一種培養cPGCs的完全培養基以及其使用方法與流程
2023-10-09 09:02:49 1
本發明屬於生物技術領域，尤其涉及一種培養cPGCs的完全培養基以及其使用方法。
背景技術：
原始生殖細胞細胞(Primordial Germ Cells,PGCs)是配子的前體並且是繁殖的中心。生殖細胞譜系的精確自我更新是生育和繁殖成功的基礎。在禽類物種中，PGCs在胚胎發生期間比在哺乳動物中更早形成,在雌性中它最終發育為卵細胞,在雄性中最終發育為精子。在胚胎中的遷移途徑—通過血液循環後移植入性腺,使它能成為冷凍保種的目標細胞,同時成為轉基因禽類製備中的良好載體。由於PGCs能夠發育成為有功能的配子,它作為載體攜帶外源基因,製造性腺嵌合體乃至製備轉基因動物,具有較高的研究價值。
目前在雞原始生殖細胞(Chicken Primordial Germ Cells，cPGCs)的培養中大量採用有血清、飼養層培養體系培養，而這種培養體系存在一定的缺陷，如何獲得一種更方便、無不明確物質成分的體外培養方法顯然成為cPGCs培養的關鍵。血清是一種成分極其複雜的外源物質，在實驗和應用中無法確定是血清中何種組分影響了細胞行為。飼養層細胞是指一些特定細胞經有絲分裂阻斷劑處理後得到的細胞單層。目前所採用的飼養層主要有STO細胞株、雞胚胎原代成纖維細胞(PCEF)、性腺基質細胞(SCs)、小鼠胚胎原代成纖維細胞(PMEF)等，均能不同程度促進細胞增殖和分泌白血病抑制因子(LIF)以及產生其他分泌物以抑制其分化。由於這些分泌物質成分尚不清楚，在研究細胞分化的分子機制方面產生一定的幹擾；在基因修飾的研究中，需要通過藥物篩選獲得穩定表達目的基因的cPGCs，通常採用含有抗性基因的飼養層來進行培養篩選，而這種有飼養層體系的培養將實驗複雜化，增加了實驗的操作難度，且藥物篩選後對飼養層造成的破壞也會影響細胞生長；另一方面，這些細胞需要絲裂黴素處理阻斷其有絲分裂後用作飼養層細胞，即使是極其微量的絲裂黴素殘留也會對cPGCs細胞的生長造成影響；非禽類的異源細胞用作飼養層飼養時，也會對cPGCs細胞產生一定的影響；動物源性的血清和飼養層細胞的汙染物會汙染細胞自身的應用。此外，飼養層的使用以及血清的添加也一定程度的延長了實驗的時間，增加了實驗經費的投入。
因此，建立cPGCs無血清、無飼養層培養體系可以為以後在胚胎發育基礎研究、轉基因禽類生產、藥物篩選、家禽育種等方面提供巨大貢獻。
技術實現要素：
本發明克服了現有技術中的缺點，提供了一種培養cPGCs的完全培養基以及其使用方法，其具有成分明確、方便操作、減少汙染、降低成本、避免細胞受損等優勢，應用前景廣闊。
為了解決上述技術問題，本發明是通過以下技術方案實現的：
一種培養cPGCs的完全培養基，包括KO-DMEM、B-27supplement、NAA、nucleosides、GlutaMAX II、β-巰基乙醇、卵清蛋白、OVT、肝素鈉、Activin A、TGF-β1、BMP4、FGF-2、IGF-1。
進一步，以KO-DMEM為基礎培養基，並添加20-30ng/ml的BMP4、20-30ng/ml的TGF-β1、20-30ng/ml的Activin A、5-20ng/ml的OVT、1-5ng/ml的FGF-2。
進一步，以KO-DMEM為基礎培養基，還包括其1-2％的50X B-27supplement、1％的100X NAA、1％的100X nucleosides、2.0mM GlutaMAX II、0.1mMβ-巰基乙醇、1-2％卵清蛋白、0.5％-2％肝素鈉，均為體積比。
進一步，還含有以KO-DMEM為基礎培養基，體積比0.5％-2％的三抗，所述三抗由青黴素、鏈黴素、兩性黴素B組成。
一種培養cPGCs的完全培養基的使用方法，包括以下步驟：
(1)採集的14HH雞胚血液置入含有cPGCs完全培養液的培養體系中培養，原代培養10-15d即可純化細胞；
(2)將純化後cPGCs細胞重新置入cPGCs完全培養基進行體外培養擴增；
(3)對體外培養擴增的cPGCs進行計數、間接免疫螢光檢測，包括SSEA-1和DAZL表面標記。
與現有技術相比，本發明的有益效果是：
(1)本發明打破了有血清、有飼養層的傳統培養方法，培養基的成分明確，便於研究細胞分化的分子機制。
(2)本發明避免了異源細胞作為飼養層後產生的不利影響。
(3)本發明避免了製備飼養層時一些藥物殘留，降低了對細胞的不良影響。
(4)本發明不需要培養飼養層細胞，降低了細胞培養時的汙染風險。
(5)本發明簡化了實驗操作步驟，節省了時間。
(6)本發明一定程度上的降低了實驗開支。
附圖說明
附圖用來提供對本發明的進一步理解，與本發明的實施例一起用於解釋本發明，並不構成對本發明的限制，在附圖中：
圖1是cPGCs在無血清、無飼養層培養條件下的細胞形態圖；
圖2是放大100倍的cPGCs在無血清、無飼養層培養條件下的細胞形態圖；
圖3是放大200倍的cPGCs在無血清、無飼養層培養條件下的細胞形態圖
圖4是無血清、無飼養層培養條件下的cPGCs的生長曲線。
具體實施方式
以下結合附圖對本發明的優選實施例進行說明，應當理解，此處所描述的優選實施例僅用於說明和解釋本發明，並不用於限定本發明。
如圖1至圖4所示，本發明所述一種培養cPGCs的完全培養基以及其使用方法。
一、cPGCs完全培養基的配製
cPGCs完全培養液的配方包括86.9％Ko-DMEM、1％B-27supplement、1％100X NEAA、1％nucleosides、1％肝素鈉、1％OVT、1％TGF-β1、1％GlutaMAX II、1％BMP4、0.1％β-巰基乙醇、1％Activin A、1％IGF-1、1％FGF-2、1％三抗、1％卵清蛋白，均為體積比。
各種因子的添加無嚴格的順序，在常溫操作即可，配製的過程無需加熱，但培養基整個配製過程需在無菌條件下進行。
KO-DMEM：Knock out-DMEM一種胚胎幹細胞培養基，NAA：非必需胺基酸；Nucleosides：核酸；GlutaMAX II：β-穀氨醯胺。
B-27supplement是無血清培養基添加因子，通常用於海馬神經元和其他中樞神經系統(CNS)神經元的生長和保持其短期或長期活性，利於細胞的增值和自我更新；OVT是卵轉鐵蛋白，主要作用為提供細胞生長所需要的營養物質，促進細胞增殖、分化，同時OVT能與Fe3+形成穩定的配合物，清除Fe3+，抑制自由基產生的細胞毒性；肝素鈉，與生長因子協同作用，同時抗凝血；Activin A即激活素A，是轉化生長因子(TGF)β家族的一種分泌蛋白，可控制胚胎軸發育為有功能的前腸源性組織，調解多種細胞的生長和分化；轉化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)是具有多功能生物活性的細胞因子,可調節細胞的增殖、分化、衰老、粘附等；類胰島素生長因子(insulin-like growth factor I，IGF-1)是肝細胞合成和分泌的一種重要生長刺激因子，在細胞增殖、分裂及凋亡過程中發揮重要影響；成纖維細胞生長因子-2((fibroblast growth factor 2，FGF-2)是一個有效的促細胞分裂劑，可增加細胞的體外增殖能力，獲得更多的細胞數量，這種作用在低細胞密度時更明顯，FGF-2也可維持cPGCs的體外多分化潛能；骨形成蛋白4(Bone morphogenetic protein 4，BMP4)是一種多功能的細胞因子，屬於轉化生長因子β(TGF-β)超家族，由早期胚胎外胚層釋放，對生殖細胞的發育和功能發揮起著重要作用。
其中，非必需胺基酸(NAA)、B-27supplement、β-巰基乙醇、肝素鈉、卵轉鐵蛋白(OVT)、卵清蛋白均購自Sigma公司；核苷(Nucleosides)購自Millipore公司；
二、cPGCS的無血清無飼養層培養
(1)胚血注射至含cPGCs無飼養層培養體系的48孔板中，37℃，5％CO2培養箱培養；
(2)培養至第十天，取培養板中的細胞至500μL的離心管中，3000rpm離心5min，棄上清，以去除血細胞，完全培養液重懸細胞至48孔培養板中，37℃，5％CO2培養箱培養。
三、cPGCs的鑑定
1.cPGCs形態觀察
如圖1至3所示，倒置螢光顯微鏡下觀察無飼養層cPGCs，放大100倍、200倍觀察細胞形態。
2.cPGCs的免疫螢光染色鑑定
(1)取第2代的cPGCs，3000rpm離心5min，棄上清，含5％FBS的PBS重懸細胞，3000rpm離心5min，棄上清；
(2)分別加入一抗(鼠抗SSEA-1，1:2000和兔抗DAZL，1：100)，4℃避光過夜，3000rpm離心5min，棄上清，含5％FBS的PBS重懸細胞，3000rpm離心5min，棄上清；
(3)分別加入FITC標記的二抗(羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG，1：500)，37℃避光孵育30min，3000rpm離心5min，棄上清，含5％FBS的PBS重懸細胞，3000rpm離心5min，棄上清；
(4)加入1μg/mL DAPI避光復染5min，3000rpm離心5min，棄上清；加入抗螢光淬滅劑，倒置螢光顯微鏡下觀察染色結果並拍照。
四、cPGCs的生長曲線的繪製
(1)取第2代的cPGCs細胞，(密度為1.0×106個/mL)於24孔板中，置於37.5℃、5％CO2培養箱培養；
(2)每2d抽取3個孔計數，每孔計3次數取平均值，持續11d；繪製生長曲線，橫坐標為培養時間，縱坐標為細胞數，如圖4所示。
最後應說明的是：以上僅為本發明的優選實施例而已，並不用於限制本發明，儘管參照實施例對本發明進行了詳細的說明，對於本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特徵進行等同替換，但是凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。