聚乙二醇修飾的抑肽酶及其製備方法

2023-10-21 07:44:07

專利名稱：：聚乙二醇修飾的抑肽酶及其製備方法
技術領域：
：本發明涉及一種化學修飾的抑肽酶及其製備方法和用途，具體地說涉及一種聚乙二醇修飾的抑肽酶及其製備方法，還包括其在止血和抗炎中的用途。
背景技術：
：抑肽酶(aprotinin)是從牛肺中提取的一種鹼性多肽，為非特異性蛋白酶抑制劑，能抑制多種含有絲氨酸活性中心的蛋白酶。抑肽酶由58個胺基酸組成，其胺基酸組成為RPDFCLEPPYTGPCKARIIRYFYNAKAGLCQTFVYGGCRAKRNNFKSAEDCMRTCGGA。大量臨床研究表明大劑量抑肽酶可明顯減少體外循環術後出血，臨床主要用於防治各種纖維蛋白溶解所致的急性出血及各種休克，急性胰腺炎及胰腺壞死。近年來廣泛應用於各種手術、如體外循環心臟直視手術、癌症手術、骨科手術、剖宮產術、鼻內窺鏡術等，以減少術中、術後出血。但是在使用過程中也發現這些藥物具有蛋白質藥物所共有的缺點，如具有免疫原性，半衰期短等。特別是免疫原性問題，已成為抑肽酶廣泛應用的最大障礙。資料顯示0.7%的患者首次接觸既可發生過敏反應，再次使用者過敏反應發生率增至10%。為此，發明人試圖採用蛋白質修飾技術對抑肽酶進行結構修飾以降低或消除抑肽酶的免疫原性，從而改善該類藥物的藥效，降低毒性。目前，在對蛋白質藥物進行化學修飾的研究領域中，應用最多，成功率最高的是聚乙二醇(PEG)修飾技術。用於修飾蛋白質藥物的PEG有很多種，典型的修飾反應列舉如下formulaseeoriginaldocumentpage51)SPA-PEG或SBA-PEG所參與的反應；2)帶a-支鏈的SPA-PEG或SBA-PEG所參與的反應(C:幾種活化的PEG修飾蛋白質巰基的反應■O1.)mPEG—N+SH-RmPEG—NO—S-ROOII2.)ro:PEG——S—CH-CH2+SH-RO如omPEG—S—CH2CH2SOO■3.)mPEG—NHCCTjI+SR-ROtlmPEG—NHCCH，S-R4,)mPEG—S-S-1)為PEG-馬來醯亞胺；2)為PEG-乙烯基碸；3)為PEG-碘乙醯胺;4)為PEG-鄰-吡啶-二硫醚。修飾研究中大多數是將多肽分子中的氨基作為修飾位點。為克服抑肽酶作為藥物使用所存在的不足，採用聚乙二醇修飾技術對抑肽酶的氨基進行修飾，以獲得聚乙二醇修飾的抑肽酶，作為止血藥物和抗炎藥物在臨床上應用。本發明所要解決的技術問題是針對現有技術製備抑肽酶存在免疫原性，半衰期短等缺陷，採用蛋白質修飾技術以降低其免疫原性，延長其半衰期，從而改善該蛋白質的藥物動力學特性，以提高其耐受性和減少給藥次數，更好地滿足抑肽酶在臨床應用方面的需求。
發明內容本發明提供一種聚乙二醇修飾的抑肽酶，其特徵在於，抑肽酶的氨基上連接有聚乙二醇或其衍生物鏈。所述的抑肽酶(aprotinin)包括從牛肺或牛的胰腺中提取的或用基因工程手段製備的重組抑肽酶，該抑肽酶的胺基酸組成序列為[R]PDFCLEPPYTGPC[K]ARIIRYFYNA[K]AGLCQTFVYGGCRA[K]RNNF[K]SAEDCMRTCGGA;分子式為C284H432N84079S7;分子量為6511.44。所述的抑肽酶的氨基，具體而言就是指抑肽酶組成中N-末端的a-氨基和賴氨酸的s-氨基，可能的修飾位點為5個(見上述序列中的[]中的胺基酸)。每個抑肽酶分子上可以接15條聚乙二醇的長鏈，優選每個抑肽酶分子上連接一條聚乙二醇長鏈。所述的聚乙二醇長鏈可以為直鏈聚乙二醇也可以為支鏈聚乙二醇，優選直鏈聚乙二醇；聚乙二醇長鏈的分子量通常在2000200000之間，優選的分子量在3000-30000之間。優選的的聚乙二醇修飾的抑肽酶，其具有如下的通式結構m陽PEG-Y-NH畫R其中PEG代表聚乙二醇長鏈，其可以是直鏈聚乙二醇長鏈，也可以是帶有支鏈的聚乙二醇長鏈，優選直鏈聚乙二醇；該長鏈的分子量通常在2000~200000之間，優選的分子量在3000~30000之間；其中m代表d~C4的低級烷氧基，該低級烷氧基用於保證每個聚乙二醇長鏈上僅修飾一個抑肽酶分子，也即單聚乙二醇修飾抑肽酶，m優選甲氧基；其中Y代表聚乙二醇長鏈和抑肽酶的連接基團，是聚乙二醇或其衍生物在修飾後留下的殘基；其中R代表少了一個氨基的抑肽酶分子。聚乙二醇修飾的抑肽酶的製備方法包括將活化的聚乙二醇或其衍生物與抑肽酶進行反應，然後將聚乙二醇修飾的抑肽酶從反應混合物中分離，得到藥用純度的聚乙二醇修飾的抑肽酶。所述的活化的聚乙二醇或其衍生物是本領域一般技術人員所公知的，例如描述於RobertMJ等，先進的藥物傳遞評論(AdvancedDrugDiliveryReviews)(2002;54:459-476)。其中聚乙二醇或其衍生物包括但不限於單甲氧基聚乙二醇、單甲氧基聚乙二醇羧酸衍生物、單甲氧基聚乙二醇酯類衍生物、單甲氧基聚乙二醇二氯三嗪衍生物、單甲氧基聚乙二醇三氟乙基磺酸酯、單甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺碳酸酯、單甲氧基聚乙二醇苯並三唑碳酸酯、單甲氧基聚乙二醇對硝基苯碳酸酯、單甲氧基聚乙二醇三氯苯碳酸酯、單甲氧基聚乙二醇碳醯咪唑、單甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺琥珀酸酯、單甲氧基聚乙二醇羧酸酯、甲酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯、乙酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯、戊酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯、已酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯、庚酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯、單甲氧基聚乙二醇甲醛、單甲氧基聚乙二醇乙醛、單甲氧基聚乙二醇丙醛、單甲氧基聚乙二醇丁醛、單甲氧基聚乙二醇戊醛、單甲氧基聚乙二醇已醛、單甲氧基聚乙二醇庚醛、或單甲氧基聚乙二醇丙醛和單甲氧基聚乙二醇乙醛通過酸水解形成的乙縮醛水合物，也可以在這些種類的修飾劑的結構中引入葡萄糖及其類似物、賴氨酸及其類似物等分子的結構，以形成新的活化的聚乙二醇修飾劑等等。優選地，使用甲酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯、乙酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯、戊酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯、已酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯、庚酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯、單甲氧基聚乙二醇甲醛、單甲氧基聚乙二醇乙醛、單甲氧基聚乙二醇丙醛、單甲氧基聚乙二醇丁醛、單甲氧基聚乙二醇戊醛、單甲氧基聚乙二醇已醛或單甲氧基聚乙二醇庚醛。更優選的使用丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯、單甲氧基聚乙二醇丙醛或單甲氧基聚乙二醇丁醛(使用醛進行修飾時需在反應液中加入硼氫化鈉)，這些修飾劑可採用美國NektarTherapeutics公司生產的產品。更優選地，所述聚乙二醇修飾的抑肽酶具有如下通式結構m-PEG-0-(CH2)n-T-NH-R其中m代表dC4的低級烷氧基，優選甲氧基；其中PEG代表聚乙二醇長鏈，其可以是直鏈聚乙二醇長鏈，也可以是帶有支鏈的聚乙二醇長鏈，優選直鏈聚乙二醇；該長鏈的分子量通常在2000-200000之間，優選的分子量在300030000之間；n=0~6，優選『2或3;oT為c或CH2;R為去除一個氨基(NH2)的抑肽酶分子。o當T為i'時為一種修飾方法，具體為IImPEG-O(CH2)nC_NH—R當T為CH2時為另一種修飾方法，具體為m-PEG-0-(CH2)n-CH2-NH-R本發明還提供聚乙二醇修飾抑肽酶的製備方法，包括如下步驟在抑肽酶溶液中，加入磷酸氫二鈉溶液，調節其pH值在4.5-9.5，優選6.57.5;然後加入活化的聚乙二醇或其衍生物，反應溫度為4~40°C，優選20~30°C;反應時間，當T為c時，反應時間為5"20分鐘，當T為CH2時，反應時間為0.5到48小時；反應中活化的聚乙二醇或其衍生物與抑肽酶的摩爾比為0.1~100，優選15，將反應混合液採用本領域所公知的離子交換層析技術。離子交換層析採用陽離子交換層析，流動相為含NaCl的磷酸鹽緩衝液，即可得聚乙二醇修飾的抑肽酶。製備反應按下式進行m-PEG-0-(CH2)n-D+R-NH2-mPEG-0-(CH2)n-T-NH-R其中m代表C廣C4的低級垸氧基，優選甲氧基；其中PEG代表聚乙二醇長鏈，其可以是直鏈聚乙二醇長鏈，也可以是帶有支鏈的聚乙二醇長鏈，優選直鏈聚乙二醇；該長鏈的分子量通常在2000200000之間，優選的分子量在300030000之間；當D為0時，T為c;當D為—CH時，T為CHyR為去除一個氨基(NH2)的抑肽酶分子。離子交換層析採用陽離子交換層析進行分離，所使用陽離子交換層析介質為本領域所公知的各種層析介質，根據其骨架的不同可分為聚苯乙烯型、纖維素型、葡聚糖型、瓊脂糖型、球狀纖維素型等，如SSepharose系列、CMSepharose系列、CMSephacel系列、SPSephadex系列、CMSephadex系列、SOURCES系列等，其中優選使用SOURCE30S作為層析介質進行分離；陽離子層析的柱D為o或—。其中R-NH2為抑肽酶;n=0~6，優選11=2或3;體積為1600ml，流速為0.550ml/min;用起始緩衝液平衡2~8倍柱體積；上樣量為2200ml;先用15倍柱體積的起始緩衝液洗脫未吸附部分，再使用梯度洗脫，梯度液組成為起始緩衝液(A)，起始緩衝液+1.0mol/LNaCl緩衝液(B)，B體積百分含量從0100X，洗脫20倍柱體積。起始緩衝液可使用乙酸-乙酸鈉緩衝液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩衝液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩衝液、磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩衝液、磷酸二氫鈉-氫氧化鈉緩衝液、Tris-HCl緩衝液、巴比妥-鹽酸緩衝液、硼砂緩衝液、甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液等，這些緩衝液的pH可從3.09.0，其中最優地使用pH為58的Tris-HCl緩衝液。收集各洗脫組份，用SDS-PAGE和反相高效液相色譜(RP-HPLC)進行分析，合併聚乙二醇修飾的抑肽酶。本發明還提供聚乙二醇修飾的抑肽酶在製備高效低毒的止血藥物和抗炎藥物的臨床應用，其中可以按照公知技術製備成為注射液或凍乾粉針給藥。令人吃驚的是，本發明的聚乙二醇修飾的抑肽酶能顯著提高抑肽酶的比活力，同時它比未修飾的抑肽酶有較低的免疫原性和更好的穩定性，動物體內試驗表明它比未修飾的抑肽酶有更好的止血效果，因此作為藥物它比未修飾的抑肽酶有更大的優越性。本發明的聚乙二醇修飾的抑肽酶的製備方法，簡單易行。圖1聚乙二醇修飾抑肽酶的HPLC分析圖譜圖2聚乙二醇修飾抑肽酶的SDS-PAGE圖(譜圖中1為標準蛋白，2為聚乙二醇修飾抑肽酶)圖3聚乙二醇修飾抑肽酶的MALDI-TOF-MS分析圖譜具體實施例方式實施例1丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯5000(mPEG-SPA-5000)修飾的抑肽酶反應溫度的選擇取1.0mg/ml的抑肽酶溶液2ml，加2ml磷酸鹽緩衝液使溶液的pH值為7.0，再加入mPEG-SPA-5000固體4.0mg，溶解，混勻，各取0.3ml置於4支帶塞試管中，然後分別置於4。C、10°C、25。C和37。C反應30min後終止反應。比較修飾率，確定修飾條件。結果表明在這些溫度下都能得到聚乙二醇修飾的抑肽酶，其中25。C的修飾率最高，具體數據見表一。表一不同溫度對抑肽酶修飾率的影響tableseeoriginaldocumentpage12反應時間的選擇取l.Omg/ml的抑肽酶溶液2ml，加2ml磷酸鹽緩衝液使溶液的pH值為7.0，再加入mPEG-SPA-5000固體4.0mg，溶解，混勻，各取0.3ml置於4支帶塞試管中，然後於25t:分別反應5、15、30、60、120min後終止反應。比較修飾率，確定修飾條件。結果表明在這些條件下都能得到聚乙二醇修飾的抑肽酶，其中30min後的修飾率沒有明顯提高，具體數據見表二。表二不同時間對抑肽酶修飾率的影響tableseeoriginaldocumentpage12mPEG-SPA-5000同抑肽酶的摩爾比的選擇取10.0mg/ml的抑肽酶溶液2ml，加2ml磷酸鹽緩衝液使溶液的pH值為7.0，各取0.3ml置於4支帶塞試管中，然後分別加入1.2、2.3、5.8和11.5mgmPEG-SPA-5000(相當於mPEG-SPA-5000同抑肽酶的摩爾比分別為1:1，1:2，1:5，h10)，溶解，混勻，反應30min後終止反應。比較修飾率，確定修飾條件。結果表明在這些條件下都能得到聚乙二醇修飾的抑肽酶，當mPEG-SPA-5000同抑肽酶的摩爾比在2時修飾率已達到最高，進一步增加mPEG-SPA-5000的量修飾率也沒有明顯地增加，具體數據見表三。表三不同摩爾比對抑肽酶修飾率的影響tableseeoriginaldocumentpage13實施例2聚乙二醇修飾抑肽酶的分離純化與鑑定取1.0mg/ml的抑肽酶溶液10ml，加約5ml的磷酸鹽緩衝液使溶液的pH值為7.0，再加入mPEG-SPA-5000固體16mg，溶解，混勻，於25。C反應30min，加入3g甘氨酸固體終止反應。取上述反應液，對0.05mol/L，pH6.0的Tris-HCl緩衝液透析，用截流分子量為3000的超濾膜濃縮至5ml，上柱分離。色譜條件如下層析介質SOURCE30S柱體積5ml流速3.0ml/min柱平衡用0.05mol/L，pH6.0的Tris-HCl(起始緩衝液)平衡5倍柱體積上樣量5ml洗脫先用3倍柱體積的起始緩衝液洗脫未吸附部分，再使用梯度洗脫，梯度液組成為起始緩衝液(A)，起始緩衝液+1.0mol/LNaCl緩衝液(B)，B從0100%，洗脫20倍CV收集3.0ml/管用SDS-PAGE和RP-HPLC進行跟蹤分析，合併聚乙二醇修飾的抑肽酶。RP-HPLC分析表明得到的聚乙二醇修飾的抑肽酶的純度在98%以上，見附圖l，具有較高的純度。SDS-PAGE測定表明聚乙二醇修飾的抑肽酶在電泳圖上為單一條帶，經計算表觀分子量為14373，見附圖2。聚乙二醇修飾的抑肽酶經MALDI-TOF-MS分析，測得其分子量為11539.29，見附圖3。抑肽酶的分子量為6511.44，二者分子量相差約5000，同時在11540.29(M+l峰)附近有一系列峰，相鄰兩峰的分子量相差44，具有聚乙二醇的典型結構特徵，證實得到的聚乙二醇抑肽酶的單修飾產物。實施例3抑肽酶和聚乙二醇修飾的抑肽酶生物效價測定(方法參見中國藥典2005年二部抑肽酶)按照藥典中抑肽酶的效價測定方法，測定抑肽酶和聚乙二醇修飾的抑肽酶的效價，然後計算樣品的比活力(U/mg)。效價測定表明聚乙二醇修飾的抑肽酶不但比活力沒有降低，而且還升高了近l倍，具體結果見表四。表四抑肽酶和聚乙二醇修飾的抑肽酶生物效價測定結果tableseeoriginaldocumentpage14實施例4抑肽酶和聚乙二醇修飾的抑肽酶止血作用比較按照Ga'borVeres等公布的抑肽酶對實驗動物止血作用的影響的試驗方法，以beagle犬作為實驗動物進行開胸手術試驗，方法參見Ga'borVeres，Tama'sRadovitsHolgerSchultz等，EuropeanJournalofCardio-thoracicSurgery,2007;32(2):340-345。24隻beagle犬被分成3組，每組8隻，雌雄各半，分為陰性對照組(生理鹽水)、聚乙二醇修飾抑肽酶和抑肽酶組。抑肽酶和聚乙二醇修飾抑肽酶組在手術前每隻犬按1.57單位/kg靜脈給藥，手術過程中用泵循環給藥，劑量為1.57U/kg，速率為111.1U/h，循環時間為卯min。試驗結果表明抑肽酶和聚乙二醇修飾抑肽酶均能顯著降低因開胸手術引起的出血量(p<0.05)。具體結果見表五表五抑肽酶和聚乙二醇修飾的抑肽酶止血作用比較結果糹1￥—出血量(n^T"5"血減少Q)SSSJiir180±63抑肽酶93±3548.3%聚乙二醇修飾抑肽酶68士2462.2%這些結果表明聚乙二醇修飾的抑肽酶在體內不但保留了抑肽酶止血的生理作用，而且在同等劑量下還能提高止血效果。因此，預期在人體內聚乙二醇修飾的抑肽酶會有更好的止血作用效果。實施例5聚乙二醇修飾的抑肽酶對實驗動物免疫原性的研究以家兔作為製備抗血清的實驗動物，採用福氏佐劑免疫法，並分別以抑肽酶和聚乙二醇修飾的抑肽酶作為抗原，劑量均為6U/kg/次，每周1次，共5次。分別以抑肽酶和聚乙二醇修飾的抑肽酶作為抗原，用雙向免疫擴散法測定它們各自抗血清的效價，測定結果為抑肽酶組抗血清的效價為h16;聚乙二醇修飾的抑肽酶組抗血清的效價測不出。分別以抑肽酶和聚乙二醇修飾的抑肽酶作為抗原，然後用抑肽酶組的抗血清作為第一抗體，再以辣根過氧化酶(HRP)標記的羊抗兔IgG作為第二抗體，用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定它們各自的免疫原性，測定結果為抑肽酶組為陽性，聚乙二醇修飾的抑肽酶組為陰性。以上結果表明同抑肽酶比較，聚乙二醇修飾的抑肽酶的免疫原性顯著降低，這樣更有利用作為治療藥物進行使用。實施例6用丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯2000(mPEG-SPA-2000)、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯10000(mPEG-SPA-10000)、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯20000(mPEG-SPA-20000)、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯30000(mPEG-SPA-30000)或丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯60000(mPEG-SPA-60000)代替實施例1中的mPEG-SPA-5000，得到了實施例中1-5相似的結果。實施例7用丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯2000(mPEG-SBA-2000)、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯5000(mPEG-SBA-5000)、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯10000(mPEG-SBA-10000)、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯20000(mPEG-SBA-20000)、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯30000(mPEG-SBA-30000)或丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯60000(mPEG-SBA-60000)代替實施例1中的mPEG-SPA-5000，得到了實施例中1-5相似的結果。實施例8甲氧基聚乙二醇丙醛5000(mPEG-ALD-5000)修飾的抑肽酶反應溫度的選擇取1.0mg/ml的抑肽酶溶液2ml，加2ml磷酸鹽緩衝液使溶液的pH值為6.5，再加入mPEG-ALD-5000固體4.0mg，溶解，混勻，再加0.164ml的lmol/LNaBH4，各取0.3ml置於4支帶塞試管中，然後分別置於4°C、10°C、25。C和37。C反應16h後終止反應。比較修飾率，確定修飾條件。結果表明在這些溫度下都能得到聚乙二醇修飾的抑肽酶，其中25。C的修飾率最高，具體數據見表六。表六不同溫度mPEG-ALD-5000對抑肽酶修飾率的影響formulaseeoriginaldocumentpage17反應時間的選擇取1.0mg/ml的抑肽酶溶液2ml，加2ml磷酸鹽緩衝液使溶液的pH值為6.5，再加入mPEG-ALD-5000固體4.0mg，溶解，混勻，再加0.164ml的lmol/LNaBH4，各取0.3ml置於4支帶塞試管中，然後於25。C分別反應0.5、1.0、8.0、16.0、24.0h後終止反應。比較修飾率，確定修飾條件。結果表明在這些條件下都能得到聚乙二醇修飾的抑肽酶，其中16h後的修飾率沒有明顯提高，具體數據見表七。表七不同時間mPEG-ALD-5000對抑肽酶修飾率的影響formulaseeoriginaldocumentpage17mPEG-ALD-5000同抑肽酶的摩爾比的選擇取10.0mg/ml的抑肽酶溶液2ml，加2ml磷酸鹽緩衝液使溶液的pH值為6.5，各取0.3ml置於4支帶塞試管中，然後分別加入1.2、2.3、5.8、11.5mgmPEG-ALD-5000(相當於mPEG-ALD-5000同抑肽酶的摩爾比在1.010.0)，溶解，混勻，再分別加0.041ml的lmol/LNaBH4反應16.0h後終止反應。比較修飾率，確定修飾條件。結果表明在這些條件下都能得到聚乙二醇修飾的抑肽酶，當mPEG-ALD-5000同抑肽酶的摩爾比在2.0時修飾率已達到最高，進一步增加mPEG-ALD-5000的量修飾率也沒有明顯地增加，具體數據見表八。表八不同摩爾比的mPEG-ALD-5000對抑肽酶修飾率的影響formulaseeoriginaldocumentpage17聚乙二醇修飾抑肽酶(醛修飾)的分離純化與鑑定取1.0mg/ml的抑肽酶溶液10ml,加5ml磷酸鹽緩衝液使溶液的pH值為7.0，再加入mPEG-ALD-5000固體16.0mg，溶解，混勻，再加0.328ml的lmol/LNaBH4，反應16h後，加入3g甘氨酸固體終止反應。然後按照實施例2中的方法進行聚乙二醇修飾抑肽酶的分離純化與鑑定。RP-HPLC分析表明得到的聚乙二醇修飾的抑肽酶的純度在98%以上，具有較高的純度。測定表明該聚乙二醇修飾的抑肽酶在電泳圖上為單一條帶，經計算表觀分子量為14588。實施例11聚乙二醇修飾抑肽酶(醛修飾)的特性研究按照實施例3~6中的方法進行mPEG-ALD-5000修飾抑肽酶生物活性、穩定性、對實驗動物血栓形成的影響和免疫原性的研究，結果見表九。表九聚乙二醇修飾抑肽酶(醛修飾)的特性研究結果tableseeoriginaldocumentpage18實施例12用甲氧基聚乙二醇丙醛2000(mPEG-ALD-2000)、甲氧基聚乙二醇氧基聚乙二醇丙醛10000(mPEG-ALD-10000)、甲氧基聚乙二醇丙醛20000(mPEG-ALD-20000)、甲氧基聚乙二醇丙醛30000(mPEG-ALD-30000)或甲氧基聚乙二醇丙醛60000(mPEG-ALD-60000)代替實施例9中的mPEG-ALD-5000，得到了實施例中9-ll相似的結果。實施例13用甲氧基聚乙二醇丁醛2000(mPEG-ButyrALD-2000)、甲氧基聚乙二醇丁醛5000(mPEG-ButyrALD-5000)、甲氧基聚乙二醇聚乙二醇丁醛10000(mPEG-ButyrALD-10000)、甲氧基聚乙二醇丁醛20000(mPEG-ButyrALD-20000)、甲氧基聚乙二醇丁醛30000(mPEG-ButyrALD-30000)或甲氧基聚乙二醇丁醛60000(mPEG-ButyrALD-60000)代替實施例1中的實施例9中的mPEG-ALD-5000，得到了實施例中9-11相似的結果。權利要求1.一種聚乙二醇修飾的抑肽酶，其特徵在於抑肽酶的氨基上連接有聚乙二醇或其衍生物鏈。2.權利要求l所述的聚乙二醇修飾的抑肽酶，其特徵在於每個抑肽酶分子上連接一條聚乙二醇長鏈。3.權利要求2的聚乙二醇修飾的抑肽酶，其具有如下的通式結構m-PEG-Y-NH-R，其中m代表dC4的低級烷氧基，PEG代表聚乙二醇長鏈，Y代表聚乙二醇長鏈和抑肽酶的連接基團，R代表少了一個氨基的抑肽酶分子。4.權利要求3的聚乙二醇修飾的抑肽酶，其具有如下的通式結構m-PEG-0-(CH2)n-T-NH-R，其中m代表dC4的低級烷氧基，PEG代表聚乙o二醇長鏈，n=0~6，T為^或CH2，R代表少了一個氨基的抑肽酶分子。5.權利要求4所述的聚乙二醇修飾的抑肽酶，其具有如下的通式結構formulaseeoriginaldocumentpage26.權利要求4所述的聚乙二醇修飾的抑肽酶，其具有如下的通式結構m-PEG-0-(CH2)n-CH2-NH-R。7.權利要求4-6所述的聚乙二醇修飾的抑肽酶，其特徵在於11=2或3。8.權利要求1-6所述的聚乙二醇修飾的抑肽酶，其特徵在於聚乙二醇長鏈的分子量在2000200000之間。9.權利要求8所述的聚乙二醇修飾的抑肽酶，其特徵在於聚乙二醇長鏈的分子量在3000~30000之間。10.權利要求3-6所述的聚乙二醇修飾的抑肽酶，其特徵在於m為甲氧基。11.一種聚乙二醇修飾的抑肽酶的製備方法，其特徵在於製備反應按下式進行formulaseeoriginaldocumentpage3其中m代表dC4的低級烷氧基；其中PEG代表聚乙二醇長鏈；formulaseeoriginaldocumentpage3;其中R-NH2為抑肽酶；formulaseeoriginaldocumentpage3當D為O時，T為^;當D為一CH時，T為CH2;R為去除一個氨基(NH2)的抑肽酶分子；反應步驟如下在抑肽酶溶液中，加入磷酸氫二鈉溶液，調節其pH值在4.5-9.5;然後加入活化的聚乙二醇或其衍生物，反應溫度為44(TC;反應時間，o當T為i'時，反應時間為5120分鐘，當T為CH2時，反應時間為0.5到48小時；反應中活化的聚乙二醇或其衍生物與抑肽酶的摩爾比為0.1100;將反應混合液採用離子交換層析技術，離子交換層析採用陽離子交換層析，流動相為含NaCl的磷酸鹽緩衝液，即可得聚乙二醇修飾的抑肽酶。12.權利要求1-6所述的聚乙二醇修飾的抑肽酶，其在製備高效低毒的止血藥物或抗炎藥物中的用途。全文摘要本發明公開了一種聚乙二醇修飾的抑肽酶及其製備方法，其特徵在於，抑肽酶的氨基上連接有聚乙二醇或其衍生物鏈。本發明的聚乙二醇修飾的抑肽酶能夠提高抑肽酶的比活力，同時它顯著地降低了抑肽酶的免疫原性並提高了抑肽酶的穩定性，從而改善了抑肽酶的藥物動力學特性，提高了耐受性並減少了給藥次數。文檔編號A61P29/00GK101412995SQ20071013332公開日2009年4月22日申請日期2007年10月17日優先權日2007年10月17日發明者軍馮,呂達娜,張喜全,張來芳,鵬朱,娟潘,偉趙,珍趙申請人:上海醫藥工業研究院;江蘇正大天晴藥業股份有限公司