一種豬圓環病毒2型表位肽疫苗及其製備方法

2023-10-11 14:52:44

一種豬圓環病毒2型表位肽疫苗及其製備方法
【專利摘要】本發明涉及一種豬圓環病毒2型表位肽疫苗及其製備方法。該疫苗含有三種B細胞表位，其賴氨酸為核心基質構建表位單體相同的四分支肽，並串聯一個通用T輔助細胞（Th）表位，分子量為13kDa，該表位肽命名為PCVCP98-156-228；該疫苗免疫小鼠後產生較強的免疫應答，產生高效價的病毒中和性抗體。本發明的表位肽疫苗具有價廉、安全、特異性強、容易保存和應用的優點，將在防控豬圓環病毒病發揮重要作用。本發明方法通過表位肽的預測、篩選，表位肽疫苗的設計，表位肽的合成、純化及鑑定，以及表位肽疫苗的製備四個步驟製備出一種豬圓環病毒2型（PCV2）表位肽疫苗，該方法原料易得、成本較低、容易控制，具有較好的操作性，適應推廣應用。
【專利說明】一種豬圓環病毒2型表位肽疫苗及其製備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於獸藥生物【技術領域】，具體涉及一種豬圓環病毒2型(PCV2)表位肽疫苗及其製備方法。[0002]
【背景技術】
[0003]1、豬圓環病毒病已成為當前生豬的三大主要疫病之一:
豬圓環病毒2型(porcine circovirus type 2, PCV2)是引起斷奶仔豬多系統衰竭症候群(post-weaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)的重要病原，該病於 1997年在加拿大西部首次被證實，相繼北美、歐洲及亞洲多數國家均有本病流行的報導。PCV2還與其他幾種疾病有關，如豬皮炎與腎病症候群(TONS)、豬呼吸道疾病症候群(PRDC)、豬先天性振顫、母豬繁殖障礙、豬增生性和壞死性肺炎等，目前將與PCV2感染有關的疾病統稱為豬圓環病毒病(porcine circovirus associated disease,PCVD)。感染 PCV2 的豬可導致淋巴系統損傷和免疫缺陷，引起機體抵抗力下降，使感染豬對其他病原的易感性增高，造成多種疾病的並發或繼發感染，對養豬業造成了極大的危害。2008年第20屆國際豬病大會上，人們將其列為當前危害養豬業發展的頭號疫病。PCVAD被世界各國的獸醫與養豬業者公認為是繼豬瘟和豬繁殖與呼吸症候群(PRRS)之後新發現的最重要的豬傳染病。
[0004]PCV2還與其他幾種疾病有關，如豬皮炎與腎病症候群(PDNS)、豬呼吸道疾病症候群(PRDC)、豬先天性振顫、母豬繁殖障礙、豬增生性和壞死性肺炎等，目前將與PCV2感染有關的疾病統稱為豬圓環病毒病(porcine circovirus associated disease, PCVD)。感染PCV2的豬可導致淋巴系統損傷和免疫缺陷，引起機體抵抗力下降，使感染豬對其他病原的易感性增高，造成多種疾病的並發或繼發感染，對養豬業造成巨大的經濟損失。
[0005]2、豬圓環病毒 2 型(porcine circovirus type 2, PCV2)疫苗研究現狀:
PCV2每年給養豬業造成巨大的經濟損失，但是尚無有效的治療方法，而疫苗免疫是控制該病的有效途徑，國內外研究者都在該病的疫苗研製上投入了大量工作，但由於病毒增殖緩慢、無CPE出現，PCVl和PCV2往往混合存在，因此其分離培養較困難，難以大量獲得純病毒，造成了全病毒苗難以開發。而新型亞單位疫苗因結構單一，不用病毒培養而具有成本低、靶向明確和安全穩定的特點成為當前PCV疫苗研究的重點。PCV2的0RF2基因編碼的Cap蛋白具有良好的免疫原性，免疫動物後能產生較好的中和抗體，證明了其應用於亞單位疫苗研製的價值。國外學者把0RF2片段插入到昆蟲杆狀病毒中，研製了具有免疫原性的重組蛋白苗，目前已投入使用，但是由於其工藝要求高，相應的佐劑昂貴，在我國難以推廣使用。目前，國內已有商品化PCV2全病毒滅活疫苗上市，申請號(ZL200810024423.1)。但滅活疫苗所提供的免疫力較弱，為完成全程免疫，需要進行多次接種，免疫劑量大，生產成本高；而且滅活疫苗中含有大量非保護性抗原成分，副作用較大並存在病毒滅活不充分帶來的風險。而國外已有4種PCV疫苗投入使用，兩種滅活苗和兩種重組苗，梅裡亞和英特威的需要免疫兩次，柏林格和富道的需要免疫一次，但目前為止，僅柏林格在中國成功註冊銷售，價格為每頭份30元，部分豬還需要加強免疫一次，所以其昂貴的價格大大增加了養豬成本，嚴重限制了其應用。美國聯合生物醫學公司已開展PCV2亞單位疫苗的研究，在多個實施方案中，此肽抗原包括衣殼蛋白從約第47位胺基酸至第202位胺基酸的胺基酸。選擇的肽鏈較長，合成成本較高，且尚屬於研究初級階段，申請的專利尚未授權(專利受理號201080068977.7)。
[0006]表位是蛋白質抗原性的基礎，正確而詳細地繪製蛋白質表位圖譜(包括抗原限制成分位)對疾病的診斷及預後判定、設計疫苗分子結構及免疫幹預治療等至關重要。根據B細胞表位的特徵，先預測抗原表位，再合成肽段，在實驗中驗證，是一種省時、省力和經濟的方法。目前，口蹄疫作為第一個獸用多肽疫苗已批准上市，開始廣泛應用，並取得了較好的免疫效果，顯示了多肽疫苗在動物疫病的防控方面具有極大的潛力。PCV2每年給養豬業造成巨大的經濟損失，但是尚無有效的治療方法，而疫苗免疫是控制該病的有效途徑，國內外研究者都在該病的疫苗研製上投入了大量工作，但由於病毒增殖緩慢、無CPE (細胞病變)出現，PCVl和PCV2往往混合存在，因此其分離培養較困難，難以大量獲得純病毒，造成了全病毒苗難以開發。而新型亞單位疫苗因結構單一，不用病毒培養而具有成本低、靶向明確和安全穩定的特點成為當前PCV疫苗研究的重點。PCV2的0RF2基因編碼的Cap蛋白具有良好的免疫原性，免疫動物後能產生較好的中和抗體，證明了其應用於亞單位疫苗研製的價值。國外學者把0RF2片段插入到昆蟲杆狀病毒中，研製了具有免疫原性的重組蛋白苗，目前已投入使用，但是由於其工藝要求高，相應的佐劑昂貴，在我國難以推廣使用。
[0007]

【發明內容】

[0008]針對目前 國產上市的全病毒滅活疫苗有一定的保護作用，但副作用大、安全性差的問題，以及進口的重組亞單位疫苗和嵌合病毒滅活疫苗，免疫原性較好、但價格昂貴的問題，本發明的目的是提供一種具有價廉、安全、特異性強、容易保存和應用安全的豬圓環病毒2型(PCV2)表位肽疫苗。
[0009]本發明還提供所述豬圓環病毒2型(PCV2)表位肽疫苗的製備方法。
[0010]實現上述目的，本發明採用如下技術方案:一種豬圓環病毒2型表位肽疫苗，其特徵在於，該疫苗含有三種B細胞表位，其賴氨酸為核心基質構建表位單體相同的四分支肽，並串聯一個通用T輔助細胞(Th)表位，分子量為13 kDa，該表位肽命名為PCV CP98_156_228 ;
所述三種B細胞表位具體胺基酸序列如下:B98 IRKVKV7B156 YHSRYFT, B228 DPPLNP ； 所述表位肽結構如下:
IRKVKVGGG'fHSRYFTGGGDPPLNP ,
lRKVVWi3GGYHSRYFTOGGDPPLNP ,."
lRKVKVi3GGYHSRYFTGGGDPPLNP \ ,> K"KKJ SlSElKGVfVHKlEGlLf





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tRKVKV6i3GYHSRYfT6GGDPPLNP ,
進一步，所述豬圓環病毒2型表位肽疫苗的製備方法，包括如下步驟:
O表位肽的預測、篩選:選用PCV2b (國內90%PMWS豬群均因PCV2b感染)CAP蛋白作為候選抗原，對其胺基酸序列採用BcePred和DNAStar軟體進行B細胞表位預測；結合PCV2b CAP B細胞表位，篩選出3種抗原指數較高的表位，即98-103aa(命名為B98)，156_162aa(命名為B156)，228-233aa(命名為B228) ;3種表位具體胺基酸序列如下:B98 IRKVKVjB156 YHSRYFT, B228DPPLNP ；
2)表位肽疫苗的設計:
以步驟I)所選序列為基礎，賴氨酸為核心基質構建表位單體相同的四分支肽，同時串聯一個通用型Th表位，該表位肽命名為PCVCP98_156_228，結構式如上；
3)多肽的合成、純化及鑑定:
用多功能多肽合成儀分別合成表位肽PCV CP98_156_228，對其進行質譜(MS)檢測，高效液相色譜(HPLC)檢測純度；
4)表位肽疫苗的製備:
首先，將上述步驟3)合成的表位肽PCV 0?98_156_228用0.01M，pH7.4 PBS (磷酸鹽緩衝液)稀釋到100ug/ml,過濾,製得水相；
然後，選擇油乳劑在121°C下滅菌15min得到油相；所述油乳劑為Span-80, Tween-80或Arlacel-80中的一種；
再之，在乳化器中加入油相，在80-100r/min下攪拌2min後，加入同等質量的水相採用8500r/min的速度攪拌6min，製得油包水乳劑；
最後，將所得油包水乳劑在無菌條件下定量分裝，得豬圓環病毒2型表位肽疫苗成品。
[0011]進一步，步驟3)中，(I)表位肽的合成具體步驟為:
①選擇RinkAmide-AM Resin樹脂作為載體,與表位肽C段胺基酸相連接,合成方向是C端向N端延伸；
②將步驟①中與樹脂載體相連的胺基酸脫除Fmoc保護基團，裸露出活性氨基，與下一個胺基酸相連接；
③游離出的COOH(保護胺基酸原料中本身存在的)進行活化後與步驟②中的裸露氨基相交聯；
④將步驟②步驟③循環進行，直至指定表位肽序列合成片段為全保護的KKISISEIKGVIVHKIEGILF-樹脂，再連接下一個胺基酸原料Fmoc-Lys (Dde) -OH,形成Fmoc-Lys (Dde) - KKISISEIKGVIVHKIEGILF-樹脂；
⑤用20%哌啶脫除步驟④得到的表位肽中的Fmoc基團，用含2%水合肼的DMF脫除其Dde基團，得到主鏈和側鏈氨基；
游離的氨基與下一個Fmoc-Lys (Dde) -OH的C端羧基進行偶聯；
⑥偶聯完畢後，重複脫除Fmoc和Dde的步驟，得到全保護的肽樹脂；
⑦加入保護性胺基酸，進入「偶聯-去保護-偶聯」循環步驟，得到最終的全保護多肽；
⑧將多肽從載體上洗脫下來，三氟乙酸(TFA)脫除保護基；
⑨以乙醚將多肽從TFA中析出，清洗，形成固體相粗品表位肽；
(2)表位肽的純化、鑑定:
①將步驟(1)，即上面的整個反應步驟①-⑨，得到的粗表位肽進行質譜檢測，並採用反相液相色譜進行純化；②將質譜與反相液相色譜聯合使用，對粗表位肽進行純化；
③將液相色譜中純化的目標峰放置於凍幹機中凍幹；
④凍幹後的產品再次採用質譜檢測確認是否正確，用液相色譜進行純度檢測。
[0012]相比現有技術，本發明具有如下優點:
1、本發明豬圓環病毒2型表位肽疫苗，包含有三種B細胞表位，用MAP (Multipleantigenic peptide system,多重抗原肽結構)連接4個分支，並串聯有一個通用性Th表位，分子量為13 kDa，使用固相自動肽合成儀化學合成表位肽。PCV2表位肽疫苗主要由I份多肽和1份弗氏佐劑組成。該疫苗免疫小鼠後產生較強的免疫應答，產生高效價的病毒中和性抗體。本發明的表位肽疫苗具有價廉、安全、特異性強、容易保存和應用的優點，將在防控豬圓環病毒病發揮重要作用。
[0013]2、由於PCV2 0RF2編碼的CAP蛋白，是PCV2的主要結構蛋白，具有較好的免疫原性，PCV2 CAP蛋白免疫動物後能產生較好的中和抗體，所以本發明豬圓環病毒2型表位肽疫苗以PCV2 CAP蛋白的胺基酸序列為基礎，採用Kyte- Doolittle的親水性方案，Emini方案,Karplus方案和Jameson-wolf抗原指數方案，輔以對CAP蛋白的二級結構柔性區域分析，並結合吳玉章胺基酸抗原指數計算方法預測CAP蛋白的B細胞表位，其預測結果的可靠性高。[0014]3、本發明方法通過表位肽的預測、篩選，表位肽疫苗的設計，多肽的合成、純化及鑑定，以及表位肽疫苗的製備四個步驟製備出一種豬圓環病毒2型(PCV2)表位肽疫苗，該方法原料易得、成本較低、容易控制，具有較好的操作性，適應推廣應用。
[0015]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為本發明豬圓環病毒2型表位肽疫苗中MAP結構示意圖。
[0017]圖2為本發明豬圓環病毒2型表位肽疫苗PCV2 CAP蛋白的胺基酸序列。
[0018]圖3為圖2中CAP蛋白的親水性分析，按Kyte-Doolittle的胺基酸親水性標準分析PCV2病毒CAP蛋白分子的親水性區域。
[0019]圖4為圖2中CAP蛋白的表面可能性區域，按Emini方案預測CAP蛋白胺基酸殘基位於蛋白質的表面可能性。
[0020]圖5為圖2中CAP蛋白的抗原指數，按Jameson-wolf方案預測CAP蛋白序列中抗原指數較高的區段。
[0021]
【具體實施方式】
[0022]下面結合實施例和附圖對本發明作進一步詳細說明。
[0023]一、豬圓環病毒2型CAP蛋白B細胞表位預測與分析:
PCV2 0RF2是編碼病毒主要結構蛋白-Cap蛋白的基因，該蛋白具有良好的抗原性，可引起感染豬產生很高的抗體水平，可以作為疫苗候選抗原。本發明選用PCV2b (國內90%PMWS豬群均因PCV2b感染)CAP蛋白作為候選抗原，對其胺基酸序列進行B細胞表位預測分析。[0024]PCV2 CAP蛋白的胺基酸序如下(由基因組序列推導)共有233個胺基酸殘基，檢索自 GenBank,序列編號為 AAF35305.1。
[0025]I MTYPRRRYRR RRHRPRSHLG QILRRRPffLV HPRHRVRffRR KNGIFNTRLS RTFGVTVKRT
61 TVRTPSffAVD MMRFNINDFL PPGGGSNPRS VPFEYYRIRK VKVEFffPCSP ITQQDRQVQS
121 SAVILDDNFV TKATALTYDP YVNYSSRHTI TQPFSYHSRY FTPKPVLDST IDYFQPNNKR
181 NQLffLRLQTA GNVDHVGLGT AFENSIYDQE YNIRVTMYYQ FREFNFKDPP LNP
基於PCV2 CAP蛋白的胺基酸序列，按Kyte-Doolittle的胺基酸親水性標準分析PCV2病毒CAP蛋白分子的親水性區域，預測結果見圖1。按Emini方案預測CAP蛋白胺基酸殘基位於蛋白質的表面可能性，預測結果見圖2。以及按Jameson-wolf方案預測CAP蛋白序列中抗原指數較高的區段，預測結果圖3。經抗原指數，親水性指數和蛋白質表面可能性指數篩選出的胺基酸區段中(抗原指數> 0，親水性指數> O,以及胺基酸的表面可能性指數^ I)，如果其內部或附近具有柔性結構，則較有可能是B細胞表位。綜合分析以上預測結果，CAP蛋白較有可能為B細胞表位的區段位於N端第4-18，23-28，32-41，57-64，85-90，96-103，156-163，175-182，205-212 區段和第 224-233 區段。結果參見表 I。
[0026]表1 PCV2 CAP蛋白的B細胞表位區域的平均抗原性指數
【權利要求】
1.一種豬圓環病毒2型表位肽疫苗，其特徵在於，該疫苗含有三種B細胞表位，其賴氨酸為核心基質構建表位單體相同的四分支肽，並串聯一個通用T輔助細胞(Th)表位，分子量為13 kDa，該表位肽命名為PCV CP98_156_228 ； 所述三種B細胞表位具體胺基酸序列如下:B98 IRKVKV7B156 YHSRYFT，B228 DPPLNP ； 所述表位肽結構如下:
2.如權利要求1所述豬圓環病毒2型表位肽疫苗的製備方法，其特徵在於，包括如下步驟: O表位肽的預測、篩選: 選用PCV2b CAP蛋白作為候選抗原，對其胺基酸序列採用BcePred和DNAStar軟體進行B細胞表位預測；結合PCV2b CAP B細胞表位，篩選出3種抗原指數較高的表位，即98-103aa(命名為 B98), 1 56_162aa(命名為 B156)，228_233aa (命名為 B228) ;3 種表位具體胺基酸序列如下:B98 IRKVKV, B156 YHSRYFT, B228 DPPLNP ； 2)表位肽疫苗的設計: 以步驟I)所選序列為基礎，賴氨酸為核心基質構建表位單體相同的四分支肽，同時串聯一個通用型Th表位，該表位肽命名為PCVCP98_156_228，結構式如上； 3)多肽的合成、純化及鑑定: 用多功能多肽合成儀分別合成表位肽PCV CP98_156_228，對其進行質譜檢測，高效液相色譜檢測純度； 4)表位肽疫苗的製備: 首先，將上述步驟3)合成的表位肽PCV CP98_156_228用0.01M, pH7.4 PBS稀釋到IOOug/ml，過濾，製得水相； 然後，選擇油乳劑在121°C下滅菌15min得到油相；所述油乳劑為Span-80, Tween-80或Arlacel-80中的一種； 再之，在乳化器中加入油相，在80-100r/min下攪拌2min後，加入同等質量的水相採用8500r/min的速度攪拌6min，製得油包水乳劑； 最後，將所得油包水乳劑在無菌條件下定量分裝，得豬圓環病毒2型表位肽疫苗成品。
3.根據權利要求1所述豬圓環病毒2型表位肽疫苗的製備方法，其特徵在於，步驟3)中，(I)表位肽的合成具體步驟為: ①選擇RinkAmide-AM Resin樹脂作為載體,與表位肽C段胺基酸相連接,合成方向是C端向N端延伸； ②將步驟①中與樹脂載體相連的胺基酸脫除Fmoc保護基團，裸露出活性氨基，與下一個胺基酸相連接；③游離出的COOH進行活化後與步驟②中的裸露氨基相交聯； ④將步驟②步驟③循環進行，直至指定表位肽序列合成片段為全保護的KKISISEIKGVIVHKIEGILF-樹脂，再連接下一個胺基酸原料Fmoc-Lys (Dde) -0H,形成Fmoc-Lys (Dde) - KKISISEIKGVIVHKIEGILF-樹脂； ⑤用20%哌啶脫除步驟④得到的表位肽中的Fmoc基團，用含2%水合肼的DMF脫除其Dde基團，得到主鏈和側鏈氨基； 游離的氨基與下一個Fmoc-Lys (Dde) -OH的C端羧基進行偶聯； ⑥偶聯完畢後，重複脫除Fmoc和Dde的步驟，得到全保護的肽樹脂； ⑦加入保護性胺基酸，進入「偶聯-去保護-偶聯」循環步驟，得到最終的全保護多肽； ⑧將多肽從載體上洗脫下來，三氟乙酸(TFA)脫除保護基； ⑨以乙醚將多肽從TFA中析出，清洗，形成固體相粗品表位肽； (2)表位肽的純化、鑑定: ①將步驟(1)，即上面的整個反應步驟①-⑨，得到的粗表位肽進行質譜檢測，並採用反相液相色譜進行純化； ②將質譜與反相液相色譜聯合使用，對粗表位肽進行純化； ③將液相色譜中純化的目標峰放置於凍幹機中凍幹； ④凍幹後的產品再次採用質譜檢測確認是否正確，用液相色譜進行純度檢測。
【文檔編號】C07K1/04GK103536912SQ201310457212
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年9月30日 優先權日:2013年9月30日
【發明者】吳勝昔, 吳玉章, 曾政, 熊仲良, 蔡家利, 梁望旺, 藺露, 董春霞 申請人:重慶理工大學, 中國人民解放軍免疫學研究所, 重慶市動物疫病預防控制中心