人臍帶間充質細胞的獲得方法
2023-10-10 00:22:24
專利名稱：人臍帶間充質細胞的獲得方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥技術領域，是一種人臍帶間充質細胞的獲得方法。
背景技術：
間充質幹細胞(MSC)是源自中胚層的一類幹細胞，近些年研究發現MSC具有良好的可塑性和擴增能力，能為病損組織的修復再生提供祖細胞。Arnold1. caplan認為「利用培養法擴增的間充質幹細胞對特定組織進行的大量重建或修復，已經遠遠超出了它們的正常利用和實用範圍。」因此，不同組織來源的間充質幹細胞成為各研究組的研究熱點。臍帶來源的MSC因來源充足且無創性，擴增技術成熟，成為許多研究小組設計大量擴增方案的聚焦點。C6cile DB研究組在培養第3代獲得> 7X IO9個細胞；Fong CY研究組的培養方案臍帶MSC的生產效應是100%，獲得的細胞數約為4 X IO6至5 X IO6個細胞/cm2臍帶；有些研究技術使臍帶的生產效應能達到100%但收穫的細胞數卻只夠或不夠一個病人的治療劑量；有些研究技術臍帶擴增到第3代的細胞數量是最多達7X109，這些擴增方案的細胞收穫量均未突破IO9個細胞。
發明內容
本發明提供了一種人臍帶間充質細胞的獲得方法，克服了上述現有技術之不足，其能有效解決目前獲取人臍帶間充質細胞的方法收穫人臍帶間充質細胞的量過少而造成無法滿足治療劑量的問題。本發明的技術方案是 通過以下措施來實現的一種人臍帶間充質細胞的獲得方法，按下述步驟進行第一步，在無菌條件下人臍帶活組織，洗淨，切碎成組織碎塊；第二步，將組織碎塊放入培養皿中 ，並向其中加入低糖混合培養液，然後將培養皿放入CO2培養箱中進行培養，每3天至4天培養皿換一次低糖混合培養液；第三步，待培養皿中的組織碎塊周邊有梭形細胞爬出時後，將組織碎塊移入新的培養皿中內，並向新的培養皿中加入低糖混合培養液，放入CO2培養箱中繼續進行培養；第四步，反覆重複第三步，直至最後一次轉移的培養皿中的組織碎塊周邊不再有梭形細胞長出。下面是對上述發明技術方案的進一步優化或/和改進
上述CO2培養箱的培養條件可為37°C、3. 6% CO2、飽和溼度。上述第一步中可將活組織洗淨後切碎成2 mm3至3mm3的小塊。上述在第四步之後，可將每次轉移出組織碎塊後的培養皿底粘附的梭形細胞用低糖混合培養液培養，當細胞生長匯合為80%至95%後用胰蛋白酶消化獲得細胞，收集獲得後的細胞，離心，棄上清液，計數細胞，調節細胞濃度按要求密度重新接種入新培養皿中並向其中加入低糖混合培養液，待新培養皿內的細胞生長匯合達80%至95%後繼續按此步驟進行消化。上述胰蛋白酶的濃度可為O. 5g/L至2. 5g/L，其中還添加有O. 53mmol/L的EDTA-Na2O
上述離心條件為轉速可為1000r/min至1500r/min、時間為5min至lOmin。上述進行重新接種時的要求密度可為5 X IO3個細胞/cm2培養皿底面積至10 X IO3個細胞/cm2培養皿底面積。上述低糖混合培養液可為向低糖DMEM培養液中分別加入胎牛血清、L-穀氨醯胺、碳酸氫鈉、L- α -磷酸抗壞血酸和青-鏈黴素溶液形成混合培養液，混合培養液中胎牛血清的體積濃度為15%、L-穀氨醯胺的濃度為2mM、碳酸氫鈉的濃度為10. 2mM、L-α -磷酸抗壞血酸的濃度為50 μ g/mL、青黴素的濃度為100u/ml、鏈黴素的濃度為100ug/ml。本發明利用反覆轉移使臍帶組織中的細胞反覆移出，再將此細胞反覆進行培養，從而達到大量獲得細胞的目的，生產效應在100%的基礎上，提高細胞的收穫量，培養第3代獲得4. 04 X 101°個細胞，培養第6代獲得1. 56 X IO12個細胞，為臨床組織工程和基因治療提供充足的細胞源。
具體實施例方式本發明不受下述實施例的限制，可根據本發明的技術方案與實際情況來確定具體的實施方式。下面結合實施例對本發明作進一步描述
實施例1，該人臍帶間充質細胞的獲得方法按下述步驟進行第一步，在無菌條件下人臍帶活組織，洗淨，切碎成組織碎塊；第二步，將組織碎塊放入培養皿中，並向其中加入低糖混合培養液，然後將培養皿放入CO2培養箱中進行培養，每3天至4天培養皿換一次低糖混合培養液；第三步，待培養皿中的組織碎塊周邊有梭形細胞爬出時後，將組織碎塊移入新的培養皿中內，並向新的培養皿中加入低糖混合培養液，放入CO2培養箱中繼續進行培養；第四步，反覆重複第三步，直至最後一次轉移的培養皿中的組織碎塊周邊不再有梭形細胞長出。可根據實際需要，對上述人臍帶間充質細胞的獲得方法作進一步優化或/和改進
實施例2，作為上述實施例的優選，CO2培養箱的培養條件為37°C、3. 6% CO2、飽和溼度。3. 6% CO2中的百分數為體積百分數。實施例3，作為上述實施例的優選，第一步中將活組織洗淨後切碎成2 mm3至3mm3的小塊。實施例4，與上述實施例的不同之處在於，在第四步之後，將每次轉移出組織碎塊後的培養皿底粘附的梭形細胞用低糖混合培養液培養，當細胞生長匯合為80%至95%後用胰蛋白酶消化獲得細胞，收集獲得後的細胞，離心，棄上清液，計數細胞，調節細胞濃度按要求密度重新接種入新培養皿中並向其中加入低糖混合培養液，待新培養皿內的細胞生長匯合達80%至95%後繼續按此步驟進行消化。80%和95%分別為匯合生長後細胞總面積佔培養皿底面積的百分數。實施例5，作為上述實施例的優選，胰蛋白酶的濃度為O. 5g/L至2. 5g/L，其中還添加有 O. 53mmol/L 的 EDTA-Na2。實施例6,作為上述實施例的 優選,離心條件為轉速為1000r/min至1500r/min、時間為 5min 至 IOmin。
實施例7，作為上述實施例的優選，進行重新接種時的要求密度為5X103個細胞/cm2培養皿底面積至IOX IO3個細胞/cm2培養皿底面積。實施例8，作為上述實施例的優選，低糖混合培養液為向低糖DMEM培養液中分別加入胎牛血清、L-穀氨醯胺、碳酸氫鈉、L- α -磷酸抗壞血酸和青-鏈黴素溶液形成混合培養液，混合培養液中胎牛血清的體積濃度為15%、L-穀氨醯胺的濃度為2mM、碳酸氫鈉的濃度為10. 2mM、L-α -磷酸抗壞血酸的濃度為50 μ g/mL、青黴素的濃度為100u/ml、鏈黴素的濃度為100ug/ml。實施例9，一種人臍帶間充質細胞的獲得方法按下述步驟進行第一步，無菌條件下將人臍帶活組織切碎成2 mm3至3mm3的組織碎塊；第二步，將組織碎塊加入低糖混合培養液中，置入37°C、3. 6%C02培養箱中培養，每3天至4天培養皿換一次低糖混合培養液；第三步，培養15天至20天後見組織碎塊周邊有細胞移出，並生長為梭形細胞時將組織碎塊移入新培養皿中，新培養皿中加入半量新的低糖混合培養液對組織碎塊繼續培養，3天至5天後組織碎塊周邊又有移出細胞長成梭形；第四步，此時將組織碎塊再次移入新的培養皿中，組織塊反覆轉移至少可達20次以上，直至培養的組織塊周邊不再有梭形細胞長成；第五步，轉移出組織碎塊的培養皿加入半量新的低糖混合培養液對細胞繼續培養，當細胞培養至80%至95%並成漩渦狀時，用胰蛋白酶消化細胞，將收穫細胞計數後按8X IO3/ cm2進行分皿接種，為培養的第一代細胞，按此進行反覆消化、分皿接種和培養，每輪細胞培養至第3代至6代。3. 6% CO2中的百分數為體積百分數,80%和95%分別為匯合生長後細胞總面積佔培養皿底面積的百 分數。
權利要求
1.一種人臍帶間充質細胞的獲得方法，其特徵在於按下述步驟進行 第一歩，在無菌條件下人臍帶活組織，洗浄，切碎成組織碎塊； 第二步，將組織碎塊放入培養皿中，並向其中加入低糖混合培養液，然後將培養皿放入CO2培養箱中進行培養，每3天至4天培養皿換一次低糖混合培養液； 第三步，待培養皿中的組織碎塊周邊有梭形細胞爬出時後，將組織碎塊移入新的培養皿中內，並向新的培養皿中加入低糖混合培養液，放入CO2培養箱中繼續進行培養； 第四步，反覆重複第三步，直至最後一次轉移的培養皿中的組織碎塊周邊不再有梭形細胞長出。
2.根據權利要求1所述的人臍帶間充質細胞的獲得方法，其特徵在於CO2培養箱的培養條件為37°C、3. 6% CO2、飽和溼度。
3.根據權利要求1或2所述的人臍帶間充質細胞的獲得方法，其特徵在於第一歩中將活組織洗浄後切碎成2 mm3至3mm3的小塊。
4.根據權利要求1或2或3所述的人臍帶間充質細胞的獲得方法，其特徵在於在第四步之後，將每次轉移出組織碎塊後的培養皿底粘附的梭形細胞用低糖混合培養液培養，當細胞生長匯合為80%至95%後用胰蛋白酶消化獲得細胞，收集獲得後的細胞，離心，棄上清液，計數細胞，調節細胞濃度按要求密度重新接種入新培養皿中井向其中加入低糖混合培養液，待新培養皿內的細胞生長匯合達80%至95%後繼續按此步驟進行消化。
5.根據權利要求4所述的人臍帶間充質細胞的獲得方法，其特徵在於胰蛋白酶的濃度為 0. 5g/L 至 2. 5g/L，其中還添加有 0. 53mmol/L 的 EDTA-Na^
6.根據權利要求4或5所述的人臍帶間充質細胞的獲得方法，其特徵在於離心條件為轉速為 1000r/min 至 1500r/min、時間為 5min 至 lOmin。
7.根據權利要求4或5或6所述的人臍帶間充質細胞的獲得方法，其特徵在於進行重新接種時的要求密度為5 X IO3個細胞/cm2培養皿底面積至IOX IO3個細胞/cm2培養皿底面積。
8.根據權利要求1或2或3或4或5或6或7所述的人臍帶間充質細胞的獲得方法，其特徵在於低糖混合培養液為向低糖DMEM培養液中分別加入胎牛血清、L-穀氨醯胺、碳酸氫鈉、L- a -磷酸抗壞血酸和青-鏈黴素溶液形成混合培養液，混合培養液中胎牛血清的體積濃度為15%、L-穀氨醯胺的濃度為2mM、碳酸氫鈉的濃度為10. 2mM、L-a -磷酸抗壞血酸的濃度為50 ii g/mL、青黴素的濃度為100u/ml、鏈黴素的濃度為100ug/ml。
全文摘要
本發明涉及生物醫藥技術領域，是一種人臍帶間充質細胞的獲得方法，一種人臍帶間充質細胞的獲得方法，按下述步驟進行第一步，在無菌條件下人臍帶活組織，洗淨，切碎成組織碎塊；第二步，將組織碎塊放入培養皿中，並向其中加入低糖混合培養液，然後將培養皿放入CO2培養箱中進行培養，每3天至4天培養皿換一次低糖混合培養液。本發明利用反覆轉移使臍帶組織中的細胞反覆移出，再將此細胞反覆進行培養，從而達到大量獲得細胞的目的，生產效應在100%的基礎上，提高細胞的收穫量，培養第3代獲得4.04×1010個細胞，培養第6代獲得1.56×1012個細胞，為臨床組織工程和基因治療提供充足的細胞源。
文檔編號C12N5/077GK103045537SQ20121053117
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月11日 優先權日2012年12月11日
發明者溫浩, 江明, 馬豔, 盧曉梅, 朱啟英, 畢曉娟, 段顯琳 申請人:新疆醫科大學第一附屬醫院