用於耐四環素大腸桿菌檢測的組合物的製作方法
2023-10-11 16:26:14 2
用於耐四環素大腸桿菌檢測的組合物的製作方法
【專利摘要】本發明提供一種用於耐四環素大腸桿菌檢測的組合物，包括引物對SEQIDNO.1/2和引物對SEQIDNO.3/4?並在此基礎上進一步建立mPCR-DHPLC/電泳檢測試劑盒及方法，用以檢測食品中攜帶四環素耐藥基因tetA和/或tetB的大腸桿菌四環素耐藥株。所建立的方法在一次檢測中即可同時高特異性、高靈敏度地完成對樣品中的耐四環素大腸桿菌tetA和tetB兩種耐藥基因的檢測，進而確定待檢樣品是否被攜帶tetA和tetB耐藥基因的四環素耐藥性大腸桿菌所汙染。此外，所述方法檢測耗時短，操作簡捷，並具有快速高通量等優點，可以節省大量的勞力和財力，適合快速檢測的要求，滿足了食品中微生物檢測迅速準確的需求。
【專利說明】用於耐四環素大腸桿菌檢測的組合物
【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物檢測【技術領域】，涉及食品及生物產品中耐藥性大腸桿菌所攜帶的 耐藥基因的檢測，尤其針對大腸桿菌所攜帶耐四環素基因的mPCR檢測。 技術背景
[0002] 大腸桿菌是常見的可引起人畜共患病的致病菌，食品動物來源的菌株具有耐藥性 可能對人類存在巨大的潛在危害，檢測食品源、動物源等的大腸桿菌耐藥性的研究尤為重 要。由於細菌耐藥性的研究主要為臨床醫學領域，而對於動物源性及食源性細菌的耐藥性 研究起步較晚，且往往由於細菌同時食物鏈傳播給人類，人們對食物鏈的中間環節多著眼 於細菌致病性的檢測，而忽略了細菌耐藥性。
[0003] 在禽畜飼養中，四環素類抗生素被廣泛的應用於對各類細菌性疾病的預防工作 中，盲目加大抗生素使用劑量，使四環素在畜禽體內存留時間延長，使休藥期增加。同時在 畜產品生產過程也被用於提高家畜的生產性能，作為生長促進劑在飼料中隨意或提高添加 四環素；此外，屠宰前使用四環素類抗生素來掩蓋患病家禽臨床症狀以逃避宰前檢驗。在動 物體內或動物性相關食品中過量或大量的四環素殘留，促使細菌產生耐藥性，造成具有耐 藥性的病原菌引起人類食物中毒或感染疾病時，藥物無法治療，或耐藥性菌株的耐藥因子 (如質粒、整合子等）通過食物鏈等途徑流行傳播，引起菌株耐藥率提高，抗生素失效等嚴 重後果。
[0004] 大腸桿菌對四環素的耐藥性幾乎是所有抗生素中最嚴重的，且有研究表明患病動 物體內大腸桿菌分離株的耐藥性明顯高於健康動物分離株，這種現象可能會造成患病動物 的治療難度增加，甚至會產生致病菌的耐藥率提高的隱患。因此，檢測四環素耐藥基因，並 監控其在動物源性食品的流行情況，以及在其他非動物源性食品流行情況對於預防四環素 耐藥菌株對人類及動物造成健康和經濟上的危害，以及了解四環素耐藥基因在大腸桿菌中 的攜帶率，甚至是四環素的使用都具有重要意義。牛源大腸桿菌對四環素類藥物的耐藥率 為30. 5 %，豬源大腸桿菌對四環素類藥物耐藥率高達96. 3 %，研究發現大腸桿菌最常見的 耐受藥物是四環素。Bryan等（2004)研究了從美國的人和各種動物體分離的大腸桿菌，發 現tetA和tetB是最主要的大腸桿菌四環素耐藥基因，其攜帶率分別為35%和63%。
[0005] 目前，國內對動物源性細菌耐藥性的方法主要依據臨床和實驗室標準化委員會 (Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)制訂的《動物及其製品中細菌耐 藥性的測定紙片擴散法》SN/T1944-2007進行體外細菌培養藥敏性試驗，而缺少快速檢測食 品中大腸桿菌耐藥菌株的檢測方法。體外細菌培養藥敏性試驗操作繁瑣，不適於大量樣品 的檢測，且只能檢測菌株的耐藥表型，而對於耐藥基因尚未表達的耐藥菌株易造成漏檢。而 且完成藥敏鑑定的全自動生化鑑定儀價格昂貴，鑑定結果受操作人員的影響較大，也易造 成假性耐藥或假性敏感現象；此外該體外藥敏試驗的結果無法評估細菌耐藥性對人體的危 害。因此急需建立更加準確高效的檢測方法，可以快速實現耐藥菌株的鑑別，並可有效避免 被測菌株因體外藥敏試驗而產生的假性耐藥或假性敏感現象。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的之一，在於提供用於耐四環素大腸桿菌檢測的組合物，包括引物對 SEQ ID NO. 1/2 和引物對 SEQ ID NO. 3/4。
[0007] 關於這些引物對的描述如下表：
[0008]
【權利要求】
1. 用於耐四環素大腸桿菌檢測的組合物，包括引物對SEQ ID NO. 1/2和引物對SEQ ID NO. 3/4。
2. 用於耐四環素大腸桿菌檢測的試劑盒，包括權利要求1所述的組合物。
3. 檢測耐四環素大腸桿菌的方法，包括PCR反應的步驟，其特徵在於，所述PCR反應使 用權利要求1所述的組合物為擴增引物。
4. 權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述的PCR反應體系總體積25 y L，包括：待測 樣品DNA溶液I iil，5U/ ii L的Taq DNA聚合酶0. 25 ii L，PCR反應液12 ii L和餘量的水； 所述 PCR 反應液中含 IOmM Tris 'HCUOmM KCl、25mM MgCl2、dNTP 各 2. 5mM 及 0? I ii M 的引物對 SEQ ID NO. 1/2 和 0? I ii M 的引物對 SEQ ID NO. 3/4。
5. 權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述的PCR反應參數為： 預變性：94°C，lmin ; 進入循環：94°C變性30s，57°C退火90s，72°C延伸90s，30個循環； 終止延伸：72°C，10min。
6. 權利要求3所述的方法，其特徵在於，還包括對PCR反應產物進行DHPLC分析的步 驟，分析條件如下： 色譜柱：PS-DVB & C18 DNAS印色譜柱，4. 6mmX 50mm，粒度 3 ii m ; 柱溫：50°C ; 按照體積比，流動相為： Omin ：55. 0% A,45. 0% B ； 0. 5min ：50. 2% A,49. 8% B ； 3. 6min ：41. 8% A, 58. 2% B ； 6. 8min ：38. 2% A,61. 8% B ； 9. 9min ：36. 3% A,63. 7% B ； 13. Omin ：35. 0% A,65. 0% B ； A為50ml TEAA和250 ill乙腈混合，加滅菌超純水定容至1000ml所得溶液；B為50ml TEAA和250ml乙腈混合，加滅菌超純水定容至1000ml所得溶液； 流速：〇? 9mL/min ; 檢測器：突光檢測器，光源150W Xenon燈；激發譜帶寬15nm ;發射譜帶寬15. 3nm ;檢測 靈敏度：在波長350nm積分2s ; 上樣量：PCR產物IOii L。
7. 權利要求6所述的方法，其特徵在於，按照如下標準判斷所述DHPLC檢測結果： 檢測樣品無擴增吸收峰出現，可判定樣品結果為陰性，直接報告未檢出相對應的致病 菌； 檢測樣品tetA、tetB兩種基因中出現任一個及以上的典型PCR產物吸收峰，且吸收峰 值大於3mV時，可判定該樣品攜帶大腸桿菌四環素耐藥基因，該菌為耐四環素陽性菌株； 檢測樣品tetA、tetB兩種基因中無典型PCR產物吸收峰時，可判定該樣品不攜帶大腸 桿菌四環素耐藥基因，該菌為耐四環素陰性菌株； 檢測樣品出現典型的PCR產物吸收峰，但吸收峰值小於3mV時，建議樣本重做，重做結 果峰吸收值仍小於3mV則為陰性，否則為可疑陽性。
8. 權利要求3所述的方法，其特徵在於，還包括對PCR反應產物進行電泳分析的步驟： 10 ii L PCR產物，於3%瓊脂糖凝膠電泳，200V，20min後，在紫外透射分析儀上觀察結果。
9. 權利要求8所述的方法，其特徵在於，按照如下標準判斷所述電泳結果： 檢測樣品tetA, tetB基因均無相應大小的擴增條帶，可判定該樣品不攜帶tetA, tetB 兩種四環素耐藥基因； 檢測樣品tetA基因出現相應大小的擴增條帶而tetB基因無相應大小的擴增條帶，或 tetB基因出現相應大小的擴增條帶而tetA基因無相應大小的擴增條帶，或tetA，tetB基 因出現相應大小的擴增條帶，均可判定該樣品為四環素耐藥菌株。
【文檔編號】C12Q1/10GK104212902SQ201410453400
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月5日 優先權日:2014年9月5日
【發明者】鄭秋月, 徐君怡, 那晗, 曹際娟, 戰曉微 申請人:鄭秋月, 徐君怡, 那晗, 曹際娟, 戰曉微