改進的抗-trkb抗體的製作方法

2023-10-19 06:01:07 2

專利名稱：改進的抗-trkb抗體的製作方法
技術領域：
本發明涉及酪氨酸受體激酶B (TAB)的抗體和抗原結合分子興奮劑。
背景技術：
I.TrkB酪氨酸受體激酶B (TrkB)屬於包含TrkA和TrkC的單跨膜受體酪氨酸激酶家族。 這些酪氨酸受體激酶(trk)介導神經營養蛋白的活性。神經營養蛋白為神經元存活及發育 所需，並通過調節神經元結構及突觸可塑性來調節突觸傳遞。神經營養蛋白包含但不限 於神經生長因子(NGF)、腦衍生神經營養因子(BDNF)、神經營養蛋白_3 (NT_3)和神經 營養蛋白-4/5(NT_4/5)。 (Lo, KY 等，J.Biol.Chem.，280:41744-52(2005))。TrkB 是 BDNF 的高親和力受體(Minichiello 等，Neuron 21 335-45 (1998))。結合 trk 的神經 營養蛋白激活受體，其二聚化並使受體胞內結構域上的特定酪氨酸殘基自磷酸化(Jing等 Neuron 9 1067-1079(1992) ； Barbacid, J.Neurobiol.25 1386-1403(1994) ； Bothwell, Ann.Rev.Neurosci.18 223253 (1995) ； Segal 禾口 Greenberg，Ann.Rev.Neurosci.19 463489(1996) ； Kaplan 和 Miller，Curr.Opinion Neurobiol. 10 381391(2000))。這些磷酸 酪氨酸殘基作為胞內信號發放(signaling)級聯元件的停泊位點，所述胞內信號發放級聯 導致神經元死亡的抑制和神經營養蛋白的其他效應。例如，She、FRS-2、SH2B、rAPS 和PLC Y通過磷酸化的酪氨酸殘基與TrkB相互作用。這些銜接分子與激活的TrkB的結合 導致信號發放途徑的開始，所述信號途徑包含促分裂原活化蛋白激酶途徑、磷脂醯肌醇 3-激酶途徑和PLC Y途徑，從而介導神經營養蛋白的作用(Lo，KY等，J.Biol.Chem.， 280 41744-52(2005))。II.糖尿病人血流中葡萄糖的濃度必須控制在相對嚴格的範圍(60-120毫克/分升血液)內 以維持正常的健康。若血糖降得過低，則導致產生稱為低血糖的病症，其症狀如昏暈、 虛弱、頭痛、意識錯亂和個性改變。由於過量葡萄糖與細胞、組織和器官中蛋白質之間 的化學反應，過量血糖或高血糖可引起組織損傷。認為該損傷會引起失明、腎衰竭、陽 痿、動脈粥樣硬化及對感染的易感性增加的糖尿病併發症。糖尿病與持續的和病理性升高的血糖濃度相關；在美國它是引起死亡的主要原 因之一，並佔全部死亡率的約5%。糖尿病分為兩種主要的亞類I型，也稱為青少年糖 尿病或胰島素依賴型糖尿病(IDDM)；和II型，也稱為成年型糖尿病或非胰島素依賴型 糖尿病(NIDDM)。II型糖尿病的診斷包含症狀的評估和尿及血液中葡萄糖的測量。血糖水平測定
6對準確的診斷是必需的。更具體而言，空腹血糖水平測定是所用的標準方法。然而，認 為口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)比空腹血糖水平更為靈敏。II型糖尿病與受損的口服葡萄 糖耐量(OGT)相關。因此，雖然通常並非診斷糖尿病所必需，但OGTT可幫助診斷II型 糖尿病(Emancipator K，Am J Clin Pathol 1997 年 11 月；112(5) 66574 ； Type 2Diabetes Mellitus，Decision Resources Inc., 2000 年 3 月)。因此，在個體中診斷受損的葡萄糖耐量，所述個體具有低於II型糖尿病的診斷 所需的空腹血糖水平，但在oGTT過程中具有介於正常人和糖尿病患者之間的血漿葡萄糖 反應。認為受損的葡萄糖耐量是前驅糖尿病病症，並且受損的葡萄糖耐量(由oGTT定 義)是發生II型糖尿病的強預測因子(Haffner S M，Diabet Med 1997年8月；14Suppl 3 S12 8)。II型糖尿病是與胰臟功能和/或其他胰島素相關過程減弱相關的進行性疾病，其 被升高的血糖水平加劇。因此，II型糖尿病通常具有延長的前驅糖尿病期，並且多種病 理生理學機制可導致病理學上的高血糖症和受損的葡萄糖耐量，例如，前驅糖尿病病症 中葡萄糖利用及有效性、胰島素作用和/或胰島素產生中的異常(GoldbergRB，Med Clin North Am 1998 年 7 月；82 (4) : 805 21)。與葡萄糖耐受不良相關的前驅糖尿病病症也可與對腹部肥胖症、胰島素抗性、 高脂血症及高血壓的易感性相關(Groop L、ForsblomC、Lehtovirta M, Am J Hypertens 1997 年 9 月；10(9Pt 2) 172S 180S ； Haffner SM, J Diabetes Complications 1997 年 3 月-4 月，11(2) 6976; Beck-Nielsen H、HenriksenJE、AlfordF、Hother-Nielson 0， Diabet Med 1996 年 9 月；13(9 附錄 6) S78 84)。在具有發生II型糖尿病風險的個體中進行早期幹預(其集中在降低病理學上的高 血糖症或受損的葡萄糖耐量)可預防或延遲向II型糖尿病及相關併發症的發展。因而， 通過有效治療受損的口服葡萄糖耐量和/或升高的血糖水平，人們可以預防或抑制該障 礙向II型糖尿病發展。見例如美國專利號7,109,174。胰島素和磺醯脲類(口服低血糖治療劑)是美國當今建議的兩類主要的糖尿病藥 物。建議胰島素用於I型和II型糖尿病二者，而通常建議磺醯脲類僅用於II型糖尿病。 磺醯脲類刺激天然胰島素的分泌並降低胰島素抗性；這些化合物並不代替胰島素在代謝 中的功能。大約三分之一接受磺醯脲的患者變得對其具有抗性。一些II型糖尿病患者不 響應磺醯脲治療。在對磺醯脲首次治療不響應的患者中，5-10%在約10年後可能經歷磺 醯脲有效性的喪失。見例如美國專利號7,115,284。通常建議用於治療II型糖尿病的許多抗糖尿病劑(例如磺醯脲類和噻唑烷二酮 類)具有所不希望的增加體重的副作用。因代謝失調和內分泌失調的增強，具有前驅糖 尿病病症或具有診斷的II型糖尿病的患者中增加的體重產生有害作用，而肥胖症本身就 是II型糖尿病發生及進行性惡化的關鍵性風險因素。因此希望具有維持或減輕體重的抗 糖尿病劑。見例如美國專利號7,199,174。肥胖症是常見且非常嚴重的公共健康問題，因為它增加了個人患許多嚴重疾病 的風險，所述疾病包含糖尿病、心臟病、中風、高血壓和一些類型的癌症。在過去二十 年裡，肥胖個體數量上的大量增加已經產生了深遠的公共健康問題。雖然研究已表明 通過飲食及鍛鍊而減少肥胖症顯著降低相關危險因素，但鑑於肥胖症與遺傳學上的遺傳因素緊密相關，這些治療大多不成功，所述遺傳因素促進食慾增強、對高熱量食物的偏 愛、體力活動減少及脂肪生成代謝提高。見例如美國專利號7,115,767。III.Rett 綜合症Rett綜合症(RTT)最先由Andreas Rett博士在1966年鑑定，是源自晚期神經發 育缺陷的破壞性CNS障礙。它以1/10,000-15,000活產的比例幾乎專一性地影響所有種族 的少女。一些患有RTT的個體在幼年死亡；但是，許多個體可以活至成年並重度殘疾。 高達25%的患者死於心臟/呼吸衰竭。至今沒有該疾病的有效療法。在表面上正常的發育期之後，受影響的女孩在6-18個月的年齡發展出RTT症 狀，所述症狀在隨後幾年內進行性惡化。症狀包含出生時頭圍正常，隨後頭部生長減 速；獲得性語言能力散失、交流障礙、認知同能障礙；刻板的手部動作(扭曲的手部扭 絞、洗手、鼓掌、撫拍等)代替有目的的手部技能；受損的或惡化的行進(步態共濟失 調、僵硬等)；清醒時呼吸困難；來自嬰兒早期的受損的睡眠模式；伴隨肌肉萎縮和張 力障礙的異常肌緊張；外周血管舒縮障礙；進行性脊柱側凸或脊柱後凸；和生長阻滯。該障礙還表徵為中樞自主功能障礙，且Rett患者顯示以下症狀中的一些或全 部屏氣期、淺呼吸、通氣增強、延長的呼吸暫停組成的多重呼吸節律障礙；伴隨基線 心臟迷走緊張降低的心率失常；和心臟壓力反射器敏感性。這些症狀是威脅生命的，並 使Rett患者處於猝死的風險。它們表明腦幹的不成熟和覺醒時心肺網絡及下丘腦或邊緣 皮質內整合抑制的缺乏。此外，在Rett患者中報導了腦幹神經營養蛋白信號發放(NGF 和BDNF)中的改變，也報導了單胺(5-羥色胺，去甲腎上腺素)和神經肽(P物質)水平 的降低。RTT是單基因疾病，其在絕大部分病例中由X染色體連鎖基因mecp2中的突變 引起，該基因編碼轉錄阻抑物MeCP2(甲基CpG胞嘧啶結合蛋白2)。MeCP2優先結合 甲基化DNA。神經營養蛋白因子BDNF是已知的MeCP2的直接靶標，且是去甲腎上腺 素神經元和5-羥色胺神經元的重要營養因子。令人驚奇地，Mecp2-KO小鼠腦 BDNF缺乏，而腦BDNF的遺傳過量表達可以提高它們的壽命，並拯救(rescue)它 們的一些行動缺陷。在人類中鑑定的BDNF缺乏障礙包含Rett綜合症、維爾姆斯瘤 (Wilms』 tumor),無虹膜、泌尿生殖異常和智力發育遲緩(WAGR)綜合症(Han等，N Engl J Med (2008) 359 (9) 918-27)、黑皮質素受體MC4R缺乏引起的肥胖症(Farooqi和 0，Rahilly，EndocrineRev(2006) 27 (7) 710-18)、惡病質 / 肌肉萎縮綜合症(Lin 等， PloS, 3(4) el900 ； WO 2007/088476)。發明概述一方面，本發明提供結合酪氨酸受體激酶B(TrkB)的抗體。在一些實施方案 中，所述抗體包含(a)重鏈可變區，其包含人重鏈V區段、重鏈互補決定區3 (CDR3)和重鏈構架 區 4(FR4)，和(b)輕鏈可變區，其包含人輕鏈V區段、輕鏈CDR3和輕鏈FR4，其中i)重鏈 CDR3 包含胺基酸序列 V(T/V) (S/T/R/N) WFAY (SEQ IDNO 34)；禾口ii)輕鏈 CDR3 可變區包含胺基酸序列(S/M) QGT (H/A) (E/V/l) PYT (SEQ IDNO42)；和
其中該抗體是TrkB激動劑。
另一方面，本發明提供特異性結合TrkB的抗體。
在一些實施方案中，所述抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中重鏈可變區和輕鏈可變區各包含以下三個互補決定區(CDR)CDRl、CDR2和CDR3；其中
i)重鏈可變區的CDRl包含SEQ ID NO25的胺基酸序列；
ii)重鏈可變區的CDR2包含選自SEQ ID NO28、SEQ ID NO29和SEQ IDNO30的胺基酸序列；
iii)重鏈可變區的CDR3包含選自SEQ ID NO32和SEQ ID NO33的胺基酸序列；
iv)輕鏈可變區的CDRl包含選自SEQ ID NO35、SEQ ID NO36和SEQ IDNO37的胺基酸序列；
V)輕鏈可變區的CDR2包含SEQ ID NO39的胺基酸序列；
vi)輕鏈可變區的CDR3包含選自SEQ ID NO40和SEQ ID NO41的胺基酸序列。
在一些實施方案中，重鏈CDR3包含選自SEQ ID NO32和SEQ IDNO33的胺基酸序列；輕鏈CDR3包含選自SEQ ID NO40和SEQ IDNO41的胺基酸序列。
在一些實施方案中，重鏈FR4是人種系FR4。
在一些實施方案中，重鏈FR4是SEQ ID NO50。
在一些實施方案中，重鏈工區段包含人種系JH4部分序列WGQG了LV了VSS(SEQ ID NO50)。
在一些實施方案中，輕鏈FR4是人種系FR4。
在一些實施方案中，輕鏈FR4是人種系Jk2部分序列FGQGKLEIK(SEQ ID NO61)。
在一些實施方案中，重鏈V區段和輕鏈V區段各包含互補決定區l(CDR)和互補決定區2(CDR2)；其中
i)重鏈V區段的CDRl包含SEQ ID NO27的胺基酸序列；
ii)重鏈V區段的CDR2包含SEQ ID NO3l的胺基酸序列；
iii)輕鏈V區段的CDRl包含SEQ ID NO38的胺基酸序列；和
iv)輕鏈V區段的CDR2包含SEQ ID NO39的胺基酸序列。
在一些實施方案中，
i)重鏈V區段的CDRl包含SEQ ID NO25；
ii)重鏈V區段的CDR2包含SEQ ID NO28；
iii)重鏈CDR3包含SEQ ID NO32；
iV)輕鏈V區段的CDRl包含SEQ ID NO35
v)輕鏈 V 區段的 CDR2 包含 SEQ ID NO 38 ；禾口vi)輕鏈 CDR3 包含 SEQ ID NO 41。在一些實施方案中，i)重鏈 V 區段的 CDR1 包含 SEQ ID NO 25 ；ii)重鏈 V 區段的 CDR2 包含 SEQ ID NO 28 ；iii)重鏈 CDR3 包含 SEQ ID NO 32 ；iv)輕鏈 V 區段的 CDR1 包含 SEQ ID NO 36 ；v)輕鏈 V 區段的 CDR2 包含 SEQ ID NO 38 ；禾口vi)輕鏈 CDR3 包含 SEQ ID NO 40。在一些實施方案中，i)重鏈 V 區段的 CDR1 包含 SEQ ID NO 25 ；ii)重鏈 V 區段的 CDR2 包含 SEQ ID NO 28 ；iii)重鏈 CDR3 包含 SEQ ID NO 32 ；iv)輕鏈 V 區段的 CDR1 包含 SEQ ID NO 37 ；v)輕鏈 V 區段的 CDR2 包含 SEQ ID NO 38 ；禾口vi)輕鏈 CDR3 包含 SEQ ID NO 40。在一些實施方案中，i)重鏈 V 區段的 CDR1 包含 SEQ ID NO 25 ；ii)重鏈 V 區段的 CDR2 包含 SEQ ID NO 29 ；
iii)重鏈 CDR3 包含 SEQ ID NO 32 ；iv)輕鏈 V 區段的 CDR1 包含 SEQ ID NO 35 ；v)輕鏈 V 區段的 CDR2 包含 SEQ ID NO 38 ；禾口vi)輕鏈 CDR3 包含 SEQ ID NO 41。在一些實施方案中，重鏈可變區與SEQ ID NO: 4的可變區具有至少90%氨基 酸序列同一性，且輕鏈可變區與SEQ ID NO 11的可變區具有至少90%胺基酸序列同一 性。在一些實施方案中，重鏈可變區與選自SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3的可變區具有至少90%胺基酸序列同一性，且輕鏈可變區與選自SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9 和 SEQ ID NO :
10的可變區具有至少90%胺基酸序列同一性。在一些實施方案中，重鏈可變區與選自SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3的可變區具有至少95%胺基酸序列同一性，且輕鏈可變區與選自SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9 和 SEQ ID NO :
10的可變區具有至少95%胺基酸序列同一性。在一些實施方案中，重鏈可變區包含選自SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2和 SEQ ID NO 3的胺基酸序列，且輕鏈可變區包含選自SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、 SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9 和 SEQ IDNO 10 的胺基酸序列。在一些實施方案中，抗體以低於5x10_8M的平衡解離常數(Kd)結合TrkB。在一些實施方案中，抗體是FAb』片段。在一些實施方案中，抗體是IgG。在一些實施方案中，抗體是單鏈抗體(SCFV)。
在一些實施方案中，抗體包含人恆定區。r0081] 在一些實施方案中，抗體不結合酪氨酸激酶受體A或酪氨酸激酶受體C。
在一些實施方案中，抗體結合TrkB的配體結合結構域(LBD)。
在一些實施方案中，抗體與腦衍生神經營養因子競爭結合TrkB。
在一些實施方案中，抗體包含含有S[。ID NOl的重鏈和含有S[。ID NO8的輕鏈。
在一些實施方案中，抗體包含含有S[。ID NOl的重鏈和含有S[。ID NO9的輕鏈。
在一些實施方案中，抗體包含含有S[。ID NOl的重鏈和含有S[。ID NOlo的輕鏈。
在一些實施方案中，抗體包含含有S[。ID NO3的重鏈和含有S[。ID NO8的輕鏈。
另一方面，本發明提供可藥用組合物，其包含本發明的抗體和生理學上相容的賦形劑。
可藥用組合物的實施方案如上文針對抗體所述。r0087] 在一些實施方案中，藥物組合物還包含用於減輕或抑制呼吸窘迫的藥劑(ag[nt『)，例如去甲腎上腺素和／或5一羥色胺途徑的激活劑。
第二藥劑可以是三環抗抑鬱劑，例如地昔帕明(DMI)。
在一些實施方案中，第二藥劑是5一羥色胺lA受體部分激動劑，例如丁螺環酮(bllspil『on[)1氟西汀(Flllox[tin[)和瑞波西汀(R[box[tin[)。
在一些實施方案中，第二藥劑是穀氨酸能AMPA受體的激活劑，例如AMPAkin[ CX54。在一些實施方案中，第二藥劑是前列腺素1孕酮或TrkB活性的增效劑(例如蛋白質酪氨酸磷酸酶抑制劑)。
在一些實施方案中，藥物組合物還包含在個體中降低血糖水平的藥劑。
在一些實施方案中，藥物組合物還包含在個體中減輕體重的藥劑。
在相關的方面，本發明提供通過對有需要的個體施用本發明的抗體來治療1減輕1抑制1緩解和／或預防BDNF缺乏引起的障礙的方法。
該治療方法的實施方案如上文及此處針對抗體所述。
在一些實施方案中，在全身或外周施用抗體，例如口服施用1吸入施用1靜脈內施用或腹膜內施用。
在一些實施方案中， BDNF缺乏引起的障礙選自R[tt綜合症1WAR綜合症1MC4R缺乏引起的肥胖症和惡病質(例如由癌症1衰老1進食障礙或藥物引起，包含阿片樣物質誘導的嘔吐)。
在另一方面，本發明提供在有需要的個體中降低血糖水平和／或體重的方法，該方法包括對個體施用治療有效量的本發明的抗體。
該治療方法的實施方案如上文及此處針對抗體所述。
關於該方法的其他實施方案，在一些實施方案中，所述個體是前驅糖尿病患者。
在一些實施方案中，所述個體患有I型糖尿病。
在一些實施方案中，所述個體患有Ⅱ型糖尿病。
在一些實施方案中，所述個體超重。
在一些實施方案中，所述個體肥胖。
在一些實施方案中，所述方法還包括對個體施用有效降低血糖的治療有效量的第二藥劑的步驟。
在一些實施方案中，所述第二藥劑選自胰島素1磺醯脲類1促胰島素劑1二甲雙胍1PPA—RY激動劑1PPARo激動劑1PPAR 6激動劑1PPARo／Y雙激動劑1PPAR o／Y／6泛激動劑1 o一葡糖苷酶抑制劑1DPP一Ⅳ抑制劑和GLP—l／GLP—l類似物。在一些實施方案中，所述方法還包括對個體施用有效減輕體重或肥胖症的治療 有效量的第二藥劑的步驟。在一些實施方案中，所述第二藥劑選自脂肪酶抑制劑、西 布茶明(sibutramine)、CB_1抑制劑、託吡酯(topiramate)、糊精、糊精類似物、瘦素、 PYY/PYY類似物和GLP-1/GLP-1類似物。在一些實施方案中，所述第二藥劑和抗體作為混合物施用。在一些實施方案 中，第二藥劑和抗體分開施用。定義「抗體」指免疫球蛋白家族的多肽或包含免疫球蛋白的片段的多肽，其能夠非 共價地、可逆地和以特異性的方式結合相應抗原。示例性抗體結構單位包含四聚體。每 個四聚體由兩對相同的多肽鏈組成，每對多肽鏈具有一條「輕」鏈(約25kD)和一條
「重」鏈(約50-70kD)，二者通過二硫鍵連接。已確認的免疫球蛋白基因包含k、入、 a、Y、5、￡和ii恆定區基因，以及無數免疫球蛋白可變區基因。輕鏈分類為K或 入。重鏈分類為Y、a、S或￡，其分別依次定義免疫球蛋白類型IgG、IgM、 IgA、IgD和IgE。每條鏈的N端定義了約100-110或更多個胺基酸的可變區，其主要負 責抗原識別。術語可變輕鏈(VJ和可變重鏈(VH)分別指重鏈和輕鏈的這些區域。如 本申請中所用，「抗體」包含對例如TAB具有特定結合特異性的抗體的所有變體及其片 段。因此，具有相同結合特異性的全長抗體、嵌合抗體、單鏈抗體(ScFv)、Fab、Fab' 和這些片段的多聚體形式(例如F(ab' )2)都在此概念的範圍之內。「互補性決定結構域」或「互補決定區」(「CDR」)可互換地指和VH的 高變區。CDR具有對此類靶蛋白的特異性的抗體鏈的靶蛋白結合位點。每個人\^或乂11 中具有3個CDR(CDR1_3，從N端順次編號)，它們組成可變結構域的大約15-20 %。 CDR在結構上與靶蛋白的表位互補，從而直接負責結合特異性。乂^或乂11的其餘延伸 (所謂的構架區)在胺基酸序列中顯示較少變異(Kuby，Immunology,第四版，第四 章.W.H.Freeman&Co.，New York, 2000)。用多種本領域熟知的定義來確定CDR和構架區的位置，例如Kabat，Chothia, 國際ImMunoGeneTics資料庫(IMGT)(在全球資訊網imgt.cines.fr/上)禾P AbM (見例如 Johnson 等，Nucleic Acids Res.，29: 205-206 (2001) ； Chothia 和 Lesk, J.Mol.Biol.， 196 901-917(1987) ； Chothia 等，Nature, 342 877-883(1989) ； Chothia 等，J.Mol. Biol., 227 799-817(1992) ； AHLazikani等，J.Mol.Biol., 273 927-748(1997))。抗原 結合部位的定義也描述於以下中Ruiz等，Nucleic Acids Res.，28: 219-221(2000)；和 Lefranc, M.P., Nucleic Acids Res.，29 207-209 (2001) ； MacCallum 等，J.Mol.Biol.， 262 732-745(1996)；和 Martin 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 86: 9268-9272(1989)； Martin 等，Methods Enzymol.，203 121-153(1991)；和 Rees 等，InSternberg M.J.E.(編 輯)，Protein Structure Prediction，牛津大學出版社，牛津，141-172(1996)。術語「結合特異性決定簇(determinant) 」或「BSD」可互換地指互補決定區內 決定抗體結合特異性必需的最小連續或非連續胺基酸序列。最小結合特異性決定簇可以 處於一個或多個CDR序列中。在一些實施方案中，最小結合特異性決定簇處於抗體重鏈 CDR3和輕鏈CDR3序列的部分或全長內(即由其單獨決定)。
如本文所用，「抗體輕鏈」或「抗體重鏈」分別指包含\^或多肽。內源 Vl由基因區段V(可變的)和J(連接的)編碼，內源VH由V、D (多樣性)和J編碼。 每個\^或乂11包含CDR以及構架區。在本申請中，抗體輕鏈和/或抗體重鏈有時可以 共同稱為「抗體鏈」。如本領域技術人員將容易地認識到，這些術語包含含有不破壞 或VH基本結構的突變的抗體鏈。抗體以完整的免疫球蛋白或經多種肽酶消化產生的大量充分表徵的片段存 在。因此，例如，胃蛋白酶在鉸鏈區中的二硫鍵處消化抗體，以產生Fab』的二聚體 F(ab) 『 2，所述Fab』本身是通過二硫鍵結合VH_CH1的輕鏈。可在溫和條件下還原 F(ab)' 2，以斷裂鉸鏈區中的二硫鍵，從而將F(abV 2 二聚體轉化為Fab'單體。Fab' 單體基本上是具有部分鉸鏈區的Fab。Paul，Fundamental Immunology第三版(1993)。 雖然多種抗體片段是根據完整抗體的消化定義的，但技術人員將理解，可通過化學或使 用重組DNA方法從頭合成這類片段。因此，如本文所用，術語「抗體」也包含通過 全長抗體的修飾產生的抗體片段，或使用重組DNA方法從頭合成的抗體片段(例如單 鏈Fv)，或使用噬菌體展示文庫鑑定的抗體片段(見例如McCafferty等，Nature 348 552-554(1990))。對於單克隆或多克隆抗體的製備，可使用本領域已知的任意技術(見例如 Kohler&Milstein, Nature256 495-497(1975) ； Kozbor 等，Immunology Today 4 72(1983) ； Cole 等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 77-96 頁 Alan R.Liss, Inc.1985)。用於產生單鏈抗體的技術(美國專利號4,946,778)可適用於產生針對本發明 多肽的抗體。同樣，轉基因小鼠或其他生物(如其他哺乳動物)可用於表達人源化抗體。 備選地，噬菌體展示技術可用於鑑定特異性結合所選抗原的抗體和異聚體Fab片段(見例 如 McCafferty 等，上文；Marks 等，Biotechnology, 10: 779-783(1992))。人源化或靈長類動物源化非人抗體的方法為本領域所熟知。通常，人源化抗體 具有一個或多個從非人來源引入其中的胺基酸殘基。這些非人胺基酸殘基常稱為輸入殘 基(import residue)，其通常取自輸入可變結構域。基本上可以按Winter及其同事的方法 (Jones 等，Nature 321: 522-525(1986) ； Riechmann 等，Nature 332 323-327(1988)； Verhoeyen 等，Science239 1534-1536 (1988)和 Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2 593-596(1992))，通過將嚙齒類動物的CDR或CDR序列替換為相應的人抗體序列來進行 人源化。因此，這類人源化抗體是嵌合抗體(美國專利號4,816,567)，其中基本上已通 過來自非人物種的相應序列替換少於完整的人可變結構域。實際上，人源化抗體通常是 人抗體，其中用來自嚙齒類動物抗體中類似部位的殘基替換一些互補決定區(「CDR」) 殘基和可能替換一些構架區(「FR」 )殘基。「嵌合抗體」是抗體分子，其中(a)恆定區或其部分被改變、替換或交換，使得 抗原結合部位(可變區)連接到不同的或改變類型的效應子功能和/或物種分子，或者完 全不同的分子(其賦予嵌合抗體新的性質，例如酶、毒素、激素、生長因子和藥物)的恆 定區上；或(b)可變區或其部分被具有不同的或改變的抗原特異性的可變區改變、替換 或交換。術語「可變區」 或「V區」 可互換地指包含 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的重鏈或輕鏈。見

圖1。 內源可變區由免疫球
13蛋白重鏈V-D-J基因或輕鏈V-J基因編碼。V區可以是天然存在的、重組的或合成的。如本文所用，術語「可變區段」或「V區段」可互換地指包含 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3的可變區的子序列。見圖1。 內源V區段由免疫球蛋白V 基因編碼。V區段可以是天然存在的、重組的或合成的。如本文所用，術語「J區段」指所編碼的包含CDR3的C端部分和FR4的可變區 的子序列。內源J區段由免疫球蛋白J基因編碼。見圖1。J區段可以是天然存在的、 重組的或合成的。「人源化」抗體是保留非人抗體的反應性，而在人類中免疫原性較低的抗體。 這例如可通過保留非人CDR區並用它們的人類對應物替換抗體的其餘部分來實現。見 例如 Morrison 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81 6851-6855(1984) ； Morrison 禾P Oi, Adv.Immunol.，44: 65-92(1988) ； Verhoeyen 等，Science，239 1534-1536(1988)； Padlan, Molec.Immun.，28: 489-498 (1991) ； Padlan, Molec.Immun.，31(3) 169-217(1994)。術語「相應的人種系序列」指編碼人可變區胺基酸序列或子序列的核酸序列， 與所評估的其他所有由人種系免疫球蛋白可變區序列編碼的可變區胺基酸序列相比，所 述序列或子序列與參考可變區胺基酸序列或子序列具有最高的測定的胺基酸序列同一 性。相應的人種系序列還可以稱為與所評估的所有其他可變區胺基酸序列相比，與參考 可變區胺基酸序列或子序列具有最高的胺基酸序列同一性的人可變區胺基酸序列或子序 列。相應的人種系序列可以僅是構架區、僅是互補決定區、構架區和互補決定區、可變 區段(如上文所定義)或包含可變區的序列或子序列的其他組合。可以用本文所述的 方法測定序列同一性，例如用BLAST、ALIGN或本領域已知的其他比對算法比對兩條 序列。相應的人種系核酸或胺基酸序列與參考可變區核酸或胺基酸序列可以具有至少 約90%、92%, 94%, 96%, 98%, 99%序列同一性。可以通過例如公開可得的國際 ImMunoGeneTics 資料庫(IMGT)(在全球資訊網 imgt.cines.fr/ 上)和 V-base (在全球資訊網 vbase. mrc_cpe.cam.ac.uk上)確定相應的人種系序列。用於描述抗原(如蛋白質)與抗體或抗體衍生的結合劑之間的相互作用的背景 時，短語「特異性(或選擇性)結合」指確定抗原在蛋白質和其他生物製品的異源群體中 存在的結合反應。因此，在指定的免疫測定條件下，具有特定結合特異性的抗體或結合 劑至少兩倍於背景結合特定抗原，且基本上不大量結合樣品中存在的其他抗原。這種條 件下的特異性結合抗體或結合劑可以需要已針對抗體或結合劑對特定蛋白質的特異性對 其進行了選擇。可通過扣除與例如來自其他物種(如小鼠)的TrkB或其他Trk亞型(例 如TrkA、TrkC等)的交叉反應的抗體來完成這種選擇。多種免疫測定形式可用於選擇與 特定蛋白質特異性免疫反應的抗體。例如，固相ELISA免疫測定法常規用於選擇與蛋白 質特異性免疫反應的抗體(見例如Harlow&Lane，Using Antibodies,實驗室手冊(1988)， 關於可用於測定特異性免疫反應的免疫測定形式和條件的描述)。通常，特異性或選擇性 結合反應將產生至少兩倍於背景信號的信號，並且更通常地高於10到100倍背景。術語「平衡解離常數(Kd，M)」指解離速率常數(kd，時間―1)除以結合速率常 數(ka，時間、M—1)。可以用任意本領域已知的方法測量平衡解離常數。本發明的抗 體一般具有低於約10_7M或10_8M的平衡解離常數，例如低於約10_9M或10_"^，在一些
14實施方案中低於約10-"M、10_12M或10_13M。如本文所用，術語「抗原結合區」指本發明的TAB結合分子的結構域，其負責 該分子和TrkB間的特異性結合。抗原結合區包含至少一個抗體重鏈可變區和至少一個抗 體輕鏈可變區。至少有一個這類抗原結合區存在於本發明的每個TrkB結合分子中，且每 個抗原結合區可以相同或彼此之間不同。在一些實施方案中，本發明的TrkB結合分子的 至少一個抗原結合區作為TrkB的激動劑。術語「抗體激動劑」或「激動劑」可互換地指能夠激活受體以誘導全部或部分 (例如至少60% )受體介導的應答的抗體。例如，TrkB激動劑結合TrkB並誘導TrkB介 導的信號發放。在一些實施方案中，可通過其結合TrkB和在接觸SH-SY5Y細胞時誘導 神經突派生(outgrowth)的能力或按照本文另作的描述來鑑定TrkB抗體激動劑。在其他實 施方案中，如在本文所述的失巢凋亡測定中所測量，可以通過其拯救細胞免於脫附作用 依賴的凋亡的能力來鑑定TrkB抗體激動劑。認為在如本文所述的失巢凋亡測定中具有低 於5nM的EC50的抗-TrkB抗體是TrkB抗體激動劑，例如低於InM、500pM、250pM、 100pM、50pM 或 30pM。術語「TrkB」或「酪氨酸受體激酶B」可互換地指受體酪氨酸激酶的原肌球蛋 白相關激酶(Trk)家族的三個成員之一，其他成員是TrkA和TrkC。TrkB是神經營養性酪 氨酸受體激酶(NTRK)家族的成員，也稱為2型神經營養性酪氨酸激酶受體(NTRK2)。 TrkB是膜結合的受體，神經營養蛋白結合時，其磷酸化自身和MAPK途徑的成員。 TrkB的配體包含腦衍生神經營養因子(BDNF)和神經營養蛋白_3。見例如Haniu等， ArchBiochem Biophys (1995) 322 (1) 256-264; Squinto 等，Cell (1991) 65 (5) 885-893 ； 和Soppe等，Cell (1991) 65 (5) 895-903。通過TrkB的信號發放導致細胞分化。已將這個 基因中的突變與肥胖症和心境障礙相關聯。存在編碼不同TrkB同種型的其他轉錄剪切變 體。已知TrkB的核酸和胺基酸序列，並已公開於GenBank檢索號NM_001018064 (gi 65506744，PRI18-NOV-2007)。 還見 GenBank 檢索號 BC075804.1、U12140.1、 BC031835.1和AF410899.1。如本文所用，TrkB多肽在功能上是酪氨酸激酶受體，它通 過BDNF或神經營養蛋白-3的結合來激活，並通過磷酸化自身和MAPK途徑的成員來引 發細胞內信號發放。在結構上，TrkB胺基酸序列與GenBank檢索號NP_001018074.1、 AAB33109、AAL67968、AAL67964、AAC51371.1、AAH31835.1 或 AAL67965.1 的氨 基酸序列具有至少約 90%、91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 或100%的序列同一性。在結構上，TrkB核酸序列與GenBank檢索號NM_001018064、 S76473、BC075804.1、U12140.1、BC031835.1 或 AF410899.1 的核酸序列具有至少約 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 %或 100 % 的序列同一 性。本發明多肽的「活性」指多肽在其天然細胞或組織中的結構功能、調節功能或 生物化學功能。多肽活性的實例包含直接活性和間接活性二者。示例性直接活性是與多 肽直接相互作用的結果，包含配體結合，如BDNF與TrkB的配體結合結構域(LBD)的結 合(見例如 Naylor 等，Biochem Biophys Res Commun.291 (3) 501-7(2002))、第二信使 (例如cAMP、cGMP、IP3、DAG或Ca2+)的產生或耗盡、離子流及磷酸化水平或轉錄水 平的變化。在TrkB的背景中，示例性間接活性被視為細胞或組織中對多肽直接活性的表型或響應中的變化，例如由於多肽與其他細胞或組織成分的相互作用而降低整體血糖水平。當用於指成年人時，術語「肥胖的」指具有30或更高的體重指數(BMI)的個 體。當用於指成年人時，「超重」指具有25或更高BMI的個體。對於兒童，使用年 齡體重指數圖，其中認為BMI高於第85百分位數是「超重」，並且認為BMI高於第95 百分位數是「肥胖」。見例如 Clinical Guidelines on the Identification, Evaluation, and Treatment of Overweight and Obesity in Adult (National Heart, Lung and Blood Institute，June 17，1998)和世界衛生組織肥胖症協會(WHO，Geneva, June 1997)的報告中的Preventing and Managing the Global Epidemic of Obesity。「前驅糖尿病個體」指空腹血糖水平高於llOmg/dl但低於126mg/dl，或2小時 PG讀數高於140mg/dl但低於200mg/dl的成人。當用於與來自患者的樣品比較時，「糖 尿病個體」指空腹血糖水平高於126mg/dl或2小時PG讀數高於200mg/dl的成人。「空 腹」指無熱量攝入至少8小時。「2小時PG」指使患者接受葡萄糖負荷後的血糖水平， 所述葡萄糖負荷含有溶解在水中的75g無水葡萄糖當量。所有測試通常稱作口服葡萄糖 耐量試驗(OGTT)。見例如 Diabetes Care，2003，26(11) 3160-3167(2003)。當應用於核酸或蛋白質時，術語「分離的」表示所述核酸或蛋白質基本上不含 在天然狀態中與其結合的其他細胞成分。它優選處於均一狀態。它可以是乾燥的或水 溶液。通常使用分析化學技術如聚丙烯醯胺凝膠電泳或高效液相色譜來測定純度和同質 性。在製劑中以優勢種類存在的蛋白質是基本上純化的。具體而言，分離的基因從所 述基因兩側的可讀框分開，並編碼不同於目的基因的蛋白質。術語「純化的」表示核酸 或蛋白質在電泳凝膠中產生基本上一條帶。特別地，它指所述核酸或蛋白質為至少85% 純、更優選至少95%純和最優選至少99%純。術語「核酸」或「多核苷酸」指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核酸(DNA)或 核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特別限制，所述術語包含含有天然核苷酸的已知類 似物的核酸，其具有與參考核酸相似的結合性質，並以與天然存在的核苷酸相似的方式 進行代謝。除非另有指出，具體的核酸序列也暗含其保守修飾變體(例如簡併密碼子 取代)、等位基因、直向同源物、SNP和互補序列及明確指出的序列。具體地，可通 過產生其中一個或多個所選(或全部)密碼子的第三個位置被混合鹼基和/或脫氧肌苷 殘基取代的序列來完成簡併密碼子取代(Batzer等，Nucleic Acid Res. 19 : 5081(1991)； Ohtsuka 等，J.Biol.Chem.260 2605-2608(1985)；和 Rossolini 等，Mol.Cell.Probes 8 91-98(1994))。術語「多肽」、「肽」和「蛋白質」在本文中可互換使用來指胺基酸殘基的聚 合物。所述術語應用於胺基酸聚合物，其中一個或多個胺基酸殘基是相應的天然存在的 胺基酸的人工化學模擬物，還應用於天然存在的胺基酸聚合物和非天然存在的胺基酸聚 合物。術語「胺基酸」指天然存在的和合成的胺基酸，及以與天然存在的胺基酸類似 的方式發揮功能的胺基酸類似物和胺基酸模擬物。天然存在的胺基酸是由遺傳密碼編碼 的那些胺基酸，及後來被修飾的那些胺基酸，例如羥脯氨酸、Y-羧基穀氨酸和ο-磷 酸絲氨酸。胺基酸類似物指與天然存在的胺基酸具有相同的基本化學結構(即結合氫的α-碳、羧基、氨基和R基團)的化合物，例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞碸、甲 硫氨酸甲基鋶。這類類似物具有經修飾的R基團(例如正亮氨酸)或經修飾的肽主鏈， 但保留與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構。胺基酸模擬物指具有與胺基酸的一般 化學結構不同的結構，但以與天然存在的胺基酸類似的方式發揮功能的化合物。「保守修飾變體」應用於胺基酸序列和核酸序列二者。對於具體核酸序列， 「保守修飾變體」指編碼相同或基本上相同的胺基酸序列或其中所述核酸不編碼胺基酸
序列的那些核酸，或指基本上相同的序列。由於遺傳密碼的簡併性，大量功能上相同的 核酸編碼任意給定的蛋白質。例如，密碼子GCA、GCC> GCG和GCU均編碼胺基酸丙 氨酸。因此，在丙氨酸被密碼子指定的每個位置上，可在不改變編碼的多肽的情況下將 所述密碼子改變成所描述的任意對應的密碼子。這種核酸變異是「沉默變異」，其是保 守修飾變異的一種。本文編碼多肽的每個核酸序列也描述了所述核酸的每種可能的沉默 變異。技術人員將認識到，可修飾核酸中的每個密碼子(除了 AUG(其通常是甲硫氨酸 的唯一密碼子)和TGG(其通常是色氨酸的唯一密碼子))以產生功能上相同的分子。因 此，在每個所述序列中暗含編碼多肽的核酸的每種沉默變異。對於胺基酸序列，技術人員將認識到，對核酸、肽、多肽或蛋白質序列的個別 取代、缺失或添加(其改變、添加或缺失編碼序列中的單個胺基酸或少部分胺基酸)是
「保守修飾變體」，其中所述改變導致化學上類似的胺基酸取代胺基酸。提供功能上類 似的胺基酸的保守取代表為本領域熟知。這類保守修飾變體是除本發明多態性變體、種 間同源物和等位基因之外的，而不排除本發明的多態性變體、種間同源物和等位基因。以下8組各包含彼此是保守取代的胺基酸1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、穀氨酸(E)；3)天冬醯胺(N)、穀氨醯胺(Q)；4)精氨酸(R)、賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(見例如 Creighton，Proteins(1984))。通過在比較窗內比較兩條最佳比對的序列來確定「序列同一性百分比」，其中 為了兩條序列的最佳比對，與不包含添加或缺失的參考序列(例如本發明的多肽)相比， 比較窗中的多核苷酸序列部分可包含添加或缺失(即空位)。按如下計算百分比確定 相同核酸鹼基或胺基酸殘基在兩條序列中都存在的位置數以產生匹配位置的數量，將匹 配位置的數量除以比較窗中位置的總數並將結果乘以100來產生序列同一性的百分比。在兩條或多條核酸序列或多肽序列的背景中，術語「同一的」或百分比「同一 性」指相同序列的兩條或更多條序列或子序列。如使用以下序列比較算法之一或通過手 動比對和目檢測定所測量，當在比較窗或指定區域內比較和比對最大對應時，若兩條序 列具有相同的胺基酸殘基或核苷酸的指定百分比(即在指定區域內或未指定時在參考序 列的全序列內具有 70%、75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%或 99% 的 序列同一性)，則兩條序列是「基本上同一的」。本發明提供分別與本文所示例的多肽
17或多核苷酸(例如SEQ ID NO 1-11中任一個所示例的可變區；SEQID NO 12-24中 任一個所示例的可變區段；SEQ ID NO 25-42中任一個所示例的CDR ； SEQ ID NO 43-61中任一個所示例的FR ；和SEQ ID NO 62-73中任一個所示例的核酸序列)基本 上同一的多肽或多核苷酸。可選地，同一性存在於長度為至少約15、25或50個核苷酸 的區域內，或更優選長度為100到500或1000或更多個核苷酸的區域內，或參考序列的 全長內。對於胺基酸序列，同一性或基本的同一性可存在於長度為至少5、10、15或20 個胺基酸，可選地長度為至少約25、30、35、40、50、75或100個胺基酸的區域內，可 選地長度為至少約150、200或250個胺基酸的區域內，或參考序列的全長內。對於更短 的胺基酸序列(例如20或更少個胺基酸的胺基酸序列)，當根據本文所定義的保守取代來 保守地取代一個或兩個胺基酸殘基時，存在基本的同一性。為了進行序列比較，通常一條序列作為參考序列，測試序列與其進行比較。當 使用序列比較算法時，將測試序列和參考序列輸入計算機，必要時指定子序列坐標並指 定序列算法程序參數。可使用默認的程序參數，或可指定備選的參數。然後序列比較算 法基於程序參數來計算測試序列相對於參考序列的百分比序列同一性。如本文所用，「比較窗」包含參考任何一個數目相鄰位置的區段，所述相鄰位 置數選自從20到600，通常從約50到約200，更通常從約100到約150，其中在兩條序列 進行最佳比對後，可將序列與相同數目的相鄰位置的參考序列進行比較。用於比較的序 列比對方法為本領域所熟知。例如通過Smith和Waterman (1970) Adv.Appl.Math.2 482c 的局部同源性算法、通過Needleman和Wunsch(1970) J.Mol.Biol.48 443的同源性比對 算法、通過 Pearson 和 Lipman (1988) Proc.Nat，l.Acad.Sci.USA 85 2444 的相似性搜索方 法、通過這些算法的計算機執行(Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI 中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA)或通 過手動比對和目檢(見例如 Ausubel 等，Current Protocols in Molecular Biology (1995 附 錄))。適合用於確定百分比序列同一性和序列相似性的算法的兩個實例是BLAST 和 BLAST2.0 算法，其分別描述於 Altschul 等(1977)Nuc.AcidsRes.25 3389-3402 和 Altschul 等(1990) J.Mol.Biol.215 403-410 中。可通過 National Center for Biotechnology Information公開獲得用於進行BLAST分析的軟體。該算法包括首先通過在查詢序列中 鑑定長度W的短字串來鑑定高得分序列對(HSP)，當與資料庫序列中相同長度的字串比 對時，其匹配或滿足一定的正值閾值得分Τ。T被稱為鄰近字串得分閾值(neighborhood word score threshold) (Altschul等，上文)。這些初始相鄰字串命中作為種子用於啟動搜索 以發現包含它們的更長HSP。字串命中沿每條序列向兩個方向延伸，直至累積比對得分 可以提高。對於核苷酸序列，使用參數M (—對匹配殘基的獎勵分；總是>0)和N(錯 配殘基的罰分；總是<0)計算累積得分。對於胺基酸序列，用評分矩陣計算累積得分。 當累積比對得分從其最大獲得值下降數量X；累積得分因一個或多個負得分殘基比對的 累積而達到零或以下；或到達任一條序列的末端時，字串命中在每個方向上的延伸就中 止。BLAST算法參數W、T和X決定比對的靈敏性和速度。BLASTN程序(用於核苷 酸序列)默認使用字長(W) 11、期望值(E) 10、M = 5、N = -4和兩條鏈的比較。對 於胺基酸序列，BLASTP程序默認使用字長3和期望值(E) 10和BLOSUM62評分矩陣(見 Henikoff 和 Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89 10915)比對(B) 50、期望值
(E) 10、M = 5、N = -4和兩條鏈的比較。BLAST算法也進行兩條序列間相似性的統計學分析(見例如Karlin和 Altschul (1993) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 5873-5787)。BLAST 算法提供的一種相似性 的測量是最小總數概率(P(N))，其提供兩條核苷酸或胺基酸序列間偶然發生匹配的概率 的指示。例如，在測試核酸與參考核酸的比較中，若最小總數概率低於約0.2、更優選低 於約0.01和最優選低於約0.001，則認為核酸與參考核酸相似。如下文所述，兩條核酸序列或多肽基本上相同的指徵是，由第一條核酸編碼的 多肽在免疫學上與針對由第二條核酸編碼的多肽產生的抗體交叉反應。因此，例如兩 條多肽僅通過保守替換而不同時，多肽通常與第二多肽基本上相同。如下文所述，兩條 核酸序列基本上相同的另一指徵是，這兩個分子或它們的互補分子在嚴格條件下彼此雜 交。兩條核酸序列基本上相同的另一指徵是，可以用相同的引物來擴增所述序列。當用於描述抗原結合區如何在本發明的TrkB結合分子內連接時，術語「連接」 包含在物理上連接該區的所有可能的方法。大多數抗原結合區常通過諸如共價鍵(例如 肽鍵或二硫鍵)或非共價鍵的化學鍵連接，其可以是直接結合(即兩個抗原結合區之間無 接頭)或間接結合(即在兩個或更多個抗原結合區之間有至少一個接頭分子的輔助)。術語「受試者」、「患者」和「個體」可互換地指哺乳動物，例如人或非人靈 長類哺乳動物。所述哺乳動物也可以是實驗室哺乳動物，例如小鼠、大鼠、兔、倉鼠。 在一些實施方案中，所述哺乳動物可以是農業哺乳動物(例如馬、羊、牛、豬、駱駝)或 家養哺乳動物(例如犬、貓)。術語「治療可接受量」或「治療有效劑量」可互換地指足以取得所希望結果 (即靶細胞的凋亡)的量。在一些實施方案中，治療可接受量不誘導或引起不希望的副 作用。可以通過首先施用低劑量，然後增加該劑量直到達到所希望的效果來確定治療可 接受量。本發明的TrkB激動抗體的「預防有效劑量」和「治療有效劑量」分別可以防 止疾障礙狀(即與TrkB信號發放的異常低水平相關的障礙的症狀，例如由包含BDNF的 TrkB配體的缺乏引起)的發作或導致疾障礙狀嚴重度的降低。所述術語還可以分別促進 或增加無疾障礙狀期的頻率和持續時間。「預防有效劑量」和「治療有效劑量」還可以 分別預防或緩解TrkB激活不足引起的障礙和疾病所引起的損傷或殘疾。如本文所用，術語「呼吸系統障礙」包含但不限於肺膨脹不全、囊性纖維化、 Rett綜合症(RTT)、哮喘、呼吸暫停(例如睡眠型呼吸暫停)、急性呼吸窘迫綜合症 (ARDS)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺氣腫、急性呼吸困難、呼吸急促、端坐呼吸、 類風溼肺疾病、肺充血或水腫、慢性阻塞性氣道疾病(例如肺氣腫、慢性支氣管炎、支 氣管哮喘和支氣管擴張)、通氣不足、匹克威克綜合症(Pickwickian Syndrome)、肥胖通 氣不足綜合症、嬰兒猝死綜合症(SIDS)和呼吸過度。此外，「呼吸系統疾病」還包含 已知與遺傳缺陷相關的人類病症，如進行性神經性腓骨肌萎縮症(Charcot-Marie-Tooth disease)、潮式呼吸障礙(Cheyne-Stokes breathing disorder)、威-普二氏綜合症、嬰兒猝 死綜合症、先天性中樞通氣不足、瀰漫性間質性疾病(例如肉樣瘤病、塵肺病、過敏性 肺炎、細支氣管炎、古德帕斯徹綜合症(Goodpasture' s syndrome) >特發性肺纖維化、 特發性肺含鐵血黃素沉積症、肺泡蛋白沉積症、脫屑性間質肺炎、慢性間質性肺炎、纖維化肺泡炎、hamman-rich綜合症(hamman-rich syndrome)、肺嗜酸細胞增多症、瀰漫性 間質性纖維化、韋格納肉芽腫病(Wegener' sgranulomatosis)、淋巴瘤樣肉芽腫和脂質性 肺炎)或腫瘤(例如支氣管原癌、細支氣管肺泡癌(bronchiolovlveolar carcinoma)、支氣管 癌、錯構瘤和間充質腫瘤)。附圖簡述圖1圖示包含抗體V區的結構單位的示意圖。重鏈由三個基因家族(重鏈V、 D和J)編碼，輕鏈由兩個基因家族(κ或λ V和J)編碼。這些基因的重組產生完整的 V區。在重鏈的情況下，CDR3序列處於重鏈V、D和J基因的重組位點，在輕鏈的情 況下，CDR3序列處於處於κ或λ V和J的重組位點。圖2圖示用人胺基酸序列替換參考抗體胺基酸序列的示意圖。圖3圖示用ForteBio Octet生物傳感器技術，通過生物薄膜幹涉技術對結合重組 TrkB抗原的Fab進行的分析。這些曲線的數值數據顯示於表1和表2中。圖4圖示用ForteBio Octet生物傳感器技術，通過生物薄膜幹涉技術對結合重組 TrkB抗原的IgG進行的分析。這些曲線的數值數據顯示於表3中。圖 5 圖示比對的 Fab 克隆 TR134-4 (SEQ ID NO: 76 和 80)、TR135-8 (SEQ ID NO 76 禾口 81)、TR139-2 (SEQ ID NO 76 和 82)、TR151-1 (SEQ IDNO 77 和 82)和 TR144-1 (SEQ ID NO 78和81)的可變區胺基酸序列(FRl到CDR3)和與最接近的種系 的單個人可變區翻譯Vhl-02 (SEQ ID NO 15)或VkII A23 (SEQ ID NO 79)的比較。 所有Fab Vh區的FR4 (未顯示)均來自人種系JH4，並具有序列WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO 50)。 所有Fab Vk區的FR4 (未顯示)均來自人種系Jk2，並具有序列 FGQGKLEIK(SEQ ID NO 61)。框出 CDR，與種系序列(除 CDR3 「BSD」 序列外)中 的相應位置不同的殘基為黑體。下劃線為對CDR3的親和力成熟改變，斜體為Vk CDR3 中的種系替換殘基。圖6 圖示比對的 IgG 克隆 TR127-2 (SEQ ID NO: 76)、TR143-3 (SEQ IDNO 78)、TRl54-2 (SEQ ID NO 77)、TRl 19-1 (SEQ ID NO 84)、TR129-1 (SEQ ID NO 85)和TR137-1 (SEQ ID NO 86)的可變區胺基酸序列(FRl到CDR3)和與最接近的種 系的單個人可變區翻譯Vhl-02 (SEQ IDNO 15)或VkJI A23 (SEQ ID NO 83)的比較。 所有IgG Vh區的FR4 (未顯示)均來自人種系JH4，並具有序列WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO 50)。 所有IgG Vk區的FR4 (未顯示)均來自人種系Jk2，並具有序列 FGQGKLEIK(SEQ ID NO 61)。框出 CDR，與種系序列(除 CDR3 「BSD」 序列外)中 的相應位置不同的殘基為黑體。下劃線為對CDR3的親和力成熟改變，斜體為VkCDR3 中的種系替換殘基。圖7圖示在ELISA測定中通過提高A10F18.2IgG的濃度來阻斷Fab與人V區段
的結合。圖 8A-D 圖示 NVP-LFD253 (A)、NVP-LFD254 (B)、NVP-LFC325 (C)或 NVP-LFC327 (D)與人 Fc-TrkB 的結合。圖 9A-D 圖示顯示 NVP-LFD253、NVP-LFD254、NVP-LFC325 和 NVP-LFC327 與人TrkB-Fc融合蛋白特異性結合而不與人TrkB-Fc或TrkOFc融合蛋白特異性結合的 ELISA測定。通過檢測其與三個不同的Trk家族成員(TrkA、TrkB和TrkC)的相互作
20用，評估純化的2 μ g/ml的IgG的特異性。二抗(Secondary Ab)是僅用山羊-抗-人 Fab-HRP檢測抗體阻斷和處理的重複試驗。圖 10A-D 圖示NVP-LFD253、NVP-LFD254、NVP-LFC325 和 NVP-LFC327 在
失巢凋亡測定中的激動劑活性評估。在RIE-TrkB細胞上評估純化的IgG 48小時。(-) 表示未用抗體處理的細胞。圖 IlA-D 圖示 IgG 抗體 NVP-LFD253、NVP-LFD254、NVP-LFC325 和 NVP-LFC327的代表性Biacore動力學描跡。將Fc-TrkB固定於Biacore晶片表面。IgG
的系列稀釋液以30 μ L/min流過晶片。結合期為300秒，隨後是在自由緩衝液流中持續 1200秒的解離期。圖12圖示抗-TrkB的激動劑mAb長期治療延長Mecp2_Bird小鼠的壽命。 Mecp2tml.IBird裸鼠出現患Rett綜合症的患者的許多核心的呼吸功能障礙，包含提高 的呼吸周期持續時間的可變性、急促和慢速呼吸頻率的交替期、呼吸暫停的發生、提高 的平均呼吸頻率(和分通氣量)。小鼠最終死於致死性呼吸衰竭。抗體AlO指親本小鼠 單克隆抗體，其與本文所述改進的抗-TrkB抗體激動劑共有互補結合決定區和最小結合 決定簇。圖13圖示用抗-TrkB激動劑mAb處理的Mecp2-Bird小鼠中呼吸功能的改善。通 過全身體積描記法評估用抗-TrkB激動劑mAb處理後的Mecp2小鼠的呼吸參數。未處理 的Mecp2小鼠在增強的呼吸暫停(Penh)中顯示年齡依賴的增加，增強的呼吸暫停在mAb 治療的動物中降低。年齡依賴的Penh可以指示增加的氣道阻力，可以表型模擬RTT患者 中的瓦爾薩爾瓦動作併發症。mAb處理後在野生型和Mecp2小鼠中都觀察到了增加的呼 吸頻率和減少的吸氣時間。對相同基因型、相反治療，*p<.05、Mp <.01;對相反基 因型、相同治療，#ρ<·05、##ρ<·01、###ρ < .001 ； MeCP2-K/A10 對 MeCP2-WT/ SAL, $p < .05, $$p<.01、$$$p<.001。單因素方差分析後進行t檢驗。圖14圖示對食蟹猴(Cynomolgus monkey)靜脈內施用抗-TkB激動劑mAb LFI987後對食物攝取和體重的影響。通過將HC可變區轉入沉默IgGl主鏈，將抗體克 隆LFD253轉化為LFI987。在第1、5和8天按0.3和3.0mg/kg LFI987靜脈注射動物3 次。數據為平均值士 SE; η = 4-6。通過重複測量方差分析後進行Duraiett，stest，對 基線* P < 0.05，LFI987以劑量依賴的方式顯著增加食物攝取和體重。發明詳述1.引言本發明提供改進的TrkB激動劑抗體。本發明的改進的TrkB激動劑抗體特異性 結合TrkB並激活TrkB。發現本發明的TrkB激動劑抗體用於減輕、抑制和預防TrkB激 動劑配體缺乏(例如BDNF缺乏)引起的障礙和疾病的症狀。可用本發明的抗-TrkB激 動劑抗體治療的示例性疾病包含Rett綜合症、WAGR綜合症、MC4R突變引起的肥胖症 和惡病質/衰竭(wasting)綜合症(例如由癌症、衰老、進食障礙或藥物引起)。發現 抗-TrkB激動劑抗體還用於在有需要的受試者中降低血糖水平。此外，本發明的TrkB激 動劑抗體用於預防體重增加。TrkB激活用於預防高血糖症及其相關病症、肥胖症、前驅 糖尿病和II型糖尿病。 2.改進的抗-TrkB抗體總覽
本發明的抗體特異性結合原肌球蛋白相關激酶(Trk)受體酪氨酸激酶B(TrkB)。 為此，抗體可以結合配體結合位點並阻斷天然配體(例如腦衍生神經營養因子(BDNF) 或神經營養蛋白-3)的結合，作為拮抗劑或作為激動劑。在一些實施方案中，本發明的 抗-TrkB抗體作為TrkB受體的激動劑。TrkB抗體激動劑是特異性結合TrkB並激活或增 強TrkB介導的細胞內信號發放的抗體。抗-TrkB抗體可選地可以是多聚化的，並按照本 發明的方法使用。抗-TrkB抗體可以是全長四聚體抗體(即具有兩條輕鏈和兩條重鏈)、 單鏈抗體(例如ScFv)或包含形成一個或多個抗原結合部位並賦予TrkB結合特異性的抗 體片段的分子，例如包含重鏈和輕鏈可變區(例如Fab'或其他類似片段)。可以通過本領域已知的任意方法產生抗-TrkB抗體片段，其包括但不限於重組 表達、化學合成和抗體四聚體的酶消化，而可通過例如雜交瘤或重組產生來獲得全長單 克隆抗體。重組表達可來自本領域已知的任意適合的宿主細胞，例如哺乳動物宿主細 胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆蟲宿主細胞等。當存在時，抗-TrkB抗體的恆定 區可以是適合的任意類型或亞型，可以選擇其是來自待通過本方法治療的受試者的物種 (例如人、非人靈長類動物或其他哺乳動物，例如農業哺乳動物(馬、羊、牛、豬、駱 駝)、家養哺乳動物(例如犬、貓)或嚙齒類動物(例如大鼠、小鼠、倉鼠、兔))。本發明的抗-TrkB抗體或抗原結合分子還包含具有駱駝主鏈(scaffold)的單結構 域抗原結合單位。駱駝家族的動物包含駱駝、美洲駝(llamas)和羊駝(alpacas)。駱駝產 生無輕鏈的功能性抗體。重鏈可變(VH)結構域自主摺疊並作為抗原結合單位獨立發揮 功能。與經典的抗原結合分子(Fab)或單鏈可變片段(scFv)中的六個CDR相比，其結合 表面僅涉及三個CDR。駱駝抗體能夠獲得與常規抗體相當的結合親和力。可以用本領域 熟知的方法產生具有本文所示例的抗-TrkB抗體的結合特異性的基於駱駝主鏈的抗-TrkB 分子，例如 Dumoulin 等，Nature Stract.Biol.ll 500-515，2002 ； Ghahroudi 等，FEBS Letters 414 521-526，1997 ；和 Bond 等，J MolBiol.332 643-55，2003。本發明的改進的抗-TrkB抗體是具有V區序列的經改造的人抗體，所述V區序 列與人種系V區序列具有基本的胺基酸序列同一性，同時保留參考抗體的特異性和親和 力。見美國專利公開號2005/0255552和美國專利公開號2006/0134098，二者在此引用 作為參考。改進方法是從參考抗體的可變區鑑定出決定抗原結合特異性所需的最小序列 信息，並將該信息轉移至人部分V區基因序列的文庫，產生人抗體V區的表位聚焦文庫 (epitope-focused library)。可用基於微生物的分泌系統表達文庫成員為抗體Fab片段， 並用例如菌落轉移結合測定針對結合抗原的Fab篩選該文庫。見例如美國專利公開號 2007/0020685。可以進一步表徵陽性克隆來鑑定具有最高親和力的克隆。產生的經改造 的人Fab保留親本(參考抗-TrkB抗體)的結合特異性，與親本抗體相比通常具有相等的 或更高的親和力，且與人種系抗體V區相比具有具有高度序列同一性的V區。產生表位聚焦文庫所需的最小結合特異性決定簇(BSD)通常由重鏈 CDR3( 「CDRH3」 )內的序列和輕鏈CDR3( 「CDRL3」 )內的序列所代表。BSD可 以包含CDR3的部分或全長。BSD可以由連續或非連續的胺基酸殘基組成。在一些情 況下，從人V區段序列構建表位聚焦文庫，所述V區段連接至來自包含BSD的參考抗體 的獨特的CDR3-FR4區和人種系J區段序列(見圖1和美國專利公開號2005/0255552)。 備選地，可通過連續的盒式替換產生人V區段文庫，其中最初通過人序列文庫僅替換部分參考抗體V區段。然後在第二文庫篩選中重組鑑定出的在參考抗體胺基酸序列環境中 支持結合的人「盒」，以產生全人V區段(見美國專利公開號2006/0134098)。在每種情況下，用包含來自參考抗體的特異性決定簇的配對的重鏈和輕鏈CDR3 區段、CDR3-FR4區段或J區段來限制結合特異性，以使從文庫獲得的抗原結合劑保留參 考抗體的表位特異性。為了鑑定具有最佳結合動力學的抗體，在文庫構建過程中可以在 每條鏈的CDR3區中引入其他成熟改變。產生的經改造的人抗體具有衍生自人種系文庫 的V區段序列、保留來自CDR3區內的短BSD序列和具有人種系構架區4 (FR4)。因此，在一些實施方案中，抗-TrkB抗體在衍生自起始或參考單克隆抗體的重 鏈和輕鏈的CDR3內包含最小結合序列決定簇(BSD)。重鏈和輕鏈可變區(CDR和FR) 的其餘序列(例如V區段和J區段)來自相應的人種系胺基酸序列和親和力成熟的胺基酸 序列。V區段可以選自人V區段文庫。可以通過親和力成熟完成進一步的序列精煉。在另一個實施方案中，抗-TrkB抗體的重鏈和輕鏈包含來自相應的人種系序列 (FRl-CDRl-FR2-CDR2-FR3)的人V區段(例如選自人V區段文庫)和來自起始單克隆 抗體的CDR3-FR4序列區段。可以通過用相應的人種系序列替換序列區段和/或通過親 和力成熟來進一步精煉CDR3-FR4序列區段。例如，可以用相應的人種系序列替換圍繞 BSD的FR4和/或CDR3序列，同時保留來自起始單克隆抗體CDR3的BSD。在一些實施方案中，重鏈V區段的相應的人種系序列是Vhl-02。在一些實施 方案中，重鏈J區段的相應的人種系序列是JH4。在一些實施方案中，重鏈J區段包含 人種系JH4部分序列WGQGTLVTVSS (SEQ IDNO 50)。來自人種系JH4的全長J區 段是YFDYWGQGTLVTVSS (SEQID NO 74)。按照免疫球蛋白可變區基因標準命名法 命名可變區基因。可通過全球資訊網在例如ImMunoGeneTics(IMGT)、V-base和PubMed數 據庫中獲得當前的免疫球蛋白基因信息。還見Lefranc，Exp Clin Immunogenet.2001 ； 18(2) 100-16 ； Lefranc, Exp Clin Immunogenet.2001 ； 18(3) 161—74; ExpClin Immunogenet.2001 ； 18(4) 242-54 ；禾Π Giudicelli 等，NucleicAcids Res.2005 年 1 月 1 日；33 (Database 版本)D256-61。在一些實施方案中，輕鏈V區段的相應的人種系序列是VKII A23。在一些實 施方案中，輕鏈J區段的相應的人種系序列是Jk2。在一些實施方案中，輕鏈J區段包含 人種系Jk2部分序列FGQGTKLEIK(SEQ IDNO 61)。來自人種系Jk2的全長J區段是 YTFGQGTKLEIK (SEQ IDNO 75)。在一些實施方案中，重鏈V區段與胺基酸序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVS CKASGYTFT (G/A) Y (D/Y) MHWVRQAPGQGLEWMGWI (D/N) P (N/R) SG (G/D) T (N/ R/S) Y (A/K) QKFQGRVTMTRDTSISTAYMEL (H/S) RL (R/T) SDDTAVYYC (A/T) (G/R) (SEQ IDNO 16)具有至少 90%、93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或 100%序列 同一性。在一些實施方案中，輕鏈V區段與胺基酸序列D(I/V)VMTQ(S/T)PLS(L/S) PVTLGQPASISCRSSQSL (L/V) HS (D/N) GNTYL (N/S) W (L/Y) QQ (K/R/T) PGQPPRLL IYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC (SEQ ID NO 24)具有至少 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或 100%序列同一性。在一些實施方案中，重鏈V區段與選自SEQ IDNO 12、SEQ IDNO 13、SEQ ID NO 14 或 SEQ ID NO: 15 的胺基酸序列具有至少 90%、93%, 95%, 96%, 97%,98%, 99%或100%序列同一性。在一些實施方案中，輕鏈V區段與選自SEQ IDNO 17、SEQ IDNO 18、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 20、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 22 或 SEQ ID NO 23
的胺基酸序列具有至少90%、93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或100%序列同一性。在一些實施方案中i)重鏈 CDR3 包含胺基酸序列基序 V (T/V) (S/T/R/N) WFAY (SEQ IDNO
34)；和ii)輕鏈 CDR3 包含胺基酸序列基序(S/M) QGT (H/A) (E/V/I) PYT (SEQID NO
42)。在一些實施方案中i)重鏈 CDR3 包含選自 VTTWFAY (SEQ ID NO 32)和 VTSWFAY (SEQ ID NO
33)的胺基酸序列；和ii)輕鏈 CDR3 包含選自 MQGTHEPYT (SEQ ID NO 40)禾口 MQGTHVPYT (SEQ
ID NO 41)的胺基酸序列。在一些實施方案中，本發明的抗體包含重鏈可變區，所述重鏈可變區包含包 含胺基酸序列(A/G)Y(D/Y)MH(SEQIDNO 27)的CDRl ；包含胺基酸序列WI (D/N) P (N/R) SG (G/D) T (N/R/S) Y (A/K) QKFQG (SEQ IDNO 31)的 CDR2 ；和包含胺基酸 序列 V(T/V) (S/T/R/N) WFAY (SEQ IDNO 34)的 CDR3。在一些實施方案中，本發明的抗體包含輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含包 含胺基酸序列 RSSQSL (L/V)HSNGNTYL(N/S) (SEQ IDNO 38)的 CDRl ；包含胺基酸 序列 KISNRFS (SEQ ID NO 39)的 CDR2 ；和包含胺基酸序列(S/M) QGT (H/A) (E/V/ I) PYT (SEQ ID NO 42)的 CDR3。在一些實施方案中，重鏈可變區包含包含SEQ ID NO: 43的胺基酸序列的 FRl ；包含SEQ ID NO 44的胺基酸序列的FR2 ；包含SEQ IDNO 49的胺基酸序列的 FR3 ；和包含SEQ ID NO 50的胺基酸序列的FR4。鑑定的胺基酸序列可以具有一個或 多個取代的胺基酸(例如來自親和力成熟)或一個或兩個保守性取代的胺基酸。在一些實施方案中，輕鏈可變區包含包含SEQ ID NO: 55的胺基酸序列的 FRl ；包含SEQ ID NO 59的胺基酸序列的FR2 ；包含SEQ IDNO 60的胺基酸序列的 FR3 ；和包含SEQ ID NO 61的胺基酸序列的FR4。鑑定的胺基酸序列可以具有一個或 多個取代的胺基酸(例如來自親和力成熟)或一個或兩個保守性取代的胺基酸。本發明的抗-TrkB抗體的可變區在其全長內一般與相應的人種系可變區氨基 酸序列具有至少約90%，例如至少約91%、92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 或 100% 的整體可變區(例如 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)氨基 酸序列同一性。例如，抗-TrkJB抗體的重鏈可以與人種系可變區Vhl-02/JH4具有至少 約 91%、92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % 或 100 % 的胺基酸序列同 一性。抗-TrkB抗體的輕鏈可以與人種系可變區VKII A23/Jk2具有至少約91%、92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或100%的胺基酸序列同一性。在一些實施 方案中，僅添加、缺失或取代構架區內的胺基酸。在一些實施方案中，序列同一性比較排除了 CD3。在一些實施方案中，本發明的抗-TkkB抗體包含與SEQ IDNO 4的重鏈可變區 具有至少 90%、91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或 100%氨 基酸序列同一性的重鏈可變區，且包含與SEQ IDNO 11的輕鏈可變區具有至少90%、 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或 100%胺基酸序列同一性的
輕鏈可變區。在一些實施方案中，本發明的抗-TrkB抗體包含與選自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO 2 禾口 SEQ ID NO: 3 的重鏈可變區具有至少 90 %、91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或100%胺基酸序列同一性的重鏈可變區，且包含與選自 SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9 和 SEQ ID NO 10 的輕鏈可變區具有至少 90%、91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或100%胺基酸序列同一性的輕鏈可變區。在一些實施方案中，本發明的抗-TrkB抗體包含與SEQ ID NO 1的重鏈可變 區具有至少 90%、91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或 100% 胺基酸序列同一性的重鏈可變區，且包含與SEQ IDNO : 8的輕鏈可變區具有至少90%、 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或 100%胺基酸序列同一性的 輕鏈可變區(即克隆LFC325)。在一些實施方案中，本發明的抗-TrkB抗體包含與SEQ ID NO 1的重鏈可變 區具有至少 90%、91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或 100% 胺基酸序列同一性的重鏈可變區，且包含與SEQ IDNO : 9的輕鏈可變區具有至少90%、 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或 100%胺基酸序列同一性的 輕鏈可變區(即克隆LFC327)。在一些實施方案中，本發明的抗-TrkB抗體包含與SEQ IDNO 1的重鏈可變區 具有至少 90%、91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或 100%氨 基酸序列同一性的重鏈可變區，且包含與SEQ IDNO 10的輕鏈可變區具有至少90%、 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或 100%胺基酸序列同一性的 輕鏈可變區(即克隆LFD253)。在一些實施方案中，本發明的抗-TrkB抗體包含與SEQ ID NO 3的重鏈可變 區具有至少 90%、91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或 100% 胺基酸序列同一性的重鏈可變區，且包含與SEQ IDNO : 8的輕鏈可變區具有至少90%、 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或 100%胺基酸序列同一性的 輕鏈可變區(即克隆LFD254)。對於已鑑定的長度少於20個胺基酸的胺基酸序列，可以容忍一個或兩個保守氨 基酸取代而仍然保留所希望的特異性結合和/或拮抗劑活性。本發明的抗-TrkB抗體一般將以低於約ICT8M或ICT9M的平衡解離常數(Kd)結 合TrkB，例如低於約ΙΟ,Μ或KT11M,在一些實施方案中低於約ICT12M或10_13M。3.鑑定TrB激動劑抗體的測定法可通過產生抗-TrkB抗體，然後測試每個抗體觸發TrkB介導事件(例如啟動 SH-SY5Y細胞的分化和/或樹突化(dendrification))的能力、測量響應於用潛在TrkB激動劑處理細胞而從失巢凋亡(細胞基質相互作用的喪失引起的凋亡)逃離，或使用BaF3/ TrkB細胞增殖測定來鑑定激動劑抗體。SH-SY5Y測定法涉及平板接種SH-SY5Y細胞並在有或沒有潛在激動劑抗體和/ 或BDNF的情況下用視黃酸處理細胞，然後測量神經突派生。通常，視黃酸單獨將誘導 少量的神經突派生。BDNF單獨將不誘導顯著的神經突派生，並且抗體單獨將不誘導顯 著的神經突派生。然而，用視黃酸、BDNF和抗體處理的細胞顯示廣泛的神經突派生。 示例性SH-SY5Y測定法描述於Kaplan DR等，Neuron 11 321-331 (1993)中。在測試 抗-TrkB激動劑抗體的測定中，用測試抗體代替BDNF。將陽性對照細胞暴露於BDNF。BaF3造血細胞/TrkB細胞增殖測定法涉及測量由TrkB受體的激動作用刺激的細 胞增殖。例如，BaF3細胞在具有IL-3的完全RPMI培養基中生長並用表達TrkB的逆轉 錄病毒感染。細胞在缺少IL-3的情況下進行洗滌並接種平板。在適當孵育後，測量潛 在的激動劑抗體和細胞存活(例如使用發光細胞生存力檢測試劑，如Cell-Titer Glo )。 用BDNF孵育陽性對照細胞。失巢凋亡測定法涉及重懸大鼠腸上皮(RIE)/TrkB細胞(例如在DMEM培養基 中)並可選地在多孔容器中使細胞接觸潛在的抗體激動劑(例如，2.5xl04個細胞，IOul的 1-2(^§/1111抗體)。在存在或缺少BDNF對照的情況下孵育混合物，然後測量細胞生存 力(例如使用發光細胞生存力檢測試劑，如Cell-Titer Glo )。示例性失巢凋亡測定法描 述於 Douma 等，Nature 430 1034-1039 (2004)中。也可以在SH-SY5Y細胞上評估TrkB激動劑保護細胞免受長春鹼和順鉬毒性的 能力。該測定法已描述於例如 Scala 等，Cancer Res.56 (16) 3737-42(1996)；和 Jaboin 等，Cancer Res.62 (22) 6756-63(2002)中。4.使用抗-TrkB激動劑抗體的方法本發明的抗-TrkB激動劑抗體可以用來治療或緩解從提高的TrkB活性受益的任 意疾病或病症，其包含呼吸系統障礙和疾病，尤其是TrkB信號發放缺乏引起的障礙和疾 病；BDNF缺乏引起的障礙和疾病；和TrkB信號發放缺乏引起的下部腸道活動力疾病 (lower intestinal gut motility disease,例如炎性腸綜合症)。本發明的TrkB激動抗體與TrkB相互作用，從而能夠調節TrkB功能。本發明的 TrkB激動抗體可以調節(例如促進)TrkB的一種或多種生物學功能。例如，TrkB激動 劑抗體可以調節TrkB的二聚化和隨後的TrkB胞內結構域上特定酪氨酸殘基的自磷酸化。 作為另一個實例，TrkB激動劑抗體可以起始TrB相關的胞內信號發放級聯(例如促分裂 原活化蛋白激酶途徑、磷脂醯肌醇3-激酶途徑和PLC Y途徑)，其導致神經元死亡的抑 制、神經突派生的促進和神經營養蛋白的其他作用。在一些實施方案中，本文所述TrkB激動劑抗體作為BDNF模擬物，並可以用來 再現BDNF和其他TrkB激動劑配體的營養活性，從而發揮神經保護和神經營養作用。本 方法的抗-TrkB激動劑抗體可與BDNF競爭結合TrkB，從而激活、增強或延續TrkB途徑 的激活和信號發放。在一些實施方案中，所述TrkB激動劑抗體結合TrkB配體結合結構 域，從而與BDNF競爭結合TrkB。因此，TrkB激動抗體可以用來在體外和體內促進TrkB途徑信號發放。本發明 的TrkB激動抗體用於例如診斷、抑制、預防、緩解其症狀、防禦和治療與TrkB途徑信號發放的異常低水平相關的障礙(例如由染病受試者中BDNF缺乏或另一 TrkB激動劑配體 缺乏引起)。與TrkB信號發放的異常下調相關的障礙的非限制性實例包含例如Rett綜合 症(RTT)，其表徵為編碼MeCP2(其直接結合BDNF)的基因中的突變；由TrkB功能喪失 突變引起的嚴重肥胖症和發育遲緩(Giles，S.等(2004)Nature Neuroscience 7 1187-9)； 維爾姆斯瘤；無虹膜；泌尿生殖異常和智力發育遲緩(WAGR)綜合症(Han等，NEngl J Med(2008) 359 (9) 918-27)；黑皮質素受體MC4R缺乏引起的肥胖症(Farooqi和 O，Rahilly, Endocrine Rev (2006) 27 (7) 710-18)；惡病質 / 肌肉萎縮綜合症(Lin 等， PloS, 3(4) el900 ； WO 2007/088476)。因此，本發明提供治療、診斷、預防和/或緩解由BDNF缺乏引起的障礙和疾病 (例如Rett綜合症(RTT)、WAGR綜合症、黑皮質素受體MC4R缺乏引起的肥胖症、惡 病質/肌肉萎縮綜合症)的方法，該方法包括施用藥物組合物，該藥物組合物包含治療或 預防有效量的本文所述TrkB激動抗體和藥物載體。在一些實施方案中，在全身或外周施 用本文所述的抗-TrkB抗體，例如口服施用、吸入施用、靜脈內施用或腹膜內施用。本文所述抗-TrkB抗體還用於治療、診斷、預防和/或緩解呼吸系統疾病和障 礙，尤其是由TrkB活性缺乏引起的疾病和障礙。示例性呼吸系統障礙包含Rett綜合症、 睡眠型呼吸暫停、匹克威克綜合症和本文所述的其他障礙。在一些實施方案中，藥物組合物還包含用於治療、診斷、預防和/或緩解呼吸 窘迫(例如呼吸困難)症狀的分開和獨立的藥劑，如去甲腎上腺素途徑和/或5-羥色胺途 徑的小分子激活劑(實例非限制性地包含三環抗抑鬱劑地昔帕明(DMI)、5-羥色胺IA受 體部分激動劑、丁螺環酮和更有選擇性的抗抑鬱劑氟西汀和瑞波西汀)、穀氨酸能AMPA 受體的激活劑(例如AMPAkine CX54、前列腺素、孕酮)或TrkB活性的增效劑(例如蛋 白質酪氨酸磷酸酶抑制劑)。在一些實施方案中，在治療、診斷、預防和/或緩解呼吸系統障礙或呼吸窘迫 症狀中有效的治療和/或預防有效量的第二藥劑與TrkB抗體激動劑(或包含TrkB抗體激 動劑的藥物組合物)組合對個體施用。在一些實施方案中，第二藥劑和TrkB抗體激動劑 (或包含TrkB抗體激動劑的藥物組合物)作為混合物施用。在一些實施方案中，第二藥 劑選自去甲腎上腺素途徑和/或5-羥色胺途徑的小分子激活劑(實例包含三環抗抑鬱劑 地昔帕明(DMI)、5-羥色胺IA受體部分激動劑、丁螺環酮和更有選擇性的抗抑鬱劑氟西 汀和瑞波西汀)、穀氨酸能AMPA受體的激活劑(例如AMPAkineCX54、前列腺素、孕 酮)或TrkB活性的增效劑(例如蛋白質酪氨酸磷酸酶抑制劑)。本發明還提供治療、診斷、預防和/或緩解胞內TrkB信號發放缺乏引起的呼吸 窘迫症狀或呼吸系統障礙的方法，其包括施用抗-TrkB激動抗體或包含抗-TrB激動抗體 的藥物組合物。所述症狀包含但不限於呼吸困難(例如喘鳴或哮鳴、屏氣、淺呼吸、過 度換氣、延長的窒息)、血液氧合作用弱或降低(例如紫紺，例如由氧氣吸收受損、肺部 血液灌注不足引起)、降低的去甲腎上腺素(NE)含量、髓質中表達酪氨酸羥化酶(TH) 的神經元減少和胸痛。在一些實施方案中，所述方法包括對個體施用如本文所述的治療 或預防有效量的酪氨酸激酶受體B(TrkB)的抗體激動劑。在一些實施方案中，所述方法 包括對個體施用包含治療或預防有效量的TrkB激動抗體和藥物載體的藥物組合物。在一 些實施方案中，所述個體患有Rett綜合症和/或正經歷呼吸窘迫的一種或多種症狀。在一些實施方案中，所述個體易感呼吸窘迫的症狀。在一些實施方案中，本發明的TrkB激動劑抗體用於治療或緩解個體中的高血糖 症和/或糖尿病或其症狀。備選地，或組合，本發明抗體可用於減輕需要減輕體重的個 體體重。在一些實施方案中，所述抗體用於緩解肥胖症。這尤其有用，因為肥胖個體更 易於發生胰島素抗性和II型糖尿病。本發明提供抑制神經細胞死亡的方法，其包括施用本文所述TrkB激動抗體(或 包含TrkB激動抗體的藥物組合物)。例如，本發明還提供通過對有需要的個體施用本發 明的TrkB激動劑抗體，來治療或預防神經變性疾病或中樞神經系統(CNS)疾病的方法。 示例性CNS疾病包含例如阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病或ALS病。提高的TrkB激活也涉及藥物濫用的緩解。見例如美國專利公開號 2005/0203011。因此，本發明提供通過向需要其的個體施用本發明的TrkB激動劑抗體來 緩解藥物(例如酒精、菸鹼和/或麻醉藥)濫用和藥物依賴性的方法。在一些實施方案中，抗體是人源化抗體。在一些實施方案中，抗體是單鏈抗 體。在一些實施方案中，抗體不結合酪氨酸激酶受體A或酪氨酸激酶受體C。在一些 實施方案中，抗體不結合神經營養蛋白受體p75NR。在一些實施方案中，抗體特異性結 合人TrkB，對其他物種的TrkB(例如非人靈長類動物或小鼠的TrkB)具有最小的結合或 無結合。在一些實施方案中，抗體特異性結合人TrkB，也結合其他物種的TrkB(即與包 含小鼠、大鼠和/或非人靈長類動物(例如食蟹猴或獼猴(rhesus monkey))的其他物種的 TrkB交叉反應)。5.藥物組合物本發明提供包含與可藥用載體配製在一起的抗-TrkB抗體或抗原結合分子的藥 物組合物。組合物可以額外包含適合用於治療或預防給定障礙的其他治療劑。藥物載 體增強或穩定組合物，或便於組合物的製備。可藥用載體包含生理上相容的溶劑、分散 劑、塗層、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。可以通過本領域已知的多種方法施用本發明的藥物組合物。給藥的途徑和/或 模式取決於所希望的結果而不同。優選靜脈內、肌內、腹膜內或皮下給藥，或在接近靶 位點處給藥。可藥用載體應適合用於靜脈內、肌內、皮下、腸胃外、鼻內、吸入、脊柱 或表皮給藥(例如通過注射或灌注)。取決於給藥途徑，可以將活性化合物(即抗體、雙 特異性和多特異性分子)包衣於材料中，以保護該化合物免受酸和其他可失活該化合物 的自然條件的作用。可將抗體單獨或與其他合適的成分組合製備成經過吸入施用的氣溶膠製劑(即 它們可以進行「噴霧」)。可將氣溶膠製劑置於加壓的可接受噴射劑中，如二氯二氟甲 烷、丙烷、氮氣等。在一些實施方案中，組合物是無菌流體。例如可以通過使用如卵磷脂的包衣、 維持在分散相的情況下所需顆粒的大小和使用表面活性劑來維持適當的流動性。在許多 情況下，優選在組合物中包含等滲劑，例如糖類、多元醇類(如甘露醇和山梨醇)和氯化 鈉。通過在組合物中包含延遲吸收的物質(例如單硬脂酸鋁或明膠)，可以產生可注射組 合物的長期吸收。可以按照本領域熟知和常規實施的方法製備本發明的藥物組合物。可藥用載體部分決定於所施用的具體組合物以及施用該組合物的具體方法。因此，存在本發明藥 物組合物的多種適合的製劑。配製抗體和確定適合劑量及時間安排的可應用的方法可 見於例如 Remington The Science and Practice of Pharmacy,第 21 版，2005, Lippencott Williams&Wilkins (2006) ； Martindale The Complete Drag Reference, Sweetman, 2005, London Pharmaceutical Press. ； Martindale, Martindale The Extra Pharmacopoeia, 第 31 版，1996, Amer Pharmaceutical Assn ； Sustained and Controlled Release Drag Delivery Systems, J.R.Robinson 編輯，Marcel Dekker，Inc., New York, 1978，每篇文獻在此引用 作為參考。優選在GMP條件下生產藥物組合物。通常，在本發明的藥物組合物中使用 抗-TrkB抗體的治療有效劑量或功效(efficacious)劑量。通過本領域技術人員已知的常 規方法將抗-TrkB抗體配製入可藥用劑型中。調節劑量方案以提供所希望的反應(例如 治療反應)。為確定治療或預防有效劑量，可以施用低劑量，然後增加劑量直至以最小的 不希望的副作用或無不希望的副作用達到所希望的反應。例如，可以以單次快速濃注施 用、可以隨時間推移施用幾個分份劑量或可以如治療情況的急迫性所指示按比例降低或 增加劑量。為了給藥的方便和劑量的一致性，以劑量單位形式配製腸胃外組合物尤其有 利。如本文所用，劑量單位形式指為待治療患者包裝為單個劑量的物理上分離的單位； 每個單位包含計算為與所需藥物載體組合產生所希望療效的預定量的活性化合物。本發明藥物組合物中活性成分的實際劑量水平可以不同，以在對患者無毒性的 情況下，針對具體患者、組合物和給藥方式獲得有效達到所希望的治療反應的活性成分 量。所選擇的劑量水平取決於多種藥代動力學因素，所述藥代動力學因素包含所使用的 本發明具體組合物或其酯、鹽或醯胺的活性；給藥途徑；給藥時間；所使用的具體化合 物的排洩速率；治療持續時間；與所使用的具體組合物組合使用的其他藥物、化合物和 /或材料；所治療患者的年齡、性別、體重、病症、一般健康和既往病史等因素。醫生或獸醫可以在低於達到希望的療效所需的水平開始施用藥物組合物中所用 的本發明抗體，並逐漸增加劑量直至達到希望的效果。一般而言，本發明組合物的有效 劑量取決於許多不同因素而不同，所述因素包含特治療的具體疾病或病症、給藥方式、 靶位點、患者的生理狀態、患者是人或動物、施用的其他藥物和處理是預防性的或治療 性的。需逐步增加劑量，以優化安全性和有效性。對於用抗體給藥，劑量在約0.0001到 100mg/kg宿主體重、更通常在0.01到5mg/kg宿主體重間的範圍內。例如，劑量可以是 lmg/kg體重或10mg/kg體重或在l-10mg/kg體重的範圍內。示例性治療方案需每兩周 給藥一次或每月給藥一次或每3-6個月給藥一次。在藥劑是核酸的實施方案中，劑量一般可以在約0.lmg/kg體重至達到約IOOmg/ kg體重間的範圍內，例如在約lmg/kg體重到50mg/kg體重的範圍內。在一些實施方案 中，約 1、2、3、4、5、10、15、20、30、40 或 50mg/kg 體重。可以以單劑量或分割的劑量施用抗體。通常在多種場合施用抗體。單劑量間的 間隔可以是每周、每個月或每年。如通過測量患者抗-TrkB抗體的血液水平所指示，間 隔可以是不定期的。在一些方法中，調節劑量以達到1-1000 μ g/ml的血漿抗體濃度，在 一些方法中達到25-300 μ g/ml的血漿抗體濃度。備選地，抗體可以作為持續釋放製劑 施用，其中需要較不頻繁的給藥。劑量和頻率取決於抗體在患者中的半衰期而變化。一般，人源化抗體顯示比嵌合抗體和非人抗體長的半衰期。給藥的劑量和頻率可以取決於 處理是預防性的或治療性的而變化。在預防性應用中，在長時期內按相對不頻繁的間隔 施用相對低的劑量。一些患者在其餘生接受治療。在治療性應用中，有時需要在相對短 的間隔的相對高的劑量，直至疾病的進程減緩或終止，優選直至患者顯示疾障礙狀的部 分或徹底緩解。此後，可對患者實施預防性方案。TrkB抗體激動劑可與已知有益於減輕體重、降低血糖水平、治療糖尿病或緩解 糖尿障礙狀、治療神經變性疾病或減少藥物濫用的藥劑組合使用。用於治療糖尿病的示 例性藥劑包含例如胰島素；磺醯脲類(例如格列吡嗪(Glipizide)或格列美脲(Amaryl)) 和促胰島素劑類(例如那格列奈(nateglinide)和瑞格列奈(repaglinide)) ； 二甲雙胍； PPARy激動劑(例如羅格列酮(rosiglitizone)和吡格列酮(pioglitazone))及PPAR α激動 劑、PPAR δ激動劑、PPAR α/γ雙激動劑和PPAR α/γ/δ泛激動劑；α -葡糖苷酶抑 製劑(例如阿卡波糖(Acarbose)) ； DPP-IV 抑制劑 Gfi^nvildagliptin)；和 GLP-1/GLP-l 類似物(例如依澤那太(exenatide))。用於治療肥胖症的示例性藥劑包含例如脂肪酶抑制 劑(例如奧利司他(orlistat))；西布茶明；CB-I抑制劑(例如利莫那班(rimonabant))； 託吡酯；糊精/糊精類似物(例如普蘭林肽(pramlintide))、瘦素(Ieptin)、PYY/PYY類 似物；和GLP-1/GLP-1類似物(例如依澤那太)。活性藥劑可與TrkB激動劑抗體以混合物的形式一起施用，或者各自分別施用。 抗體藥劑和其他活性藥劑可以但不必同時施用。
實施例提供以下實施例來說明而非限制本發明。實施例1以下實施例提供與人種系V區序列具有基本的胺基酸序列同一性的抗-TrkB抗 體的構建和篩選。^feV區的亞克隆從起始單克隆抗體A10F18.2亞克隆V區。用PCR擴增V重鏈和V κ區的V基 因，並參入適合用於克隆入表達載體的限制酶位點。將V區克隆為Fab片段並在大腸杆 菌(Exoli)中從表達載體表達。測試參考Fab的TrkB抗原結合，並稱之為TR3-1。還將V區克隆入IgG表達載體。使用PCR擴增和具有附加的限制位點的引物， 將Vh區擴增並克隆入表達載體，該表達載體包含人IgGl恆定區，並賦予氨苄青黴素 (ampicillan)和新黴素抗性。使用PCR擴增和具有附加的限制位點的引物，將Vk區擴增 並克隆入表達載體，該表達載體包含人κ恆定區，並賦予氨苄青黴素和潮黴素抗性。在 多種組合中測試這些載體以產生一組全IgG用於功能分析。抗體純化通過用表達載體從大腸桿菌中分泌來表達Fab片段。細胞在2xYT培養基中生 長至OD600為0.6。用IPTG於33°C誘導表達3小時。從周質餾分中獲得組裝的Fab， 並按照標準方法，通過使用 Streptococcal G 蛋白(HiTrap Protein G HP 柱；GE Healthcare) 的親和層析來純化。將Fab洗脫於pH 2.0的緩衝液中，立即調節至pH 7.0，並對PBSpH7.4 (PBS無鈣和鎂)透析。
從瞬時轉染的CHO細胞的培養基(無血清)製備IgG。按照標準方法，通過使 用A蛋白(HiTrap Protein A HP柱；GE Healthcare)的親和層析來純化IgG。將Fab洗脫 於pH 2.7的緩衝液中，立即調節至pH 7.0，並對PBS pH 7.4 (PBS無鈣和鎂)透析。一般 ELISA通過在4°C孵育過夜將IOOng重組Fc-TrkB抗原結合至96孔微量滴定板。用 5% PBS-Tween( 「PBST」)中的牛奶溶液於33°C封閉微量滴定板1小時。將純化的 Fab稀釋在PBS中，並向每個孔中加入50 μ 1。在33°C孵育1小時後，用PBST漂洗微 量滴定板3次。向每個孔中加入50 μ 1抗-人-κ鏈HRP綴合物(Sigma ；在PBST中稀 釋至O.lng/ml)，並在33°C孵育微量滴定板40分鐘。將微量滴定板用PBST洗3次，用 PBS洗1次。向每個孔中加入100 μ 13，3，，5，5，-四甲基聯苯胺(「ΤΜΒ」)底 物(Sigma)，並在室溫孵育微量滴定板約5分鐘。向每個孔中加入100 μ 1 0.2Ν H2SO4終 止反應。在分光光度計中於450nm讀板。阻斷ELISA用IOOng Fc-TrkB抗原包被ELISA板。A10F18.2IgG的2倍稀釋系列與抗原在 室溫孵育1小時。漂洗去未結合的IgG，向每個孔中加入50nMFab溶液並在室溫孵育1 小時。漂洗去未結合的Fab，並用抗-人κ-HRP綴合物檢測結合的Fab。菌落轉移結合測定(「CLBA」 )基本上按美國專利公開號2005/0255552和2006/0134098所述，用抗原Fc-TrkB 包被的硝酸纖維素濾膜進行Fab片段文庫的篩選。使用ForteBio的親和力測量用ForteBio Octet生物傳感器分析IgG和Fab片段的結合動力學。按照產家的方
法用EZ-Iink生物素化試劑盒(Pierce)將重組Fc-TrkB抗原生物素化。然後將抗原偶聯 至鏈黴親和素包被的傳感器(ForteBio)。用生物薄膜幹涉分析和產家提供的軟體實時監 測Fab結合。從測定的結合常數和解離常數計算親和力。使用Biacore的親和力測量所有Biacore 試劑均購自 GE Healthcare 分部 Biacore (Piscataway，NJ)。用光學 生物傳感器Biacore S51，通過表面等離振子共振測量完成結合動力學參數的測定。此技 術允許配體與受體結合(ka)和解離(kd)的微觀速率常數的無標籤測量。因此其尤其適 合用於表徵抗體_抗原相互作用。通過將Fc-hTrkB固定於Series S CM_5Biacore傳感晶片(經認證的) (Biacore#BR-1005-30)進行關於改進抗體的結合研究。用「Amine Coupling Kit」 (Biacore#BR-1000-50)完成Fc融合蛋白質的共價結合。以5 μ g/ml於pH 4.5的 IOmM醋酸鈉中(Biacore#BR-1003-50)，按10 μ L/分鐘的流速將Fc融合蛋白質連接至
EDC激活的葡聚糖表面。一系列濃度的改進抗體在加入IOOmM NaCL 0.005 % Ρ20的 PBS (Biacore#BR_ 1000-54)中流過捕獲了 Fc-TrkB的晶片。用Biacore S51評估軟體分析 產生的傳感圖。來自所有濃度的數據整體擬合至1 ILangmuir模型。失巢凋亡
在失巢凋亡測定中使用大鼠腸上皮(RIE) -TrkB細胞。用Accutase (Innovative Cell Technologies Inc., SanDiego, CA)分離 RIE/TrkB 細胞，並重懸於 DMEM 完全培養 基中。用無血清DMEM洗細胞3次，並重懸於含0.1% BSA的無血清DMEM中，其中 0.1% BSA稀釋自在PBS中的2% BSA貯液(細胞培養級，#A8806_5G Sigma)。然後將 細胞按 4.2xl05 細胞 /mL、60ml/ 孔(=2.5x IO4 細胞 / 孔)接種至 96 孔 Corning Costar 超低集聚平板(Costar#3474)中。向測試孔中加入IOml TrkB激動劑抗體(保存在PBS 中)至終濃度在1-20 μ g/mL之間。細胞於37°C孵育1小時。向對照孔中加入IOml人 BDNF (R&D，以 20mg/mL 保存在 0.1 % BSA/PBS 中)至終濃度在 10_50ng/mL 之間。 用DMEM(SF)/0.1% BSA稀釋BDNF。然後將細胞孵育額外的24-48小時。按80ml/ 孔加入Cell-Titer Glo(Promega，Madison, WI)並輕搖平板。15分鐘後，將液體轉入96 孔白色透明底平板中並讀出發光。MM V區的克隆和表達Fab TR3-1具有與人恆定區融合的來自起始抗體A10F18.2的完整V區，從大腸 桿菌純化FabTR3-l。在TrkB抗原結合的稀釋ELISA測試中，克隆的Fab產生依賴於抗 體濃度的結合曲線(數據未顯示)。文庫構建和V區盒從人V區段文庫序列構建表位聚焦文庫，所述人V區段文庫序列連接至包含結 合特異性決定簇(「BSD」)和人種系J區段序列的來自起始抗體的獨特的CDR3-FR4 區。用這些「全長」文庫作為「盒」文庫構建的基礎，在「盒」文庫中，最初僅通過 人序列文庫替換起始抗體中的部分V區段。構建了兩種類型的盒。用構架區2內重疊的 共同序列通過搭橋PCR(bridge PCR)產生V重鏈和V κ鏈二者的盒。以這種方式構建了 人V重鏈1和VK鏈II同種型的「前端」人盒文庫和「中間」人盒文庫。通過菌落轉 移結合測定法鑑定出支持結合TrkB抗原的人盒，並根據在ELISA和Forte分析中的親和 力排序。然後在第二文庫篩選中重組具有最高親和力的盒群體，以產生全人V區段。在鑑定出一群具有人V區段的高親和力Fab群體後建立親和力成熟文庫。用簡 並PCR引物突變一組具有人V區段的Fab克隆的共同的BSD序列以產生文庫。用菌落轉 移結合測定法篩選這些誘變文庫。針對ELISA和Forte分析的親和力排序所選擇的Fab。 鑑定出與參考TR3-lFab相比時支持相似的或提高的抗原親和力的突變。此外，對每個具有人V區段的Fab，在輕鏈的CDR3中產生對人種系的點突變。 將89位(Chothia編號)從S變為M，M是所有人種系VkII區段在該位置編碼的胺基酸。用Forte Octet分析的具有人V區段的Fab和IgG對人TrkB抗原的親和力從菌落轉移結合測定法中分離具有人V區段的Fab，並通過抗原結合ELISA確 認。純化在抗原結合ELISA中顯示強陽性信號的Fab克隆，並通過與參考Fab TR3-1的 動力學比較進一步表徵。用ForteBio Octet系統分析結合動力學，該系統用於蛋白質-蛋 白質相互作用的實時無標籤檢測。代表性動力學分析顯示於圖3中。計算的結合常數和 解離常數顯示於表1和表2中。表 權利要求
1.結合酪氨酸受體激酶B(TrkB)的抗體，其中所述抗體包含(a)重鏈可變區，其包含人重鏈V區段、重鏈互補決定區3(CDR3)和重鏈構架區 4 (FR4),和(b)輕鏈可變區，其包含人輕鏈V區段、輕鏈CDR3和輕鏈FR4，其中(i)所述重鏈CDR3 包含胺基酸序列 V(T/V) (S/T/R/N)WFAY(SEQIDNO : 34)；和(ii)所述輕鏈CDR3可變區包含胺基酸序列(S/M)QGT(H/A)(E/V/I) PYT (SEQ ID NO 42)；禾口其中所述抗體是TrkB激動劑。
2.權利要求1的抗體，其中所述重鏈V區段與SEQID NO 16具有至少90%序列同 一性，且其中所述輕鏈V區段與SEQ ID NO 24具有至少90%序列同一性。
3.權利要求1的抗體，其中所述重鏈V區段與選自SEQID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 14和SEQ ID NO: 15的胺基酸具有至少90%序列同一性，且其中所述 輕鏈 V 區段與選自 SEQ ID NO 17、SEQ IDNO 18、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO 22 和 SEQ ID NO 23 的胺基酸具有至少 90% 序列 同一性。
4.權利要求1的抗體，其中i)所述重鏈CDR3包含選自SEQID NO 32和SEQ ID NO 33的胺基酸序列；且ii)所述輕鏈CDR3包含選自SEQID nO 40和SEQ ID NO 41的胺基酸序列。
5.權利要求1的抗體，其中所述重鏈FR4是人種系FR4。
6.權利要求5的抗體，其中所述重鏈FR4是SEQIDNO : 50。
7.權利要求5的抗體，其中所述重鏈J區段包含人種系JH4部分序列 WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO 50)。
8.權利要求1的抗體，其中所述輕鏈FR4是人種系FR4。
9.權利要求8的抗體，其中所述輕鏈FR4是SEQID NO : 61。
10.權利要求8的抗體，其中所述輕鏈J區段包含人種系Jk2部分序列 FGQGKLEIK(SEQ ID NO 61)。
11.權利要求1的抗體，其中所述重鏈V區段和所述輕鏈V區段各包含互補決定區 1 (CDRl)和互補決定區2(CDR2)；其中i)所述重鏈V區段的CDRl包含SEQID NO 27的胺基酸序列；ii)所述重鏈V區段的CDR2包含SEQID NO 31的胺基酸序列；iii)所述輕鏈V區段的CDRl包含SEQID NO 38的胺基酸序列；和iv)所述輕鏈V區段的CDR2包含SEQID NO 39的胺基酸序列。
12.權利要求11的抗體，其中i)所述重鏈V區段的CDRl包含SEQID NO 25 ；ii)所述重鏈V區段的CDR2包含SEQID NO 28 ；iii)所述重鏈CDR3 包含 SEQ ID NO 32 ；iv)所述輕鏈V區段的CDRl包含SEQID NO 35 ；iv)所述輕鏈V區段的CDR2包含SEQ ID NO 38 ；禾口vi)所述輕鏈CDR3包含SEQ IDNO 41。
13.權利要求11的抗體，其中i)所述重鏈V區段的CDRl包含SEQID NO 25 ；ii)所述重鏈V區段的CDR2包含SEQID NO 28 ；iii)所述重鏈CDR3 包含 SEQ ID NO 32 ；iv)所述輕鏈V區段的CDRl包含SEQID NO 36 ；iv)所述輕鏈V區段的CDR2包含SEQ ID NO 38 ；禾口 vi)所述輕鏈CDR3包含SEQ ID NO 40。
14.權利要求11的抗體，其中i)所述重鏈V區段的CDRl包含SEQID NO 25 ；ii)所述重鏈V區段的CDR2包含SEQID NO 28 ；iii)所述重鏈CDR3 包含 SEQ ID NO 32 ；iv)所述輕鏈V區段的CDRl包含SEQID NO 37 ；iv)所述輕鏈V區段的CDR2包含SEQ ID NO 38 ；禾口 vi)所述輕鏈CDR3包含SEQ ID NO 40。
15.權利要求11的抗體，其中i)所述重鏈V區段的CDRl包含SEQID NO 25 ；ii)所述重鏈V區段的CDR2包含SEQID NO 29 ；iii)所述重鏈CDR3 包含 SEQ ID NO 32 ；iv)所述輕鏈V區段的CDRl包含SEQID NO 35 ；iv)所述輕鏈V區段的CDR2包含SEQ ID NO 38 ；禾口 vi)所述輕鏈CDR3包含SEQ IDNO 41。
16.權利要求1的抗體，其中所述重鏈可變區與SEQID NO 4的可變區具有至少 90%胺基酸序列同一性，且所述輕鏈可變區與SEQIDN0 11的可變區具有至少90%胺基酸序列同一性。
17.權利要求1的抗體，其中所述重鏈可變區與選自SEQIDN0: 1、SEQ ID NO 2 和SEQ ID NO: 3的可變區具有至少90%胺基酸序列同一性，且其中所述輕鏈可變區與 選自 SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO 6、SEQ IDNO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9 和SEQ ID NO 10的可變區具有至少90%胺基酸序列同一性。
18.權利要求1的抗體，其中所述重鏈可變區與選自SEQIDN0: 1、SEQ ID NO 2 和SEQ ID NO: 3的可變區具有至少95%胺基酸序列同一性，且其中所述輕鏈可變區與 選自 SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO 6、SEQ IDNO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9 和SEQ ID NO 10的可變區具有至少95%胺基酸序列同一性。
19.權利要求1的抗體，其中所述重鏈可變區包含選自SEQIDN0: 1、SEQ ID NO 2和SEQ ID NO: 3的胺基酸序列，且其中所述輕鏈可變區包含選自SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQID NO 9 和 SEQ ID NO 10 的氨基 酸序列。
20.權利要求1的抗體，其中所述抗體以低於5xlO_8M的平衡解離常數(Kd)結合 TrkB。
21.權利要求1的抗體，其中所述抗體是FAb』片段。
22.權利要求1的抗體，其中所述抗體是IgG。
23.權利要求1的抗體，其中所述抗體是單鏈抗體(scFv)。
24.權利要求1的抗體，其中所述抗體包含人恆定區。
25.權利要求1的抗體，其中所述抗體不結合酪氨酸激酶受體A或酪氨酸激酶受體C。
26.權利要求1的抗體，其中所述抗體結合TrkB的配體結合結構域(LBD)。
27.權利要求1的抗體，其中所述抗體與腦衍生神經營養因子(BDNF)競爭結合 TrkB。
28.權利要求1的抗體， NO 8的輕鏈。
29.權利要求1的抗體， NO 9的輕鏈。
30.權利要求1的抗體， NO 10的輕鏈。
31.權利要求1的抗體， NO 8的輕鏈。
32.特異性結合TrkB的抗體，其中所述抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中所 述重鏈可變區和所述輕鏈可變區各包含以下三個互補決定區(CDR) CDRU CDR2和 CDR3 ；其中i)所述重鏈可變區的CDRl包含SEQID NO 25的胺基酸序列；ii)所述重鏈可變區的CDR2包含選自SEQID NO 28、SEQ ID NO 29和SEQ ID NO 30的胺基酸序列；iii)所述重鏈可變區的CDR3包含選自SEQID NO 32和SEQ IDNO 33的胺基酸 序列；iv)所述輕鏈可變區的CDRl包含選自SEQID NO 35、SEQ ID NO 36和SEQ IDNO 37的胺基酸序列；ν)所述輕鏈可變區的CDR2包含SEQ ID NO 39的胺基酸序列；vi)所述輕鏈可變區的CDR3包含選自SEQ ID NO 40和SEQ IDNO 41的胺基酸序列。
33.可藥用組合物，其包含權利要求1的抗體和生理學上相容的賦形劑。
34.權利要求33的組合物，其中所述藥物組合物還包含在個體中降低血糖水平的藥劑。
35.權利要求33的組合物，其中所述藥物組合物還包含在個體中減輕體重的藥劑。
36.在有需要的個體中降低血糖水平和/或體重的方法，所述方法包括對所述個體施 用治療有效量的權利要求1的抗體。
37.權利要求36的方法，其中所述個體患有前驅糖尿病。
38.權利要求36的方法，其中所述個體患有I型糖尿病。
39.權利要求36的方法，其中所述個體患有II型糖尿病。
40.權利要求36的方法，其中所述個體超重。其中所述抗體包含含有SEQ ID NO 1的重鏈和含有SEQ ID 其中所述抗體包含含有SEQ ID NO 1的重鏈和含有SEQ ID 其中所述抗體包含含有SEQ ID NO 1的重鏈和含有SEQ ID 其中所述抗體包含含有SEQ ID NO 3的重鏈和含有SEQ ID
41.權利要求36的方法，其中所述個體肥胖。
42.權利要求36的方法，其還包括對所述個體施用在降低血糖中有效的治療有效量的第二藥劑。
43.權利要求42的方法，其中所述第二藥劑和所述抗體作為混合物施用。
44.權利要求42的方法，其中所述第二藥劑和所述抗體分開施用。
45.權利要求42的方法，其中所述第二藥劑選自胰島素、磺醯脲類、促胰島素劑類、 二甲雙胍、PPARY激動劑、PPARa激動劑、PPARS激動劑、PPARa/Y雙激動劑、 PPARa/γ/δ泛激動劑、α-葡糖苷酶抑制劑、DPP-IV抑制劑和GLP-1/GLP-1類似 物。
46.權利要求36的方法，其還包括對所述個體施用在減輕體重或肥胖症中有效的治療 有效量的第二藥劑。
47.權利要求46的方法，其中所述第二藥劑和所述抗體作為混合物施用。
48.權利要求46的方法，其中所述第二藥劑分開施用。
49.權利要求46的方法，其中所述第二藥劑選自脂肪酶抑制劑、西布茶明、CB-I抑 製劑、託吡酯、糊精、糊精類似物、瘦素、PYY/PYY類似物和GLP-1/GLP-1類似物。
50.減輕或抑制腦衍生神經營養因子(BDNF)缺乏引起的障礙症狀的方法，其包括對 有需要的受試者施用治療有效量的權利要求1的抗體。
51.權利要求50的方法，其中所述BDNF缺乏引起的障礙選自Rett綜合症、維爾姆 斯瘤、無虹膜、泌尿生殖異常和智力發育遲緩(WAGR)綜合症、黑皮質素受體MC4R缺 乏引起的肥胖症、惡病質/肌肉萎縮綜合症。
52.權利要求50的方法，其中所述BDNF缺乏引起的障礙是Rett綜合症。
53.權利要求50的方法，其中全身施用所述抗體。
全文摘要
本發明提供特異性識別和激動酪氨酸受體激酶B(TrkB)受體的改進的抗體或抗原結合分子及其使用方法。本發明中還提供編碼這類分子的多核苷酸和載體，以及包含所述所核苷酸或載體的宿主細胞。
文檔編號C07K16/28GK102015769SQ200980109719
公開日2011年4月13日 申請日期2009年1月16日 優先權日2008年1月17日
發明者K·R·魯爾森 申請人:Irm責任有限公司