一種酶水解-氣相色譜-質譜聯用測定菸草中糖苷的方法

2023-10-09 19:41:09 4

一種酶水解-氣相色譜-質譜聯用測定菸草中糖苷的方法
【專利摘要】本發明公開了一種超聲提取-大孔樹脂固相萃取淨化-酶水解-氣相色譜-質譜聯用測定菸草中糖苷的方法，採用β-D-葡萄糖苷酶直接對超聲提取後用大孔樹脂固相萃取淨化的糖苷進行酶水解，然後利用氣相色譜-質譜聯用進行定性和相對定量分析，該方法準確，可靠，能準確鑑定24種糖苷和相對定量28種糖苷，適合不同類型菸草中糖苷成分的同時檢測，克服了酸水解的非選擇性、破壞性的水解方式，同時也有利於用商業化的標準譜庫與文獻中的保留指數進行物質確證。
【專利說明】一種酶水解-氣相色譜-質譜聯用測定菸草中糖苷的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於菸草化學分析領域，具體涉及一種酶水解-氣相色譜-質譜聯用測定菸草中糖苷的方法。
【背景技術】
[0002]糖苷類物質是潛香物質中重要的一類，是菸草在生長、發育過程中形成的次級代謝產物，主要是由單糖或雙糖的還原羥基與香氣物質(萜烯醇類、脂肪醇類、C13降異戊二烯類或苯丙烷類衍生物等)鍵合形成的穩定結合態化合物。它不僅是菸草中揮發性香氣成分的重要前驅體(可以通過酶水解或燃燒裂解釋放出遊離態的香氣成分)，還具有廣泛的生物學功能(如香氣成分儲存和運輸的主要形式、保護細胞中的易損結構、清除活性自由基、抗逆及抗病蟲害等作用)。
[0003]現有技術中菸草中糖苷的測定主要採用色譜-質譜聯用的分析方法。目前，酸水解-氣相色譜-質譜聯用(AH-GC-MS)與液相色譜-質譜聯用(LC-MS)技術為分析的主要方法。酸水解具有前處理簡單，易操作、物質鑑定簡單等特點，但酸水解是一種非選擇性、破壞性的水解方式，酸水解不僅水解糖苷，其它成分(如糖酯、果膠等)也能水解，從而產生一系列幹擾成分，此外，酸水解能使糖苷配基產生重排、裂解、消去等副反應，不利於成分的鑑定。液相色譜-質譜聯用技術對很多結構類似的糖苷未能分離，且質譜結構鑑定無商業化的標準譜庫與穩定的保留指數進行確證，限制了該技術在該領域上的應用。

【發明內容】

[0004]本發明擬解決的技術問題如下:針對酸水解條件下對糖苷的破壞性和非選擇性，同時液相色譜-質譜對糖苷的分離能力差和定性確證信息少的缺陷，設計優化超聲提取-固相萃取淨化-酶水解-氣相色譜-質譜聯用定性定量分析菸草中的糖苷成分，該方法準確，可靠，能準確鑑定24種糖苷和相對定量28種糖苷。該方法與現有方法相比，克服了酸水解的非選擇性、破壞性的水解方式，同時也有利於用商業化的標準譜庫與文獻中的保留指數進行物質確證。此外，優化的酶水解條件，保證了該方法最大的水解程度和水解重複性，提高了方法相對定量的精密度。
[0005]本發明設計一種超聲提取-固相萃取淨化-酶水解-氣相色譜-質譜聯用定性定量分析菸草中的糖苷成分，該方法可以同時準確鑑定24種糖苷和相對定量28種糖苷，具有準確度高、重複性好等特點，適合應用於不同類型菸葉中多種糖苷類物質的同時檢測。
[0006]本發明對菸草中糖苷的測定方法包含如下步驟:
(1)提取:稱取一定量的菸草粉末於具塞二角瓶中，加入內標1:苯基_ β _D_批喃匍萄糖苷後加入甲醇超聲提取，將樣品超聲後取上層清液過砂芯濾鬥，殘留物再用甲醇超聲提取一次，合併提取液，在真空、水浴條件下將甲醇濃縮至幹；
(2)淨化:將XAD-2大孔樹脂用去離子水洗至無甲醇氣味，再將XAD-2大孔樹脂裝成固相萃取柱，將上述(I)濃縮物用超純水溶解後轉移至大孔樹脂固相萃取柱中，先用水淋洗除去糖、胺基酸等水溶性雜質，再用乙醚淋洗除去非極性雜質，最後用乙酸乙酯洗脫糖苷成分，洗脫液乾燥後真空、水浴條件下將乙酸乙酯濃縮至2 mL，再用氮氣吹乾；
(3)酶水解糖苷:將上述(2)氮氣吹乾的殘留物用緩衝液溶解，用體積比為1:1的乙醚和正戊烷溶液萃取2次後，向緩衝液中加入水解酶和有機溶劑混勻後放入水浴中充分反應，反應結束後冷卻至室溫；
(4)糖苷水解物提取:加入內標2:4_壬醇，混勻後轉移至離心管中，用體積比為1:1的乙醚和正戊烷溶液萃取，有機相干燥後水浴常壓濃縮至0.5 mL，待進樣；
(5)用氣相色譜-質譜對糖苷進行定性及定量分析，定性採用與標準物質、商業化的標準譜庫NIST08和WileyOS和保留指數NIST資料庫進行比對，內標I用於糖苷內標法的相對定量，內標2用於酶水解方法的優化。
[0007]其中氣相色譜-質譜分析條件如下:
氣相色譜柱為HP-5ms，60mX0.25_ 1.dX0.25 μ m d.f，進樣體積:2 μ L，進樣口溫度280 °C，分流進樣，分流比為20:1，載氣為氦氣，恆流模式，流速為1.0 mL/min，柱溫箱為程序升溫，60 °C保持lmin，以2 °C /min升至230 °C，保持4 min ;離子源溫度為230 °C，四級杆溫度為150 °C，電離能70 eV，傳輸線溫度為280 °C，掃描模式為全掃描，質量範圍45-400 amu,溶劑延遲 6 min。
[0008]本發明中的XAD-2大孔樹脂玻璃柱的規格為Φ2 cmXIO cm。
[0009]本發明中的緩衝液為pH=5.6的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝液，用0.2 mo I/L的磷酸氫二鈉和0.1 mol/L的檸檬酸溶液，將其按照體積比116:84混勻獲得。。
[0010]本發明中的水解酶為β -D-葡萄糖苷酶，源於苦杏仁(>=10 units/mg)。
[0011]本發明中的酶水解過程中加入的有機溶劑為體積比為1:1的乙醚:正戊烷溶液。
[0012]本發明中的酶水解條件(反應溫度、反應時間、β -D-葡萄糖苷酶量、有機溶劑體積和pH值)通過Plackett-Burman設計得到反應溫度、反應時間、有機溶劑體積和pH值對酶水解的程度影響顯著，進一步運用星點設計優化獲取酶水解條件的確定值，結果表明當溫度為36.8 °C，溶劑2.1 mL,時間為60 h，pH值為5.6和酶量為I mg/mL時，酶水解程度最大。
[0013]本發明所達到的有益效果:本發明方法準確，可靠，能同時準確鑑定24種糖苷和相對定量28種糖苷。該方法與現有方法相比，克服了酸水解的非選擇性、破壞性的水解方式，同時也有利於用商業化的標準譜庫與文獻中的保留指數進行物質確證。此外，優化的酶水解條件，保證了該方法最大的水解程度和水解重複性，提高了方法相對定量的精密度。
[0014]本發明通過利用優化的前處理及色譜條件，5天內重複測定5次來計算方法的精密度(表I)，相對定量的28種糖苷類物質重複性較好，日間相對標準偏差大於15%只有4和28號物質，大於10%有2、3、11、23、24和26號物質，其它物質的日間相對標準偏差均低於10%，結果表明方法具有較好的穩定性和重複性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1:本發明中糖苷類物質酶水解機理方程式；
圖2:本發明中糖苷類物質空白烤菸樣品(未加酶)的GC-E1-MS色譜圖。
[0016]圖3:本發明中糖苷類物質烤菸樣品酶水解的GC-E1-MS色譜圖。[0017]圖4:本發明中糖苷類物質曬煙樣品酶水解的GC-E1-MS色譜圖。
[0018]圖5:本發明中糖苷類物質香料煙樣品酶水解的GC-E1-MS色譜圖。
[0019]【具體實施方式】:
通過以下實例對上述發明進一步進行描述，但並不限制本發明。
[0020]實施例1
本發明酶水解-氣相色譜-質譜聯用測定菸草中糖苷的方法，測定方法包括如下步
驟:
(1)提取:準確稱取4.0000 g菸草粉末於具塞三角瓶中，加入250 Ug苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷內標1，同時加入40 mL甲醇超聲提取30 min (100 Hz常溫)，超聲結束後靜置15 min取上層清液過濾，殘留物再加入40 mL甲醇超聲提取30 min (100 Hz常溫)，超聲結束後合併濾液，在旋轉濃縮儀中將甲醇濃縮至2 mL ；
(2)淨化:用去離子水25mL溶解混勻後，將其轉移至XAD-2大孔樹脂玻璃柱中，吸附後的糖苷物質首先用50 mL水淋洗除水溶性糖、胺基酸等物質(流速控制在1-2 mL/min),再用60 mL的乙醚淋洗除游離態香氣成分等非極性物質，最後用100 mL乙酸乙酯洗脫糖苷，乙酸乙酯經過無水硫酸鈉乾燥後，旋轉濃縮儀中濃縮至2 mL，再用氮氣將其吹乾，得到糖苷提取物；
(3)酶水解糖苷:用30mL pH=5.6的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝液將糖苷提取物溶解並混勻，用20 mL乙醚:正戊烷(V/V 1:1)萃取2次，除去痕量的游離態香氣物質，將其等量(各
15mL)放入2個20 mL頂空瓶中，一份為空白(未加酶)，另一份加入15 mg β-D-葡萄糖苷酶，混勻後加入2.1 mL乙醚:正戊烷(V/V 1:1)，放入36.8 °C水浴中反應60 h，反應結束後
冷卻至室溫
(4)糖苷水解物提取:加入63.5 Ug 4-壬醇內標2，混勻後轉移至離心管中再分別加Λ 20 mL乙醚:正戊烷(V/V 1:1)萃取4次，將合併的乙醚:正戊烷(V/V 1:1)用無水硫酸鈉乾燥後濃縮至0.5 mL,渦旋混勻轉移至0.25mL微量色譜瓶中進樣。
[0021](5)用氣相色譜-質譜對糖苷進行定性及定量分析，定性採用與標準物質、商業化的標準譜庫NIST08和Wiley08和保留指數NIST資料庫進行比對，數據見表(I )，其中氣相色譜-質譜分析條件如下:
氣相色譜柱為HP-5ms，60mX0.25_ 1.dX0.25 μ m d.f，進樣體積:2 μ L，進樣口溫度280 °C，分流進樣，分流比為20:1，載氣為氦氣，恆流模式，流速為1.0 mL/min，柱溫箱為程序升溫，60 °C保持lmin，以2 °C /min升至230 °C，保持4 min ;離子源溫度為230 °C，四級杆溫度為150 °C，電離能70 eV，傳輸線溫度為280 °C，掃描模式為全掃描，質量範圍45-400 amu,溶劑延遲 6 min。
【權利要求】
1.一種酶水解-氣相色譜-質譜聯用測定菸草中糖苷的方法，其特徵在於:測定方法包括如下步驟: (1)提取:稱取一定量的菸草粉末於具塞二角瓶中，加入內標1:苯基_ β _D_批喃匍萄糖苷後加入甲醇超聲提取，將樣品超聲後取上層清液過砂芯濾鬥，殘留物再用甲醇超聲提取一次，合併提取液，在真空、水浴條件下將甲醇濃縮至幹； (2)淨化:將XAD-2大孔樹脂用去離子水洗至無甲醇氣味，再將XAD-2大孔樹脂裝成固相萃取柱，將上述(I)濃縮物用超純水溶解後轉移至大孔樹脂固相萃取柱中，先用水淋洗，再用乙醚淋洗，最後用乙酸乙酯洗脫，洗脫液乾燥後真空、水浴條件下將乙酸乙酯濃縮至2mL，再用氮氣吹乾； (3)酶水解糖苷:將上述(2)氮氣吹乾的殘留物用緩衝液溶解，用體積比為1:1的乙醚和正戊烷溶液萃取2次後，向緩衝液中加入水解酶和有機溶劑混勻後放入水浴中充分反應，反應結束後冷卻至室溫； (4)糖苷水解物提取:加入內標2:4_壬醇，混勻後轉移至離心管中，用體積比為1:1的乙醚和正戊烷溶液萃取，有機相干燥後水浴常壓濃縮至0.5 mL，待進樣； (5)用氣相色譜-質譜對糖苷進行定性及定量分析，定性採用與標準物質、商業化的標準譜庫NIST08和Wiley08和保留指數NIST資料庫進行比對，其中氣相色譜-質譜分析條件如下: 氣相色譜柱為HP-5ms，60mX0.25_ 1.dX0.25 μ m d.f，進樣體積:2 μ L，進樣口溫度280 °C，分流進樣，分流比為20:1，載氣為氦氣，恆流模式，流速為1.0 mL/min，柱溫箱為程序升溫，60 °C保持lmin，以2 °C /min升至230 °C，保持4 min ;離子源溫度為230 °C，四級杆溫度為150 °C，電離能70 eV，傳輸線溫度為280 °C，掃描模式為全掃描，質量範圍45-400 amu,溶劑延遲 6 min。
2.如權利要求書I所述的一種酶水解-氣相色譜-質譜聯用測定菸草中糖苷的方法，其特徵在於:XAD-2大孔樹脂玻璃柱的規格為Φ2 cmXIO cm。
3.如權利要求書I所述的一種酶水解-氣相色譜-質譜聯用測定菸草中糖苷的方法，其特徵在於:緩衝液為pH=5.6的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝液。
4.如權利要求書I所述的一種酶水解-氣相色譜-質譜聯用測定菸草中糖苷的方法，其特徵在於:水解酶為β-D-葡萄糖苷酶，>=10 units/mg。
5.如權利要求書I所述的一種酶水解-氣相色譜-質譜聯用測定菸草中糖苷的方法，其特徵在於:酶水解過程中加入的有機溶劑為體積比為1:1的乙醚:正戊烷溶液。
6.如權利要求書I所述的一種酶水解-氣相色譜-質譜聯用測定菸草中糖苷的方法，其特徵在於:酶水解條件為溫度為36.8 °C，溶劑2.1 mL,時間為60 h，pH值為5.6和酶量為 I mg/mL0
【文檔編號】G01N30/06GK103822986SQ201410090618
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月13日 優先權日:2014年3月13日
【發明者】蔡凱, 趙會納, 向章敏, 任竹, 雷波, 潘文杰 申請人:貴州省菸草科學研究院