一種高效表達外源蛋白的方法

2023-10-09 07:16:54

專利名稱：一種高效表達外源蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及一種高效表達外源蛋白的方法。
背景技術：
利用轉基因技術在生物反應器中生產高附加值蛋白質具有重要的理論意義和應用價值。生物反應器經歷了細菌基因工程、細胞基因工程、轉基因動物生物反應器及轉基因植物生物反應器等四個階段。 細菌基因工程產物往往不具備生物活性，必須經過糖基化、羥基化等一系列修飾加工後，才能成為有效的藥物，而細胞基因工程又因為哺乳動物細胞的培養條件要求相當苛刻，成本太高，限制了規模生產。動物生物反應器具有廣品質量聞，容易提純的特點，彌補了其它各類基因表達系統的缺陷，但是其技術本身涉及道德倫理等問題，也限制了其大規模生產。轉基因植物生物反應器不僅彌補了上述反應器的缺陷，而且更易於推廣，獲得穩定遺傳的轉基因植物種系後，比較容易建立低成本的大規模生產系統，因而具有巨大的應用前景。但是，在轉基因植物反應器中，常常發生外源基因插入位點的不確定性和基因之間複雜的相互作用，從而導致轉基因作物發生代謝、發育、遺傳等方面的一系列變化，產生所謂的轉基因作物的非預期效應。該效應是轉基因作物安全性評價的重要內容之一，但是常規的分析檢測手段卻往往難以準確評價。

發明內容
本發明的目的是提供一種高效表達外源蛋白的方法。本發明提供的表達外源蛋白的方法，包括如下步驟(I)將所述外源蛋白的編碼基因插入pMYC2載體的多克隆位點，使所述外源蛋白的編碼基因和PMYC2載體上的6個MYC標籤的編碼基因形成融合基因，得到重組質粒；(2)將步驟(I)的重組質粒轉化農桿菌，得到重組農桿菌；(3)將步驟(2)的重組農桿菌菌液注射菸草植株的葉片後繼續培育菸草植株；(4)取注射了重組農桿菌菌液的菸草葉片，提取蛋白並進行MYC親和純化，得到純化的外源蛋白。步驟(3)中，所述葉片可為新葉；所述新葉為生長30-35天的葉片。所述新葉優選為生長32天的葉片。步驟(3)中，所述培育菸草植株的時間可為24至69小時，優選為69小時。步驟(4)中，所述提取蛋白的方法可包括如下步驟將所述菸草葉片進行液氮研磨，然後用蛋白提取液進行提取，得到蛋白粗提液。所述蛋白提取液具體可為RB溶液；所述RB溶液的pH為7. 8，由溶質和水組成；所述溶質及其濃度如下50mM Tris, 50mM NaCl,10% (體積百分含量)甘油，0.1% (體積百分含量)Tween-20,0. 15% (體積百分含量)P -巰基乙醇，25mM咪唑。
步驟(4)中，所述MYC親和純化具體可包括如下步驟
①在MYC親和介質中加入所述蛋白粗提液，4°C孵育Ih ；②清洗步驟①的MYC親和介質；③在步驟②的MYC親和介質中加入MYC肽溶液，4°C孵育10小時，然後離心取上清，即為含有純化的外源蛋白的溶液。步驟②中，可用所述RB溶液進行所述清洗。 步驟③中，所述MYC肽溶液具體由MYC肽和所述RB溶液組成。所述MYC肽的在所述MYC肽溶液中的濃度可為IO-IOOii g/ml，優選為50ii g/ml。所述農桿菌具體可為農桿菌菌株GV3101。所述菸草具體可為本生煙。所述外源蛋白具體可為序列表的序列2所不的蛋白質。所述外源蛋白的編碼基因優選為序列表的序列3所示的基因。本發明將外源蛋白基因克隆到pMYC2載體上，使其與pMYC2載體上的6個MYC標籤的編碼基因形成融合基因，然後以菸草葉片為反應器，利用農桿菌侵染轉化法在菸草葉片中瞬時高效的表達外源蛋白。然後，根據重組蛋白所帶有的MYC親和標籤，利用帶有相應標籤抗體的親和介質將菸草表達蛋白高效純化，最後再競爭洗脫親和介質最終獲得純化後的目的蛋白。純化後蛋白具有生物活性，可用於進一步的生物學功能研究。本發明可實現一步法純化蛋白，簡單快捷，而且蛋白純度較高。利用該方法所獲得的外源重組蛋白可用於生物安全評價和生物功能研究。


圖I為MYC-COIl表達檢測；1 :注射對照農桿菌(空載體)的葉片；2 :注射侵染液的葉片3 :注射重組農桿菌(pMYC-COIl)的葉片。圖2為轉化需要的最佳葉片狀態；1 :注射侵染液後的葉片(陰性對照)；2 :老葉中表達的蛋白；3 :中葉中表達的蛋白；4 :新葉中表達的蛋白。圖3為轉化後蛋白表達的最佳時間；1 :注射侵染液的葉片(陰性對照)；2 :轉染重組農杆囷24小時後葉片表達的蛋白；3 :轉染重組農杆囷32小時後葉片表達的蛋白；4 :轉染重組農桿菌42小時後葉片表達的蛋白；5 :轉染重組農桿菌52小時後葉片表達的蛋白；6 :轉染重組農桿菌62小時後葉片表達的蛋白；7 :轉染重組農桿菌69小時後葉片表達的蛋白。圖4為最適蛋白提取緩衝液的確定；I :緩衝液A提取的蛋白；2:緩衝液B提取的蛋白；3 :緩衝液C提取的蛋白；4 :RB緩衝液提取的蛋白；5 :緩衝液D提取的蛋白；6 :緩衝液E提取的蛋白；7 =TBS緩衝液提取的蛋白；8 =PBS緩衝液提取的蛋白。圖5為最適MYC肽競爭洗脫濃度的確定；I 10 u g/ml MYC肽洗脫的蛋白；2 50 u g/ml MYC肽洗脫的蛋白；3 100 u g/ml MYC肽洗脫的蛋白。圖6為JAZl-HIS蛋白洗脫圖譜；圖中的洗脫峰即為Ni柱親和層析中得到的JAZl-HIS 蛋白。圖7為MYC-COIl活性檢測；1 :蛋白粗提液(加入冠菌素的處理)；2 =MYC-COIl蛋白液(不加入冠菌素的處理)；3 =MYC-COIl蛋白液(加入冠菌素的處理)。
具體實施例方式以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重複實驗，結果取平均值。COIl蛋白的氣基酸序列如序列表的序列2所不，其編碼基因如序列表的序列3所示。在模式植物擬南芥生長發育的過程中，F-box蛋白COIl具有非常重要的調控作用。但是研究中發現，COIl蛋白無法通過原核表達大量獲得純化蛋白。而通過本發明，我們能夠高效獲得純化的並具有生物活性的COIl蛋白，並進行其功能研究。實施例中所用的擬南芥是購自ABRC (Arabidopsis Biological ResourceCenter)的哥倫比亞生態型擬南芥，貨號為CS28166。 大腸桿菌DH5 a :購自NEB公司，貨號為C2987H。農桿菌菌株GV3101 :公眾可以從清華大學獲得；參考文獻R. Berres etal. Transformation of vitis tissue by different strains of agrobacteriumtumefaciens containing the T_6b gene, Plant Cell Reports 11:192—195。本生煙(Nicotiana benthamiana):公眾可以從清華大學獲得；參考文獻Gianinna Brignet et al.Viral pathogenicity determinants are suppressors oftransgene silencing in Nicotiana benthamiana, The EMBO Journal 17 :6739_6746。pMYC2載體公眾可以從清華大學獲得；參考文獻Linghui Xu et al. TheSCF COIl Ubiquitin-Ligase Complexes are Required for Jasmonate Response inarabidopsis, Plant Cell 14 :1919-1939，2002 ;pMYC2 載體是將六個拷貝的 MYC 片段的編碼DNA (如序列表中序列I所示)，通過BamHI和SmaI酶切位點克隆到pBIN_pR0K2載體中得到的。MYC 親和介質Sigma_aldrich,貨號 a7470。MYC 肽Sigma-aldrich，貨號 M2435。RB緩衝液(pH7. 8):由溶質和水組成；溶質及其濃度如下50mM Tris,50mM NaCl，10% (體積百分含量)甘油，0.1% (體積百分含量)Tween-20,0. 15% (體積百分含量)￠-巰基乙醇，25mM咪唑。緩衝液A :由50mM Tris-HCl (pH7. 4)緩衝液和溶質組成；溶質及其濃度如下IOOmM NaCl, IOmM MgCl2, 5mM KCl，ImM DTT。緩衝液B :由50mM Tris-HCl (pH7. 4)緩衝液和溶質組成；溶質及其濃度如下IOOmM NaCl，IOmM MgCl2, 5mM KCl，ImM DTT, 0. 1% (體積百分含量)Tween-20。緩衝液C :由50mM Tris-HCl (pH7. 4)緩衝液和溶質組成；溶質及其濃度如下IOOmM NaCl，ImM DTT, 0. 1% (體積百分含量)Tween-20。緩衝液D :由50mM Tris-HCl (pH7. 4)緩衝液和溶質組成；溶質及其濃度如下IOOmM NaCl,5mM KCl,ImM DTT。緩衝液E(pH7.8):由溶質和水組成；溶質及其濃度如下50mM Tris,50mM NaCl,0. 1% (體積百分含量)Tween-20,0. 15% (體積百分含量)P -巰基乙醇。
TBS緩衝液由50mM Tris-HCl (pH7. 4)緩衝液和溶質組成；溶質及其濃度如下150mM NaCl。PBS 緩衝液136mM NaCl, 4. 3mM Na2HPO4, 2. 7mM KCl，I. 4mM KH2PO4, pH7. 4。緩衝液50 由50mM PBS緩衝液(pH7. 4)和溶質組成；溶質及其濃度如下0. 5MNaCl，50mM 咪唑。緩衝液400 50mM PBS緩衝液(pH7. 4)和溶質組成；溶質及其濃度如下0. 5MNaCl，400mM 咪唑。實施例I、重組表達載體和重組農桿菌的構建一、重組表達載體的構建
I、以擬南芥cDNA為模板，用Fl和Rl組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。Fl :5』 -TCCCCCGGGATGGAGGATCCTGATATCAAGA-3』 ；Rl :5』 -GGCGAGCTCTCATATTGGCTCCTTCAGGACTC-3』。PCR 擴增程序95°C預變性 5min ;95°C變性 30s，60°C退火 30s，72°C延伸 2min，共25個循環；72°C再延伸lOmin。2、用限制性內切酶Small和SacI雙酶切步驟I的PCR擴增產物，回收酶切產物。3、用限制性內切酶Small和SacI雙酶切步驟2的pMYC2載體，回收線性化的載體骨架(約Ilkbp)。4、將步驟2的酶切產物和步驟3的載體骨架在T4連接酶的作用下16°C連接16h，得到連接產物。5、將步驟4的連接產物轉化大腸桿菌DH5 a感受態細胞，在含有50 U g/ml卡那黴素的平板上篩選陽性克隆。6、將步驟5的陽性克隆提取質粒並測序，測序結果表明得到了重組質粒PMYC2-C0I1。根據測序結果，對重組質粒pMYC2-C0Il進行結構描述如下在pMYC2載體的Small和SacI酶切位點之間插入了序列表的序列3所示DNA得到的重組質粒(序列表的序列3所示的DNA編碼序列表的序列2所示的COIl蛋白)。重組質粒pMYC2-C0Il中COIl蛋白的編碼基因和骨架載體上的6個MYC標籤的編碼基因形成融合基因。二、重組農桿菌的構建I、將重組質粒pMYC2-C0Il載體電激轉化入農桿菌菌株GV3101，28°C培養2_3天，得到重組農桿菌。2、將重組農桿菌劃線培養於LB培養基(含50 ii g/ml卡那黴素、50 U g/ml慶大黴素和10 u g/ml利福平)平板上，28°C倒置培養2-3天。3、挑取單克隆至2-3ml液體LB培養基(含50 y g/ml卡那黴素，50 u g/ml慶大黴素和 IOii g/ml 利福平)中，28°C、240rpm 培養 20-24h。4、轉接100-200 U I菌液至IOml液體LB培養基(含50 y g/ml卡那黴素，50 u g/ml慶大黴素和10 u g/ml利福平)中，28°C、240rpm培養20_24h，至OD600值為0. 6-0. 8。實施例2、COIl蛋白的製備和純化(蛋白表達確定)一、轉化前菸草的培育I、將本生煙種子鋪於MS培養基上，4°C黑暗春化3天後，放置於植物房中培養(22°C ; 16小時光照，8小時黑暗)至幼苗長出兩片葉子(7-10天)。2、將幼苗移植於混合土(蛭石黑土為I : I ;質量比)中，澆足水，繼續培養(280C ；16小 時光照，8小時黑暗)3周(2-3周均可)。二、轉化前重組農桿菌的培養I、將Iml實施例I的步驟二得到的重組農桿菌菌液裝於I. 5ml EP管中，20°C、4000g離心5min，收集菌體。2、用500 ill侵染注射液(由溶質和水組成；溶質及其含量為10mM MgCl2,IOmMMES, 0. 2mM乙醯丁香酮)懸浮菌體，室溫放置4小時(3_5h均可)。三、用重組農桿菌瞬時轉化菸草在步驟一得到的生長了 32天的菸草幼苗葉片上注射步驟二得到的重組農桿菌菌液，每個葉片注射300 yl，注射菌液後開始計時，69小時後分別取各個進行了注射處理的葉片。四、COIl蛋白的提取取I. 5g葉片，液氮充分研磨，加入4. 5ml RB緩衝液，混勻；4 °C、13000g離心15min，取上清；0. 22 ii M濾器過濾，得到約4. 5ml蛋白粗提液。五、對照液的製備I、轉化前菸草的培育同步驟一。2、對照農桿菌的製備用pMYC2載體轉化入農桿菌菌株GV3101，採用實施例I的步驟二的方法製備得到對照農桿菌菌液。3、轉化前對照農桿菌的培養用對照農桿菌代替重組農桿菌，其它同步驟二。4、用對照農桿菌轉化菸草用對照農桿菌的菌液代替重組農桿菌的菌液，其它同步驟三。5、蛋白的提取(I)取I. 5g葉片，液氮充分研磨，加入4. 5ml RB緩衝液,混勻；4°C、13000g離心15min,取上清；0. 22 u M濾器過濾，得到約4. 5ml對照粗提液。六、蛋白量的比較將步驟四得到的蛋白粗提液和步驟五得到的對照液進行western blot鑑定。所用的一抗為抗MYC抗體(Roche，貨號11667149001)，所有的二抗為羊抗鼠抗體(Abcam，貨號Ab6789)。結果見圖I (各泳道均含有總蛋白25 y g)。步驟五得到的對照蛋白液沒有顯示雜交信號，而步驟四得到的蛋白粗提液有信號，表明COII表達正常。實施例3、COII蛋白的製備和純化(葉片的最佳轉化時間的確定)一、轉化前菸草的培育同實施例2的步驟一。二、轉化前重組農桿菌的培養同實施例2的步驟二。
三、用重組農桿菌轉化菸草在步驟一得到的同一菸草幼苗的不同葉片(老葉為生長44天的葉片；中葉為生長38天的葉片；新葉為生長32天的葉片)上分別注射步驟二得到的重組農桿菌菌液，每個葉片注射300 yl，注射菌液後開始計時，69小時後分別取各個進行了注射處理的葉片。四、COIl蛋白的提取同實施例2的步驟四。五、蛋白量的比較將各個葉片得到的蛋白粗提液進行western blot鑑定，同實施例2的步驟六。結果見圖2 (各泳道均含有總蛋白25 ii g)。不同葉片中COIl蛋白表達的情況不同，在幼嫩的新葉中蛋白表達量最高。 實施例4、COIl蛋白的製備和純化(蛋白表達的最佳時間的確定)一、轉化前菸草的培育同實施例2的步驟一。二、轉化前重組農桿菌的培養同實施例2的步驟二。三、用重組農桿菌轉化菸草在步驟一得到的生長了 32天的菸草幼苗葉片上注射步驟二得到的重組農桿菌菌液，每個葉片注射300 iil，注射菌液後開始計時，分別於24小時、32小時、42小時、52小時、62小時和69小時後取各個進行了注射處理的葉片。四、COIl蛋白的提取同實施例2的步驟四。五、蛋白量的比較將各個葉片得到的蛋白粗提液進行western blot鑑定，同實施例2的步驟六。結果見圖3 (各泳道均含有總蛋白25y g)。不同表達時間的葉片COIl蛋白表達的情況不同，注射重組農桿菌後40-70小時COIl蛋白表達量達到最高值。實施例5、COIl蛋白的製備和純化(最佳蛋白提取緩衝液的確定)一、轉化前菸草的培育同實施例2的步驟一。二、轉化前重組農桿菌的培養同實施例2的步驟二。三、用重組農桿菌轉化菸草在步驟一得到的生長了 32天的菸草幼苗的葉片上注射步驟二得到的重組農桿菌菌液，每個葉片注射300 iil，注射菌液後開始計時，69小時後取各個進行了注射處理的葉片。四、COIl蛋白的提取取I. 5g葉片，液氮充分研磨，加入4. 5ml緩衝液(RB緩衝液、緩衝液A、緩衝液B、緩衝液C、緩衝液D、緩衝液E、TBS緩衝液或PBS緩衝液)，混勻；4°C、13000g離心15min，取上清；0. 22 PM濾器過濾，得到約4. 5ml蛋白粗提液。五、蛋白量的比較
將各個蛋白粗提液進行western blot鑑定，同實施例2的步驟六。結果見圖4(各泳道均含有總蛋白25 y g)。RB緩衝液提取的蛋白狀態最好。實施例6、COIl蛋白的製備和純化(最適的MYC肽競爭洗脫濃度的確定)一、轉化前菸草的培育同實施例2的步驟一。二、轉化前重組農桿菌的培養同實施例2的步驟二。三、用重組農桿菌轉化菸草 同實施例4的步驟三。四、COIl蛋白的提取和純化將步驟三得到的葉片進行COIl蛋白的提取和純化，步驟如下UCOIl蛋白的提取取I. 5g葉片，液氮充分研磨，加入4. 5ml RB緩衝液，混勻；4 °C、13000g離心15min，取上清；0. 22 ii M濾器過濾，得到約4. 5ml蛋白粗提液。2、COIl蛋白的純化(I)取100 ill MYC親和介質用RB緩衝液洗5次(每次Iml)進行平衡。(2)在步驟⑴的MYC親和介質中加入1.5ml蛋白粗提液，4°C、360度翻轉孵育Ih0(3)用RB緩衝液清洗步驟(2)的親和介質5次(每次Iml)，往親和介質中加入600 u I MYC肽溶液(由MYC肽和RB緩衝液組成，MYC肽的濃度分別為IOii g/ml、50ii g/ml或100 u g/ml)，在4°C >360度翻轉孵育10小時，離心(4。。、6000g、30s)取上清，即為MYC-C0I1
蛋白液。五、蛋白量的比較將採用不同MYC肽競爭濃度得到的各個MYC-COIl蛋白液進行western blot鑑定，同實施例2的步驟六。結果見圖5。50 ii g/ml MYC肽即可達到最大競爭洗脫效果。實施例7、COII蛋白生物活性的檢測在已知的茉莉素信號通路中，COIl蛋白在JA-Ile或冠菌素存在的情況下能與JAZ蛋白相互作用，因此可利用COIl蛋白這一生物學功能檢測純化後的蛋白是否具有生物活性。一、MYC-COIl蛋白液的製備I、轉化前菸草的培育同實施例2的步驟一。2、轉化前重組農桿菌的培養同實施例2的步驟二。3、用重組農桿菌轉化菸草同實施例4的步驟三。4、COIl蛋白的提取和純化(I)取I. 5g葉片，液氮充分研磨，加入4. 5ml RB緩衝液,混勻；4°C、13000g離心15min，取上清；0. 22 ii M濾器過濾，得到約4. 5ml蛋白粗提液。(2)COIl蛋白的純化①取100 ill MYC親和介質用RB緩衝液洗5次(每次Iml)進行平衡。②在步驟①的MYC親和介質中加入I. 5ml蛋白粗提液，4°C、360度翻轉孵育Ih ;然後再加入I. 5ml蛋白粗提液，4°C、360度翻轉孵育Ih ;然後再加入I. 5ml蛋白粗提液，4°C、360度翻轉孵育Ih。③用RB緩衝液清洗步驟②的親和介質5次(每次lml)，往親和介質中加入600 illMYC肽溶液(由MYC肽和RB緩衝液組成，MYC肽的濃度為50 u g/ml)，在4°C、360度翻轉孵育10小時，離心(4°C、6000g、30s)取上清，即為MYC-COII蛋白液(蛋白濃度約350 y g/ml)。二、JAZl-His蛋白液的製備 I、載體構建(I)以擬南芥的cDNA為模板，用F2和R2組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴
增產物。F2 :5』 -AAAAGAATTCATGTCGAGTTCTATGGAATG-3』 ；R2 :5 』 -AAACTGCAGTTACATCATCATCATCATCACTATTTCAGCTGCTAAAC-3，。PCR 擴增程序95°C預變性 5min ;95°C變性 30s，60°C退火 30s，72°C延伸 lmin，共25個循環；72°C再延伸lOmin。(2)用限制性內切酶Ecor I和Pst I雙酶切步驟⑴的PCR擴增產物，回收酶切產物。(3)用限制性內切酶Ecor I和Pst I雙酶切pMAL_c2x載體(NEB，貨號謝8076S)，回收線性化的載體骨架(約7kb)。(4)將步驟(2)的酶切產物和步驟(3)的載體骨架在T4連接酶的作用下16°C連接16h，得到連接產物。(5)將步驟(4)的連接產物轉化大腸桿菌DH5 a感受態細胞，在含有100 U g/ml氨苄青黴素的平板上篩選陽性克隆。(6)將步驟(5)的陽性克隆提取質粒並測序，測序結果表明得到了重組質粒pMAL-c2x-JAZl-HIS。根據測序結果，對重組質粒pMAL-c2x-JAZl_HIS進行結構描述如下在pMAL-c2x載體的Ecor I和Pst I酶切位點之間插入了序列表的序列4所示DNA得到的重組質粒(序列表的序列4所示的DNA編碼JAZl-His融合蛋白)。2、重組菌的構建將重組質粒pMAL-c2x-JAZl-HIS熱擊轉化大腸桿菌TBl菌株(NEB，貨號E4122S)感受態細胞中，得到重組菌。3、蛋白表達(I)挑取步驟2得到的重組菌的單克隆於20ml LB液體培養基(含100 ii g/ml氨苄青黴素)，37°C 220rpm培養約16h。(2)以I : 100的體積比轉接步驟⑴的菌液於LBG液體培養基(1%胰蛋白腖，
0.5%酵母提取物，0.5% NaCl，0. 2%葡萄糖；含1001^/1111氨苄青黴素)，371 245rpm培養約 2h 30min,至 OD600 約為 0. 5。(3)在步驟⑵的菌液中加入IM IPTG溶液(每升菌液加入300u IPTG溶液I)，16 °C 220rpm 培養約 16h。(4)取步驟(3)的菌液，離心(4°C，5000g，5min)，收集菌體。4、蛋白純化(I)將步驟3收集的菌體加入IOOml緩衝液50，充分懸浮。(2)超聲(功率400，超聲2s，停2s，超聲IOmin)破碎菌體，離心(12000g,4°C,15min)收集上清,0. 22 u m過濾。(3)將步驟⑵的濾液以0. 5ml/min的流速上樣於Ni-NTA層析柱(GEhealthcare，貨號 17-5318-02)。(4)用緩衝液50以lml/min的流速洗脫步驟(3)的層析柱至基線。 (5)用緩衝液400以lml/min的流速對步驟(4)的層析柱進行競爭洗脫(見圖6)，收集洗脫峰(整個洗脫過程除了穿過峰僅存在一個明顯的洗脫峰)。(6)用30kd超濾管將步驟(5)的洗脫液濃縮至Iml以下，使用離心(4°C，5000g，30min),收集上清。(7)將步驟(6)的上清以lml/min的流速上樣於HiPrep26/10 Desalting柱(GEhealthcare，貨號17508701)，用RB緩衝液以5ml/min的流速洗脫，收集洗脫峰。(8)收集的洗脫液即為JAZl-His蛋白液，進行420 ill分裝，_80°C保存。三、COII蛋白生物學活性檢測(I)將200 ill步驟二得到的JAZl-His蛋白液、IOOiU鎳親和介質(QiAgen，貨號30210)和400 ill RB緩衝液，在4°C下，360度翻轉孵育lh。(2)用RB緩衝液清洗步驟(I)的親和介質5次(每次lml)，往親和介質中加入200iil步驟一得到的MYC-COIl蛋白液，再加入或不加入0. 5iil 0. ImM冠菌素(SigmA-Aldrich，貨號C8115)和300 RB緩衝液，4°C下，360度翻轉孵育Ih ;不加入冠菌素的樣品即可作為活性的陰性對照樣。(3)用RB緩衝液清洗步驟(2)的親和介質5次(每次lml)，離心(4°C、6000g、30s)
收集沉澱。(4)將沉澱進行western blot鑑定，同實施例2的步驟六。結果見圖7，純化得到的MYC-COIl具有生物學活性。
權利要求
1.一種表達外源蛋白的方法，包括如下步驟 (1)將所述外源蛋白的編碼基因插入PMYC2載體的多克隆位點，使所述外源蛋白的編碼基因和PMYC2載體上的6個MYC標籤的編碼基因形成融合基因，得到重組質粒； (2)將步驟(I)的重組質粒轉化農桿菌，得到重組農桿菌； (3)將步驟(2)的重組農桿菌菌液注射菸草植株的葉片後繼續培育菸草植株； (4)取注射了重組農桿菌菌液的菸草葉片，提取蛋白並進行MYC親和純化，得到純化的外源蛋白。
2.如權利要求I所述的方法，其特徵在於步驟(3)中，所述葉片為新葉；所述新葉為生長30-35天的葉片，優選為生長32天的葉片。
3.如權利要求I或2所述的方法，其特徵在幹步驟(3)中，所述培育菸草植株的時間為24至69小時，優選為69小時。
4.如權利要求I至3中任一所述的方法，其特徵在於步驟(4)中，所述提取蛋白的方法包括如下步驟將所述菸草葉片進行液氮研磨，然後用蛋白提取液進行提取，得到蛋白粗提液。
5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於所述蛋白提取液為RB溶液；所述RB溶液的pH為7. 8，由溶質和水組成；所述溶質及其濃度如下50mM Tris, 50mM NaCl，10% (體積百分含量)甘油，0.1% (體積百分含量)Tween-20,0. 15% (體積百分含量)P -巰基こ醇，25mM咪唑。
6.如權利要求5所述的方法，其特徵在幹步驟(4)中，所述MYC親和純化包括如下步驟 ①在MYC親和介質中加入所述蛋白粗提液，4°C孵育Ih； ②清洗步驟①的MYC親和介質； ③在步驟②的MYC親和介質中加入MYC肽溶液，4°C孵育10小吋，然後離心取上清，即為含有純化的外源蛋白的溶液。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於步驟②中，用所述RB溶液進行所述清洗；步驟③中，所述MYC肽溶液由MYC肽和所述RB溶液組成，所述MYC肽的濃度為10-100 y g/ml，優選為50 u g/ml o
8.如權利要求I至7中任一所述的方法，其特徵在於所述農桿菌為農桿菌菌株GV3101。
9.如權利要求I至8中任一所述的方法，其特徵在於所述菸草為本生畑。
10.如權利要求I至9中任一所述的方法，其特徵在於所述外源蛋白為序列表的序列2所示的蛋白質；所述外源蛋白的編碼基因優選為序列表的序列3所示的基因。
全文摘要
本發明公開了一種高效表達外源蛋白的方法。本發明將外源蛋白基因克隆到pMYC2載體上，使其與pMYC2載體上的6個MYC標籤的編碼基因形成融合基因，然後利用農桿菌侵染轉化法，在菸草葉片中瞬時高效的表達外源蛋白。然後，根據重組蛋白所帶有的MYC親和標籤，利用帶有相應標籤抗體的親和介質將菸草表達蛋白高效純化，最後再競爭洗脫親和介質最終獲得純化後的目的蛋白。純化後蛋白可用於進一步的生物學功能研究。本發明可實現一步法純化蛋白，簡單快捷，而且蛋白純度較高。利用該方法所獲得的外源重組蛋白可用於生物安全評價和生物功能研究。
文檔編號C12N15/82GK102816758SQ20111015528
公開日2012年12月12日 申請日期2011年6月10日 優先權日2011年6月10日
發明者李海鷗, 閆建斌, 姚瑞楓, 謝道昕, 李素華, 白志燕, 彭文 申請人:清華大學