kD的線形PEG試劑(活性醛)替代實施例3中特定的12kD的線形PEG試劑外，基本上按照美國專利號5,985,265的實施例3中所描述的方法用30kD線形單甲氧基聚乙二醇醛還原性烷基化CIFN。如美國專利號5,985,265所述，從烷基化反應混合物中回收30K MPEG-α-氨基-單PEG化的CIFN並純化。該製劑(IM-001)以下稱為N-末端PEG-CIFN。
抗病毒試驗Madin-Darby牛腎(MDBK)細胞用皰疹性口炎病毒(VSV)感染並用CIFN或Peg-Alfacon或N-末端PEG-CIFN治療。活性以抑制病毒複製為基礎並以個體蛋白的摩爾濃度標準化。抑制百分率用以下公式計算抑制百分率＝(Test-VC)/(CC-VC)，其中Test表示在測試物存在時觀察到的細胞染色，VC表示在病毒而非測試物存在時的細胞染色，CC表示在無病毒情況下的細胞染色。當用MDBK細胞系測試抗病毒活性時，Peg-Alfacon或N-末端PEG-CIFN表現出劑量依賴的對VSV病毒的抗病毒活性。類似的抗病毒活性也在用心內膜心肌炎(EMC)病毒感染的人肺癌(A549)細胞中測定到。
抗增殖測定用預定濃度的CIFN或Peg-Alfacon或N-末端PEG-CIFN處理人Burkitt淋巴瘤細胞或Daudi細胞3天，並用摻入氚化的胸腺嘧啶的方法測定細胞增殖。抑制百分率用以下公式計算抑制百分率＝1-(測試cpm/總cpm)]×100，其中測試每分鐘計數(cpm)表示測試化合物在指示濃度時測量的值，總cpm表示無測試化合物時測量的細胞增殖的值。當用Daudi細胞系測試抗增殖活性時，Peg-Alfacon和N-末端PEG-CIFN表現出劑量依賴抗增殖活性並且結果也顯示了單PEG化的異構體混合物保留了顯著量的親本CIFN活性。
大鼠藥代動力學在3隻雄性Sprague-Dawley大鼠中研究PEG化CIFN產物的體內清除率。PEG化的幹擾素經皮下途徑向大鼠給藥(20-250μg/kg)。1周後測量血清濃度。利用藥代動力學分析確定Cmax、AUC和排除時間t1/2。用所有的單PEG化的CIFN混合物看到半衰期有顯著的增加。因此，Peg-Alfacon和N-末端PEG-CIFN證明血漿暴露有顯著的增加。類似的研究也在獼猴中進行，並在皮下注射Peg-Alfacon和N-末端PEG-CIFN10天後檢測了PK參數和2』-5』寡腺苷酸合成酶(OAS)的水平。OAS是α幹擾素能效的代替標記。
結果和討論PEG-修飾的CIFN
表1.各種PEG化的CIFN分子的製備方法和產量的概略結

用含有250mM氯化鈉、pH4.5的50mM乙酸鈉緩衝液洗脫得到純度為97％或更高的作為混合物的PEG-Alfacon單PEG化產物。純度以SEC-HPLC和SDS-PAGE凝膠電泳測定。得到的數據示於圖2和3。反相HPLC分析(圖4)顯示純化的產物在保留時間12分鐘以單個主峰出現。PEG化CIFN的平均分子量用MALDI-TOF質譜測定。觀察到的52260的質量與通過凝膠滲透色譜(GPC)連接一個分子的CIFN測量到的一個單位的名義30kdPEG(平均分子量為32700Da)一致。
抗病毒活性表2.PEG化的α幹擾素的抗病毒活性

在使用MDBK/VSV系統進行的細胞病變效應抑制測定中，PEG化的CIFN產物(製劑號IM-002，IM-003，IM-004，IM-005，IM-006和IM-007中的任何一個)和N-末端PEG-CIFN產物(製劑號IM-001)表現出約10％的親本分子(CIFN)的抗病毒活性。在這些產物中，IM-005選為先導選擇物(lead candidate)用於進一步開發並命名為PEG-Alfacon。抗病毒活性的測量依賴於實際使用的細胞系和感染病毒的聯合。在使用A549/EMC病毒系統進行的細胞病變效應抑制測定中，PEG-Alfacon產物和N-末端PEG-CIFN產品表現出保留了略微小於10％的CIFN抗病毒活性。
當在MDBK/VSV系統中測定時，Roferon幹擾素-alfa2a表現出比Infergen-alfacon-1低5-10倍的抗病毒活性[Ozes ON等.J Interferon Res1255-59(1992)]。從上表2的數據推斷，明顯的是，當在MDBK/VSV系統中測定時，Pegasyspeg-幹擾素-alfa2a保留了約1.5-3.0％的Roferon幹擾素-alfa2a(與Infergen或幹擾素Alfacon-1的0.3％抗病毒活性比較)的抗病毒活性。因此，PEG化的共有幹擾素分子保留親本幹擾素分子(Infergen-alfacon-1)的抗病毒活性的百分率大於Pegasyspeg-幹擾素-alfa2a保留親本幹擾素分子(Roferon幹擾素-alfa2a)的抗病毒活性的百分率約10倍。PEG-Alfacon的參考標準品(PEG化的CIFN或Infergen)與其它商業化產品例如PEG-Intron或PEGASYS(見下表4和5)在幾個細胞系中使用不同的感染病毒也進行了類似的比較。得到的結果支持了上述PEG化的CIFN產物的早期抗病毒數據。以這些CPE測定系統為基礎，PEG-Alfacon與PEGASYS相比似乎具有優異的抗病毒效力，並具有可與PEG-Intron相比的效力。因此可預期它用於治療慢性並型肝炎中有充足的抗病毒活性。
抗增殖活性表3.PEG化的α幹擾素的抗增殖活性

另一個測量幹擾素生物學活性指標的抗增殖活性受PEG化的影響較小。PEG-alfacon產物表現出約40-150％親本分子(CIFN)的抗增殖活性。N-末端PEG-CIFN產物表現出約45％親本分子(CIFN)的抗增殖活性。然而在基於Daudi細胞的抗增殖測定中，PEG化的共有幹擾素分子比PEGASYSPEG-幹擾素-alfa2a高5-15倍的抗增殖活性。
藥代動力學對各種合成的類似物的比較作為本發明的一部分在大鼠PK模型中評價並證明顯著較長的循環時間(圖5)。在圖5中，IM-001表示N-末端PEG-CIFN，IM-003、IM-005和IM-006分別表示PEG化的CIFN製劑2、4和5。圖6顯示命名為IM-006的這些類似物之一的血清濃度-時間分布的半對數圖。PEG化的共有幹擾素分子表現出與PEG化的幹擾素α-2a(Pegasys)很相似的藥代動力學分布。因此，Cmax在24小時後達到，Cmax為633ng/ml。排除半衰期約為27小時，而CIFN的清除率t1/2值約為6小時。有趣地發現所有PEG化CIFN分子(即N-末端修飾的(IM-001)或內部賴氨酸衍生的類似物(IM-003、IM-005和IM-006))均表現出很相似的藥代動力學(PK)分布。在獼猴中進行的相似研究顯示PEG化的CIFN分子(IM-005)在血液中持續高達1周(圖7)並且在所有時間點檢測血清均誘發2』-5』OAS活性。可觀察到血液中的藥效標記上升了至少5天。在獼猴中Peg-Alfacon1末端排除的半衰期計算為約30小時。因此，由線形30kd的PEG試劑產生所得的PEG化的CIFN出人意料地得到體內每周給藥一次所期望的PK特徵。
實施例2PEG修飾的CIFN和其它PEG化的α-幹擾素的抗病毒活性鑑定為全面表徵本發明PEG化的CIFN在其它人細胞系中的抗病毒活性並與其它相似的產品作比較，在A549、HeLa和ME180細胞中使用相同的感染病毒(例如VSV和EMCV)進行了篩選這種分子的實驗。
材料和方法HeLa或ME180細胞生長在DMEM或RPMI-1640培養基中，該培養基補充了10％熱滅活的血清(小牛或胎兒視需要而定)(Hyclone Laboratories，Inc.，Logan，UT)，L-穀氨醯胺(2mM)，鏈黴素(100μg/ml)和青黴素(100μ/ml)。細胞於37℃生長在5％CO2加溼的孵育箱內。在加入病毒之前用IFN處理HeLa或ME180細胞(在96-孔微滴定板中，2×104細胞/孔)24小時。皰疹性口炎病毒(VSV)或心內膜心肌炎病毒(EMCV)以MOI為0.1加入，板再孵育48小時。在此時，用含0.5％結晶紫的20％(體積/體積)甲醇溶液對細胞單層染色。所有的細胞病變效應(CPE)抑制測定進行雙份。抑制50％細胞病變效應的IFN的量定義為IFN的一個單位。所有IFN的活性對照NIH標準人IFN-α(Namalwa/Sendai)(Ga23-901-532)測量。
A549/EMCV CPE測定按照文獻描述的標準方法進行。
結果在最初的篩選中，CIFN或Intergen與PEG-Alfacon1(也是稱為PEG-CIFN或PEG化的幹擾素)在細胞病變效應(CPE)抑制測定中用VSV在不同的細胞系中進行比較。該項研究所得的結果示於表4。通過測試幹擾素的活性與NIH標準品(GA23-902-530)進行比較計算比活性。
表4IFN-Alfacon-1和PEG-Alfacon-1的抗病毒活性的比較

比較細胞系ME180和HeLa的比活性顯示Intergen或幹擾素Alfacon-1對表4所有結果均有顯著較高的抗病毒活性(P＜0.01)。相反，當使用A549細胞時，幹擾素Alfacon-1和PEG-Alfacon-1的比活性很相似。
在不同的細胞系中比較了本發明產品與親本分子和其它市場產品的抗病毒活性。這些研究所得的實驗數據用單向Anova統計學分析程序(one way Anovastatistical analysis program)分析。顯示於圖8-10的結果的圖示表明數據的統計學意義。表5一概括了使用EMC病毒在A549、HeLa和ME180細胞系中進行比較研究得到的比活性數據。
表5.平均抗病毒比活性

從該實施例中的數據清楚地發現PEG-Alfacon1保留了親本Intergen分子顯著量的抗病毒活性。在頭對頭比較中，很明顯PEG-Alfacon1保留了可與PEG-Intron相比的活性水平並顯著高於Pegasys的活性水平。然而根據藥代動力學性質(圖5)，PEG-Alfacon1比PEG-Intron好得多並且藥物的末端排除半衰期可與Pegasys相比。因此在聯合抗病毒活性和藥代動力學性質的基礎上，可期待PEG-Alfacon具有優異的體內活性。在A549、HeLa和ME180細胞系統(上述表4和5)中得到的Infergen(幹擾素Alfacon-1)、PEG-alfacon-1、Pegasys(peg-幹擾素-alfa2a)和PEG-Intron(peg-幹擾素-alfa2b)的抗病毒活性測定數據與在MDBK細胞系統(上述表2)中得到的幾個PEG化的CIFN分子、Infergen(幹擾素Alfacon-1)和Pegasys(peg-幹擾素-alfa2a)的抗病毒活性測定數據一致。兩組數據均表明PEG-alfacon-1(和其它的PEG化的CIFN分子)表現出比Pegasyspeg-幹擾素-alfa2a大至少10倍的抗病毒活性。此外，表2中的MDBK測定數據與表4和5中的A549和ME180數據表明PEG-alfacon-1保留了約10％的親本幹擾素分子(CIFN)的抗病毒活性，而在以本文中和文獻中發表的數據為基礎的相同測定系統中，Pegasyspeg-幹擾素-alfa2a保留了約1.0％的親本幹擾素分子的活性(即Roferon幹擾素-alfa2a的活性)，這些數據重複顯示Infergen比Roferon活性大5-10倍。因此，PEG-alfacon-1保留親本幹擾素分子的抗病毒活性(即Infergenalfacon-1的抗病毒活性)的百分率大於Pegasyspeg-幹擾素-alfa2a保留親本幹擾素分子的抗病毒活性(即Roferon幹擾素-alfa2a的抗病毒活性)的百分率約10倍。
實施例3PEG-alfacon的藥代動力學和藥效學分析以下概括了使用PEG-alfacon單劑量研究的結果對藥代動力學和藥效學數據進行分析的結果。檢測了單個和平均PK分布以及血清2』5』-寡聚腺苷酸合成酶(OAS)活性的平均PD分布。此外，使用PK分布模擬血清藥物分布為以10天間隔的多劑量PEG-Alfacon進行預測。
藥代動力學數據取自PEG-alfacon的單劑量，範圍發現臨床研究。6組健康的男性和女性志願者以逐步上升的劑量設計給予單劑量皮下注射PEG-alfacon，其劑量範圍是15到210μg。選擇來自接受60μg和更高劑量的志願者的樣品進行該分析。最後處理組接受在增加階段鑑定為最高耐受劑量的210μg劑量。在兩個情況(120μg劑量組的受試者531和受試者532)中給藥前5分鐘獲得的樣品血清的PEG-alfacon基線值是可測量的。基線值從隨後的樣品中扣除以得到這兩個情況的基線校正值並且數據顯示有基線校正和無基線校正。
單個數據進行非區室和區室藥代動力學分析。平均數據在市售的KineticTM軟體的幫助下進行三個步驟的分析非區室藥代動力學分析、區室藥代動力學分析和區室藥代動力學/藥效學分析。
表6概括了對血清藥物濃度進行非區室藥代動力學分析的結果。在皮下給藥後36到72小時內達到峰濃度，並且峰濃度隨劑量從60μg劑量給藥之後的平均665pg/ml增加到210μg劑量給藥之後的約3600pg/ml。平均分布示於圖11。表6顯示從單個分布計算得到的平均PK參數和從平均血清分布計算得到的PK參數。總體上，雖然每個組內受試者之間有很大的差異並且這些差異不能方便地以性別、體重指數(BMI；kg/m2)或股與腹部注射位置不同比較來解釋，但方法之間有合理的一致。作為例子，受試者424在給藥90μg劑量後有可定量的值並且其它樣品測定檢測不到，而受試者425給予同樣劑量的PEG-alfacon後的樣品濃度均在6000pg/ml以上。
表6比較了用非區室方法計算得到的各劑量組的平均藥代動力學參數和相應的對各劑量組的平均血清濃度進行區室分析計算得到的參數。用非區室方法為受試者318、423、425、529和747計算參數的數據不充分。兩種方法得到的計算參數總體上與AUC參數值(反映一段時間後的總藥物暴露)和排除半衰期(t1/2)一致，這顯示了每個方法有相似的值。與單個最大濃度的平均值相比，平均數據的血清峰濃度傾向於略微低一點。在具有％CV的各組內有很大的可變性，所有參數的範圍約為30到70％。
各劑量組的平均血清分布適合於使用市售的軟體的1-區室體模型。單個血清分布也適合於1-區室體模型。36個單個數據集的藥物分布的6個中，數據不足以進行1-區室體模型的計算(受試者315、318、321、425、529和747)。
表6

*由單個血清分布±標準差[由平均血清分布計算得到]計算a使用受試者531和532的基線校正值計算期望藥物的劑量校正Cmax和AUC值依照線形動力學是恆定的。如表7所示，兩組劑量校正的參數有很大的差異。在各劑量中無一致的趨勢，提示組內的差異可以解釋來自與劑量成比例增加的偏差。
表7.由單個平均值和用非區室方法確定值的平均分布計算得到的劑量校正的Cmax和AUC參數劑量[μg]Cmax[pg/ml]AUC0-最終[pg/ml*h]60 1196490 161735120*252017150 171979180 131390210 172560平均60 10986平均90 121512平均120*181789平均150 162133平均180 121542平均210 142258*使用受試者531和532的基線校正值計算基線校正的AUC0-最終和Cmax值對體重指數(BMI)作圖來測定體重對從皮下注射的藥物吸收的潛在效果。結果示於圖12A和12B，表明藥物吸收與BMI變化無一致的趨勢。
平均血清濃度數據配合1-區室模型得到劑量從60到210μg的單劑量皮下給藥是合理曲線，如圖13所示平均分布。
模擬試驗使用從配合曲線到多劑量方案之後的血清藥物分布模型計算得到的藥代動力學參數。圖14A顯示了使用從各劑量組計算得到的平均參數模擬每10天給藥60μg的給藥方案所期望的血清情況。所有的模擬試驗使用受試者531和532的基線校正值來計算120μg劑量組的平均參數。總體上，各模擬試驗中有良好的一致性。在第一個給藥間隔期間達到穩態並且谷水平跌至測定定量限制的300pg/ml以下。基於60μg劑量組的平均數據的模擬試驗的峰濃度是由給與150μg PEG-alfacon劑量受試者的平均數據計算得到的模擬試驗的峰濃度的約50％。因為在模擬圖表中沒有明顯的與治療組(劑量)有關的變化，所以差異可歸因於治療組中的易變性。每10天和每7天給藥100、150和200μg劑量的額外模擬試驗示於圖14B-G。這些圖譜顯示了隨著劑量增加所期望的變化模式。將給藥間隔縮短至7天有小的效果。
平均血清OAS應答分布示於圖15，其中PD應答以從基線的％變化顯示。在很多情況中，標準偏差與平均值是可比的，這反映了在每個治療組中有很大的易變性。
圖16顯示了PK/PD模型的結果。計算的EC50值(反應導致50％最大效果的藥物的濃度)在劑量中變化很大。類似地，如表8所示，計算的Emax值隨劑量有很大的差別。
表8劑量(mcg)Emax(％OAS變化)EC50(pg/ml)60313127907932 27701120 7911046150 470202180 717591210 441212儘管參考實施方案描述了本發明，應該理解的是本領域的技術人員可作出各種變化和等效物可替換而不脫離本發明的真正精神和範圍。此外，可以進行許多修改使特定的情況、材料、物質的組合物、方法、方法的步驟或步驟適合於本發明的目的、精神和範圍。所有的這些修改均在附屬的權利要求範圍內。
權利要求
1.包含單個CIFN多肽和單個聚乙二醇(PEG)部分的單PEG化的共有幹擾素(CIFN)分子，其中，所述PEG部分是線形的、分子量約30kD並直接或間接地通過共價鍵與CIFN多肽中的賴氨酸殘基相連。
2.如權利要求1所述的單PEG化的CIFN分子，其特徵在於，所述PEG部分與CIFN多肽表面暴露的賴氨酸殘基相連。
3.如權利要求1所述的單PEG化的CIFN分子，其特徵在於，所述賴氨酸殘基選自CIFN多肽的lys31、lys50、lys71、lys84、lys121、lys122、lys134、lys135和lys165。
4.如權利要求3所述的單PEG化的CIFN分子，其特徵在於，所述賴氨酸殘基是CIFN多肽的lys31。
5.如權利要求3所述的單PEG化的CIFN分子，其特徵在於，所述賴氨酸殘基是CIFN多肽的lys50。
6.如權利要求3所述的單PEG化的CIFN分子，其特徵在於，所述賴氨酸殘基是CIFN多肽的lys71。
7.如權利要求3所述的單PEG化的CIFN分子，其特徵在於，所述賴氨酸殘基是CIFN多肽的lys84。
8.如權利要求3所述的單PEG化的CIFN分子，其特徵在於，所述賴氨酸殘基是CIFN多肽的lys121。
9.如權利要求3所述的單PEG化的CIFN分子，其特徵在於，所述賴氨酸殘基是CIFN多肽的lys122。
10.如權利要求3所述的單PEG化的CIFN分子，其特徵在於，所述賴氨酸殘基是CIFN多肽的lys134。
11.如權利要求3所述的單PEG化的CIFN分子，其特徵在於，所述賴氨酸殘基是CIFN多肽的lys135。
12.如權利要求3所述的單PEG化的CIFN分子，其特徵在於，所述賴氨酸殘基是CIFN多肽的lys165。
13.如權利要求1-12中任一項所述的單PEG化的CIFN分子，其特徵在於，所述共價鍵包括PEG部分的丙醯基和CIFN多肽中的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的醯胺鍵。
14.如權利要求1-13中任一項所述的單PEG化的CIFN分子，其特徵在於，所述共價鍵包括由PEG部分的α-甲氧基、ω-丙酸活化酯和CIFN多肽中的賴氨酸殘基的ε-氨基縮合形成的醯胺鍵。
15.含有單PEG化的共有幹擾素(CIFN)分子群體的組合物，其中，所述群體由兩種或多種分子組成，其中每個這樣的種類由單個CIFN多肽和單個PEG部分組成，且PEG部分是線形的、分子量約為30kD並直接或間接地通過共價鍵連接到CIFN多肽的賴氨酸殘基或CIFN多肽的N-末端殘基，前提是在至少第一個這樣的種類中PEG部分與CIFN多肽中的賴氨酸殘基共價相連，並且在第二個這樣的種類中PEG部分與CIFN多肽中的N-末端殘基共價相連。
16.如權利要求15所述的組合物，其特徵在於，在第一個這樣種類中PEG部分與CIFN多肽表面暴露的賴氨酸殘基共價連接。
17.如權利要求15所述的組合物，其特徵在於，所述群體由兩種或多種單PEG化的CIFN組成，其中的PEG部分與CIFN多肽中的賴氨酸殘基相連，前提是在任何這樣的種類中連接點的位置不同於在任何其它種類中連接點的位置。
18.如權利要求15所述的組合物，其特徵在於，所述賴氨酸殘基選自CIFN多肽的lys31、lys50、lys71、lys84、lys121、lys122、lys134、lys135和lys165。
19.如權利要求17所述的組合物，其特徵在於，所述在任何這樣的種類中的連接點的賴氨酸殘基選自CIFN多肽的lys31、lys50、lys71、lys84、lys121、lys122、lys134、lys135和lys165。
20.如權利要求17所述的組合物，其特徵在於，所述在任何這樣的種類中的連接點的賴氨酸殘基是CIFN多肽表面暴露的賴氨酸殘基。
21.如權利要求15-20中任一項所述的組合物，其特徵在於，所述在第一個這樣的種類中的共價鍵包括PEG部分的丙醯基與CIFN多肽中的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的醯胺鍵，並且在第二個這樣的種類中的共價鍵包括PEG部分的丙醯基與CIFN多肽中的N-末端胺基酸殘基的α-氨基之間的醯胺鍵。
22.如權利要求15-20中任一項所述的組合物，其特徵在於，所述在第一個這樣的種類中的共價鍵包括由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯與CIFN多肽中的賴氨酸殘基的ε-氨基縮合形成的醯胺鍵，並且在第二個這樣的種類中的共價鍵包括由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯與CIFN多肽的N-末端殘基的α-氨基縮合形成的醯胺鍵。
23.含有單PEG化的共有幹擾素(CIFN)分子群體的組合物，其特徵在於，所述群體由兩種或多種分子組成，其中每種這樣的分子由單個CIFN多肽和單個PEG部分組成，並且PEG部分是線形的、分子量約為30kD且直接或間接地通過共價鍵與CIFN多肽中的賴氨酸殘基相連，前提是任何這樣的種類中的連接點的位置與在任何其它這樣的種類中連接點的位置不相同。
24.如權利要求23所述的組合物，其特徵在於，所述任何這樣的種類中連接點的賴氨酸殘基選自CIFN多肽的lys31、lys50、lys71、lys84、lys121、lys122、lys134、lys135和lys165。
25.如權利要求23所述的組合物，其特徵在於，所述任何這樣的種類中連接點的賴氨酸殘基是CIFN多肽表面暴露的賴氨酸殘基。
26.如權利要求15-25中任一項所述的組合物，其特徵在於，所述CIFN多肽是幹擾素α-con1。
27.如權利要求1-14中任一項所述的單PEG化的CIFN分子，其特徵在於，所述CIFN多肽是幹擾素α-con1。
28.由下述方法生產的產品(a)使共有幹擾素(CIFN)與線形、分子量約為30kD的α-甲氧基、ω-丙醯基聚乙二醇的琥珀醯亞胺酯(mPEGspa)以CIFNmPEGspa的摩爾比約為1∶1到1∶5，於pH約7到9進行反應；和(b)回收步驟(a)的單PEG化的反應產物。
29.如權利要求28所述的產品，其特徵在於，所述步驟(a)中CIFNmPEGspa的比值約為1∶3，pH約為8。
30.如權利要求28所述的產品，其特徵在於，所述步驟(a)中CIFNmPEGspa的比值約為1∶2，pH約為8.0。
全文摘要
本發明提供與具有名義分子量約30kD的線形聚乙二醇(PEG)分子相連的幹擾素α(IFN－α)和含有相同成分的組合物。本發明進一步提供了用主題PEG修飾的IFN－α治療病毒感染的方法。
文檔編號C07K1/107GK1997666SQ200480008785
公開日2007年7月11日 申請日期2004年2月24日 優先權日2003年2月26日
發明者P·范瓦拉西拉, M·J·羅伯特, G·維索, S·A·查爾斯 申請人:印特繆恩股份有限公司