一種用dna標記快速提高邊雞產蛋數的方法
2023-10-17 19:33:59 2
專利名稱：一種用dna標記快速提高邊雞產蛋數的方法
技術領域：
本發明涉及生物工程領域，具體涉及一種用DNA標記快速提高邊雞產蛋數的方法。
背景技術：
傳統的數量遺傳學對數量性狀遺傳機制的理解建立在抽象的微效多基因假設基礎上，將影響一個數量性狀的所有基因當作一個整體來處理，而不考慮其中的各個基因是如何作用的。這一假說在多年的動植物育種中發揮了重要作用，推動了動植物育種工作的進展，在當時的理論和技術條件下不失為一個很好的基礎。但這一假說不了解數量性狀的遺傳背景，不了解控制數量性狀的基因在染色體上的位置及其傳遞規律，無法對其效應作出準確的估計，更不能從分子水平分離和定位該類基因。隨著現代分子生物學技術的飛速發展，遺傳學家和育種學家認識到控制數量性狀的基因並非在基因組中隨機分布，且存在影響數量性狀的主效基因。目前，在育種中對雞產蛋數的篩選方法主要是通過數量遺傳學方法，而數量遺傳學方法進展緩慢，尋找到合適的DNA標記用於輔助選擇能增強選擇的準確性、縮短世代間隔，加快遺傳進展。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種用DNA標記快速提高邊雞產蛋數的方法，該方法利用雞m^i酶切圖譜對邊雞產蛋數進行標記輔助選擇，不受環境影響。本發明的原理是DNA池測序發現邊雞MSTN基因外顯子1的234bp處存在一個 G-A突變，DNAMAN 5. 22軟體分析表明該位點為KdvI識別位點。針對該酶切位點設計特異性引物擴增邊雞基因組DNA，引物的擴增產物經m^vl酶切產生3種基因型(GG、GA和AA)。 該單核苷酸突變能穩定遺傳，選擇的檢測方法簡單快捷，且不受外界環境的影響，可以用於邊雞產蛋數選擇的分子遺傳標記，進行標記輔助選擇。本發明所說的方法是提取待測樣本的雞基因組DNA，經特異性引物(SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2)擴增得到162bp的目的片段，目的片段經限制性內切酶^vI酶切，凝膠電泳後用銀染顯色，得到DNA的酶切圖譜，根據圖譜中條帶的數量和大小對待測樣本產蛋數的多少進行判斷。所述根據圖譜中條帶的數量和大小對待測樣本產蛋數的多少進行判斷的方法是 僅有162bp條帶的為產蛋數的多的純合型樣本，僅有127bp條帶的為產蛋數的少的純合型樣本；同時含有162bp和127bp條帶的為產蛋數的多的雜合型樣本。本發明是提供了邊雞MSTN基因在邊雞育種篩選中作為產蛋數選擇的分子遺傳標記的應用。所述分子遺傳標記在應用於育種篩選時，選擇MSTN基因中不含m^vl酶切位點的個體，即產蛋數多的純合型樣本(AA型)。
圖1是PCR產物圖，Marker為GM331。( 1_8泳道為8個不同邊雞個體的PCR產物) 圖2是BbvI酶切產物圖，Marker為GM331。
具體實施例方式實施例1
1.試驗材料
118隻一世代的邊雞母雞血樣採自山西省農科院畜牧獸醫研究所。採取的邊雞群體來自同一批次，單籠飼養，管理和營養水平一致。用肝素鈉作為抗凝劑，從翅靜脈採集血樣0. 5 mL,採用常規苯酚-氯仿法抽提基因組DNA，測定DNA的濃度後備用。2.引物設計和PCR擴增 2.1酶切引物的設計
根據GenBank中雞MSTN基因序列(GenBank登錄號為AF346599)針對外顯子1的KdvI 位點設計1對引物，擴增產物大小為162 bp。引物序列如下 Pl :F: 5，-GCATTAGCAGGGACGTTAT-3，； (SEQ ID NO 1) R:5，-ACTCCGTAGGCATTGTGAT-3，(SEQ ID NO :2)
2.2 PCR擴增
PCR擴增反應為25 PL體系，包括上、下遊引物(10 Mmol/L)2 μ ；dNTPs (2 mmol/L) 2.5 μ ；Taq DNA 聚合酶(5 U/^L)0. 2 PL;DNA 模板(50 ng/^L)2 μ ；Mg2+ (25 mmol/L)l. 5 μ ； 10 XPCR緩衝液2. 5 μ ；超純水14. 3 μ 。PCR擴增反應程序94°C變性6 min ；94°C變性30 s，56°C復性30 s，72°C延伸30 s，進行30個循環；最後72°C延伸10 min ;10°C保存。PCR反應完成後，用交聯度為(Acr:BiS)39:l的10%的非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測擴增結果(圖1)，硝酸銀染色，UV凝膠成像系統進行凝膠成像。2. 3 PCR-RFLP 檢測
PCR產物用m^vl酶切，以檢測多態性。酶切反應總體積為20 yL，超純水16.5 μ L, BbvI 酶(10 u/μ L) 0.5 μ L,10Xbuffer 2 yL，37° C 酶切 2 h，酶切產物用交聯度為 (Acr:Bii029:l的10%的非變性聚丙烯醯胺凝膠檢測，200V電泳5 h，硝酸銀染色。酶切圖譜如圖2所示，顯示3種基因型，僅有162bp目的片段的樣本不含rn^vl酶切位點，命名為AA 型；僅有127bp的為含有rn^vl酶切位點的純合型，命名為GG型；同時含有162bp和127bp 的為含有KdvI酶切位點的雜合型樣本，命名為GA型。GG和AA相比在外顯子1編碼區的 234 bp (C. 234 bp)處有一個G — A的突變。當C. 234 bp處為G時，BbvI酶切產生127 bp 和35 bp的片段；當C. 234 bp處為A時，無KdvI酶切位點。在凝膠檢測時，有酶切位點的樣本產生的35bp的片段由於長度太小，跑出了凝膠，所以在凝膠中未顯示出條帶。根據酶切圖譜中條帶的數量和大小辨別引物的擴增產物中是否有m^i酶切位點。2. 4 MSTN基因KdvI位點不同基因型與邊雞繁殖性狀的關聯分析
運用下列模型比較邊雞繁殖性狀在MSTN各基因型之間的差異yijk = μ+ Gi +Sj+ e 模型中yijk為性狀的測定值；μ為群體平均值^為基因型效應而為家系效應；e為隨機殘差。不同基因型對邊雞母雞繁殖性狀的關聯分析見表1。由表可見，GG基因型個體的開產日齡極顯著的高於GA和AA基因型個體(P<0. 01);AA基因型個體的300日齡產蛋數極顯著的高於GG基因型個體(P<0.01)，GA基因型個體的300日齡產蛋數顯著的高於GG基因型個體(P<0.01)。在育種篩選中只選擇AA型(即不含m^vl酶切位點的MSTN基因)可以在群體中固定該基因型。所以PCR產物能否被rn^vi酶切開可作為篩選邊雞產蛋數的方法。
表1不同基因型對邊雞母雞繁殖性狀的關聯分析
權利要求
1.邊雞MSTN基因在邊雞育種篩選中作為產蛋數選擇的分子遺傳標記的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於所述分子遺傳標記在應用於育種篩選時， 選擇MSTN基因中不含rn^vi酶切位點的個體，即產蛋數多的純合型樣本。
3.—種用DNA標記快速提高邊雞產蛋數的方法，其特徵在於提取待測樣本的雞基因組DNA JSSEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的特異性引物擴增得到162bp目的片段，目的片段經限制性內切酶rn^vl酶切，凝膠電泳後用銀染顯色，得到DNA的酶切圖譜，根據圖譜中條帶的數量和大小對待測樣本產蛋數的多少進行判斷。
4.根據權利要求2所述用DNA標記快速提高邊雞產蛋數的方法，其特徵在於所述根據圖譜中條帶的數量和大小對待測樣本產蛋數的多少進行判斷的方法是僅有162bp條帶的為產蛋數的純合型樣本，僅有127bp條帶的為產蛋數的少的純合型樣本；同時含有162bp和 127bp條帶的為產蛋數多的雜合型樣本。
全文摘要
本發明涉及家禽育種領域，具體涉及一種用DNA分子標記篩選邊雞產蛋數的方法。所述方法是提取待測樣本的雞基因組DNA，經特異性引物擴增得到MSTN基因目的片段，目的片段經限制性內切酶BbvI酶切，凝膠電泳後用銀染顯色，得到DNA的酶切圖譜，根據圖譜中條帶的數量和大小對待測樣本產蛋數進行判斷。本發明選擇的檢測方法簡單快捷，且不受外界環境的影響，可以用於邊雞產蛋數的分子遺傳標記，進行標記輔助選擇。
文檔編號C12Q1/68GK102352410SQ201110293169
公開日2012年2月15日 申請日期2011年10月7日 優先權日2011年10月7日
發明者丁馥香, 張麗, 張李俊, 張跟喜, 戴國俊, 王金玉, 謝愷舟, 趙秀華 申請人:揚州大學