骨誘導性生物材料的製作方法
2023-10-11 19:46:39 1
專利名稱：骨誘導性生物材料的製作方法
技術領域：
本發明涉及骨誘導性生物材料(osteoinductive biomaterial)。尤其，本發明涉及一種成骨組合物，及該成骨組合物在治療中的應用背景技術本發明的成骨組合物尤其被用於人或哺乳動物的組織再生，並且被用於促進或誘導骨骼生長。出於本說明的目的，術語「成骨蛋白」指通過分離哺乳動物的總骨骼蛋白而獲得的，並且能夠誘導骨形成的物質。術語「成骨的」和「骨誘導的」被認為是同義詞。骨發生是被用於描述成年哺乳動物中的骨骼重新形成的術語，並且在成年個體的骨折的再生過程中被證實。該過程通過與胚胎時期的骨生成極其類似過程而進行。在其它未鑑定的蛋白中的成骨蛋白含有骨形態發生蛋白(Bone Morphogenetic protein BMPs)。此類蛋白為被分類為形態發生蛋白中較大的轉化生長因子-β超家族(transforming growthfactor-beta superfamily)中的一部分的特徵蛋白家族。BMP家族包括多於12種的已知能夠在哺乳動物中誘導骨骼形成的個體成員。
發明內容
根據本發明的第一個方面，提供了對從骨骼中分離成骨蛋白的方法的改進，在該方法中含有片斷的成骨蛋白從骨骼中被提取，並且通過選自超濾和層析的富集步驟的順序被富集，所述改進在於在富集步驟之前從含有片斷的成骨蛋白中去除較高分子量組分。
所述較高分子量組分可以具有約100～300kDa的分子量。所述較高分子量組分典型地包括膠原、膠原片斷、膠原聚集體及其混合物。
該方法可以包括通過超濾去除所述較高分子量的組分。例如，可通過經過100～300kDa標準分子量膜(nominal molecular weightmembrane)，如100～300kDa標準分子量的聚碸薄膜的超濾而去除所述組分。
可以使用離液序列高的溶液(chaotropic solution)從骨骼中提取含有片斷的成骨蛋白。所述離液序列高的溶液可以含有脲、氯化胍或其組合。
所述富集步驟可以包括通過逐漸減小的標準分子量膜的含有片斷的成骨蛋白的連續超濾，隨後或交替進行層析富集步驟。因此富集步驟可以包括一步或多步層析步驟。
含有片斷的成骨蛋白可以通過連續的超濾步驟而被濃縮並被去鹽。所述片斷可以通過10kDA和5kDA的超濾步驟而被濃縮和去鹽。
所述層析富集步驟可以選自一種或多種肝磷脂-瓊脂糖凝膠層析(heparin-sepharose chromatography)、羥磷灰石層析(hydroxyapatitechromatography)、反向矽膠層析和其中任意兩種或多種的組合。
根據本發明的第二方面，提供了包括成骨蛋白、不溶性骨基質(ICBM)和明膠的誘導骨生長的組合物。
所述組合物可以為水合性粉末形式。
所述不溶性骨基質可以通過以下步驟製備用酸去除全骨粉末中的礦質以產生酸性去礦質的全骨粉末或基質，用如尿素水溶液或胍鹽溶液的離液劑(chaotropic agent)從去礦質的骨粉或基質中提取可溶性組分，水洗殘留物，然後乾燥該殘留物從而製備不溶性骨基質。
可以通過提取不溶性骨基質以製備富含可溶性I型膠原的片斷、沉澱該可溶性I型膠原並真空乾燥該沉澱物，從而獲得明膠。
可以用純的沸水進行提取，並且可以用乙醇進行沉澱。
所述不溶性膠原骨基質可以為哺乳動物的。也可以為非人體的或人體的不溶性膠原骨基質。優選為人的不溶性膠原骨基質，或hICBM。相應地，明膠可以為人的明膠。
可以通過上述方法製備成骨蛋白。
成骨蛋白、hICBM和人明膠之間的質量比約為0.4～0.6∶800～1200∶100～1000。
因此，誘導骨生長的組合物中成骨蛋白的含量可以約為400～600μg，hICBM的含量約為800～1200mg，人明膠的含量約為100～1000mg。在優選實施例中，所述誘導骨生長的組合物中成骨蛋白的含量約為500μg，hICBM的含量約為1000mg，人明膠的含量約為200mg。
本發明延及如上所述的誘導骨生長的組合物，其中通過上述改進方法製備成骨蛋白。
根據本發明的另一方面，提供了製備誘導骨生長的組合物的方法，該方法包括混合成骨蛋白、不溶性骨基質和明膠的步驟。
所述不溶性膠原骨基質可以為哺乳動物的，並且可以選自非人體的或人體的不溶性膠原骨基質。優選為人體的不溶性膠原骨基質或hICBM。明膠可以為人的明膠。
可以通過上述方法製備成骨蛋白。
成骨蛋白、hICBM和人的明膠之間的質量比可以為0.4～0.6∶800～1200∶100～1000。
因此，該方法可以包含混合約400～600μg的成骨蛋白、約800～1200mg的hICBM、約100～1000mg的人明膠。在優選實施例中，該方法可以包含混合約500μg的成骨蛋白、約1000mg的hICBM、約200mg的人明膠。
該方法可以包括將成骨蛋白與hICBM在稀酸性水溶液中混合、凍幹所得混合物，以製備乾粉末，並將該粉末與人的明膠混合，以製備水合材料。
根據本發明的另一方面，提供了用於誘導哺乳動物骨骼生長的設備，該設備包括含有成骨蛋白、不溶性骨基質和明膠的誘導骨骼生長的組合物，和用於向治療部位輸送所述組合物的輸送裝置。
所述成骨蛋白、不溶性骨基質和明膠可以為上述類型。所述輸送裝置可以為注射器。
尤其，該組合物可以為上述的可以被容納在注射器中的水合性的乾粉。因此，通過向注射器中注入鹽水溶液，所述材料可以被水合，以注入到輸送部位內。
根據本發明的另一方面，提供了一種在具有骨骼缺陷的哺乳動物中誘導骨骼形成的方法，該方法包括向哺乳動物的骨骼缺陷處注入上述誘導骨骼的組合物的步驟。
根據本發明的另一方面，提供了誘導哺乳動物中異位骨生長的方法，該方法包括向哺乳動物的非骨質部位注入上述誘導骨骼的組合物的步驟。
根據本發明的另一方面，提供了一種加速哺乳動物中異源骨癒合的方法，該方法包括將異源骨物質與上述誘導骨骼的組合物一起注入哺乳動物中需要異源骨癒合的位置的步驟。
該異源骨材料可以為組織庫的骨，包括人的皮層骨片、松質骨塊、松質骨粉、全骨或脫礦骨基質。
根據本發明的另一方面，提供了一種用於加速哺乳動物中自體骨移植癒合的方法，該方法包括將自體骨材料與上述誘導骨的組合物一起注入哺乳動物中需要自體骨移植癒合的位置。
所述自體骨材料可以為髂嵴自體骨。
根據本發明的另一方面，提供了用於誘導具有骨骼缺陷的哺乳動物中骨骼形成的方法中的物質或組合物，所述物質或組合物包括上述誘導骨骼生長的組合物，並且該方法包括將所述組合物注入哺乳動物的骨骼缺陷處。
根據本發明的另一方面，本發明提供了用於誘導哺乳動物中異位骨生長的方法中的物質或組合物，該物質或組合物包括上述誘導骨骼生長的組合物，並且所述方法包括將所述組合物注入哺乳動物的非骨質部位的步驟。
根據本發明的另一方面，提供了用於加速哺乳動物中異源骨癒合的物質或組合物，該物質或組合物包括上述誘導骨骼生長的組合物，並且所述方法包括將異源骨材料與所述組合物一起注入到哺乳動物中需要異源骨癒合的位置的步驟。
所述異源骨材料可以為選自人的皮層骨片、松質骨塊、松質骨粉、全顆粒骨或脫礦質骨基質的組織庫的骨骼。
根據本發明的另一方面，提供了用於加速哺乳動物中自體骨移植癒合的物質或組合物，該物質或組合物包括上述誘導骨骼生長的組合物，並且所述方法包括將自體骨材料與所述組合物一起注入到哺乳動物中需要自體骨移植癒合的位置的步驟。
所述自體骨材料可以為碎的髂嵴自體骨。
根據本發明的另一方面，提供了物質或組合物在製備用於誘導具有骨骼缺陷的哺乳動物中骨骼形成的方法的藥物的應用，所述物質或組合物包括上述誘導骨骼生長的組合物。
根據本發明的另一方面，提供了物質或組合物在製備用於誘導哺乳動物中異位骨生長的方法的藥物的應用，所述物質或組合物包括上述誘導骨骼生長的組合物。
根據本發明的另一方面，提供了物質或組合物在製備用於加速哺乳動物中異源骨癒合的藥物中的應用，所述物質或組合物包括上述誘導骨骼生長的組合物和異源骨材料。
所述異源骨材料可以為選自人的皮層骨片、松質骨塊、松質骨粉、全骨或脫礦質骨基質的組織庫的骨骼。
根據本發明的另一方面，提供了物質或組合物在製備用於加速哺乳動物中自體骨移植癒合的藥物中的應用，所述物質或組合物包括上述誘導骨骼生長的組合物和自體骨材料。
所述自體骨材料可以為碎髂嵴自體骨。
本發明相應地涉及由哺乳動物的骨製備成骨蛋白，及其在骨修復中與基質相結合的應用。
討論哺乳動物的骨組織為被稱作骨形態發生蛋白(BMPs)的蛋白生長和分化因子的家族的宿主。當這些蛋白被注射到青年或成年哺乳動物中時，其能夠誘導新骨形成。
BMPs在成年個體中被調遣以通過與胚胎分化極其類似的機制產生骨的再生。骨分化的發育過程包括間質細胞的趨化作用、祖細胞的繁殖、軟骨的分化、血管侵入、骨形成、重新成型和最終的骨髓分化(Reddi，(1981)Collagen Rel.Res，1209-226)。已發現骨基質的天然軟骨內骨分化活性可以分離地被獲取，並且可以用無活性的殘餘基質再構建，從而恢復全骨誘導活性(Sampath and Reddi，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 787599-7603)。Sampath等(1987)公開了成骨素，即來自哺乳動物骨骼的成骨蛋白的純化(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，7109-7113)。Urist等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81371-375)公開了具有酸性多肽的特性、並具有約18kD分子量的牛的骨形態發生蛋白提取物。該作者報導了該蛋白存在於通過羥磷灰石層析分離的片斷，並且該蛋白誘導小鼠後腿肌肉中的骨骼形成，及在大鼠和狗的頭骨內的環鑽損傷處的骨再生。
1985年10月7日出版的歐洲專利申請No.148,155公開了源自牛、豬和人的成骨蛋白。其中一種被發明人命名為P3蛋白，並具有22～24kD分子量的蛋白質，被報導已經被純化至基本均質態。據報導，當該材料被注入動物體內時，能夠誘導骨形成。
本發明的目的是提供一種以高產率由哺乳動物骨組織製備成骨蛋白的方法。另一目的是提供一種含有被吸附到基質上的成骨蛋白的骨骼誘導的設備作為所述骨形態發生蛋白的輸送系統。
本發明提供了成骨設備，當在哺乳動物的骨骼缺陷處植入時，它能夠在植入處誘導骨骼的完全再生，和隨後的缺陷癒合。該設備包括下述基質載體材料，和成骨蛋白，即含有骨形態發生蛋白(BMPs)的總提取骨蛋白的一部分。
成骨蛋白需要適當的輸送材料的存在，以實現其骨再生作用。從去礦質骨基質中純化的基質為這種適合的材料，並在以下進行更詳細的描述。
用於分離成骨蛋白的方法部分採用了Sampath等(1987)公開的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，7109-7113)。該方法利用了BMP’s對被固定在層析載體顆粒上的羥磷灰石和肝磷脂的親和性，以實現富BMP片斷的分離。該方法使用了在肝磷脂層析柱上的去礦質骨的尿素提取物的層析，隨後使用羥磷灰石柱，最後使用凝膠排阻層析，以去除重分子量汙染物。儘管該方法取得了對具有成骨能力的片斷的有效分離，但是使用本發明的方法成骨蛋白的產量、產率和純化速度都極大地被提高。
本發明的成骨蛋白的製備是基於Sampath等的方法(1987)，但是包括了新穎的和創造性的改進。關鍵的改進涉及在層析之前，在純化過程開始時，將總骨蛋白提取物分為高、低的分子量部分。骨形態發生蛋白具有約30kDa的分子量，並且出於本說明的目的，被分類為低分子量的多肽。對本說明來說，高分子量的多肽包括分子量大於100kDa並且尤其大於300kDa的多肽。所述高分子量片斷包括膠原和膠原片斷(約100kDa)，以及膠原聚集物(200kDa，或更高)，和其它的未識別的多肽，其中一些被認為是形態發生素誘導的成骨作用的抑制劑。對本說明來說，注意到在肝磷脂親和層析步驟之前，在此方法的開始時，從低分子量片斷中分離膠原是很重要的。
出於以下原因，膠原的分離是重要的。首先，I型膠原被認為具有BMPs親和性(Reddi AH(1995)Cartilage morphogenesisrole of boneand cartilage morphogenetic proteins，homeobox genes andextracellular matrix.Matrix Biol.Oct 14(8)599-606.；Winn SR，Uludag H，Hollinger JO.(1999) Carrier systems for bonemorphogenetic proteins.Clin Orthop 1999 Oct(367Suppl)S95-106)。其次，肽為經常阻塞柱子、並且以阻礙結合的方式來改變BMP與肝磷脂分子上的結合位點的交換動力學的大MW肽。此外，似乎可能存在在總提取骨蛋白的高分子量片斷中殘留骨形態發生蛋白，即成骨蛋白的活性組分，的抑制因子。這表明在I型膠原和肝磷脂之間存在對BMPs的競爭性結合。這種競爭性結合的阻擾看來導致BMPs在肝磷脂柱上的層析純化過程中的產率損失。本發明的方法在總成骨活性的回收方面取得了超過現有技術方法的顯著進步。
現在，通過參考以下實施例和附圖的方式描述本發明。
圖1表示不同時間的被治療的骨折不癒合(non-union)的X射線測定值；圖2表示常規方法治療後的患者的骨骼中的骨折不癒合。
圖3表示經過根據本發明的方法的治療後，圖2中的患者的骨骼的完全癒合。
具體實施例方式
實施例1含有骨形態發生蛋白的人成骨蛋白的純化1.去礦質骨的製備無軟組織粘附的人長骨骨幹被去骨髓，然後切成1～4cm的片。該材料在含有體積比為50∶50的甲醇和氯仿的溶劑體系中，在4～8℃下被脫脂16～24小時。然後，在4～8℃下此骨在純乙醇中被脫水48小時。倒出乙醇，並且該骨在通風櫥中被空氣乾燥48～96小時。然後，用錘式粉碎機磨碎骨頭，以使顆粒直徑範圍為10～425微米。
在室溫下通過連續加入4～5體積的0.5M HCl，直至通過一段時間內的pH變化的減緩而判斷骨骼中的羥磷灰石和鹽酸之間的酸鹼反應已經接近完成，從而去除該微粒材料的礦質。用稀釋的碳酸氫鈉溶液中和該去礦質骨，然後用純化的水清洗，以製備去礦質的骨基質。
2.去除礦質的骨基質的不連續提取由以上步驟製備的去礦質骨基質(DBM)用3～4體積的8M尿素，pH7.4，含有蛋白酶抑制劑(5mM鹽酸苯甲脒，0.1M 6-氨基己酸，5mMN-乙基馬來醯亞胺和0.5mM苯基甲磺醯氟)的50mM Tris-HCl在4～8℃下24小時提取2次。通過經過多孔聚丙稀玻璃料的過濾收集上清，然後通過3微米標準尺寸的筒式過濾器(Polygard，MilliporeCorporation，美國)過濾。
3.高分子量組分的超濾分離通過將步驟2中的上清液通過300kDa標準分子量膜(Millipore，Cat.No.CDUF006TM)進行超濾從而去除重分子量蛋白和膠原。可以任選使用具有稍低的總BMP活性的產率、但具有較高特異活性的100kDa標準分子量膜。該方法去除去除在較低離子強度的條件下結合BMPs的膠原，尤其I型膠原。滲餘物用6M尿素緩衝液、pH7.4的50mMTris-HCL(緩衝液A)液清洗幾次，然後收集含有成骨活性的滲濾物。
4.通過超濾緩衝液交換的濃縮和去鹽步驟3中的含有成骨蛋白(分子量約為30kDa)的滲濾物通過在10kDa PLGC膜(Millipore，Cat.No.SK1P003W4)上的超濾被去鹽並濃縮。該步驟有效地去除了鹽和其它的低分子量組分，從達到以下層析步驟所需的條件。濃縮後，相繼量的含有上述濃度的酶抑制劑、但是除了n-乙基馬來醯亞胺外的緩衝液A被加入到滲餘物中，直至該滲餘物的傳導率達到5.0～6.0毫西門子。
5.肝磷脂-瓊脂糖層析步驟4中的滲餘物在已用含0.15M NaCl的緩衝液A平衡的肝磷脂-瓊脂糖CL6b(Pharmacia-Amersham)上被層析。該柱子用3柱體積的含有0.15M NaCl的緩衝液A清洗，然後用含有0.5M NaCl的緩衝液A洗脫。收集在280nm處具有吸收的洗脫峰，並在4℃保存。
6.肝磷脂-瓊脂糖親和性片斷的超濾交換步驟5中的肝磷脂-瓊脂糖親和性片斷通過在PLCC 5kDa膜(Millipore，Cat.No.CDUF001LC)上的超濾被去鹽並被濃縮。該步驟有效地去除鹽和其它的低分子量組分，以達到下一層析步驟所需的條件。濃縮後，相繼量的含有10mM磷酸鈉的緩衝液A被加到滲餘物中，直至該滲餘物的傳導率達到5.0～6.0毫西門子。
7.羥磷灰石(HA)層析步驟6中得到的滲餘物在已被含10mM磷酸鈉的緩衝液A平衡的羥磷灰石柱(Hydroxyapatite Ultrogel，Biosepra，法國)上被層析。該柱子用3柱體積的含有10mM磷酸鈉的緩衝液A清洗。用含有150mM磷酸鈉的緩衝液A洗脫富含成骨蛋白的片斷。收集在280nm處具有吸收的洗脫峰，並在4℃保存。
8.將HA親和性片斷交換到10mMHCl中使用負載有3kDa截留值的纖維素膜(YM3，76mm再生纖維素，Millipore Corporation，美國)的Amicon攪拌式超濾器(MilliporeCorporation，美國)將步驟7中的HA親和性的片斷交換到10mM HCl溶液中。
在本發明的一個實施例中，HA親和性片斷被改為負載到C-18Vydac矽基HPLC柱(顆粒直徑為5μm，孔尺寸為300)上。用10柱體積的0.1％的三氟乙酸、10％乙腈洗柱子，並用70％乙腈、0.1％三氟乙酸逐步洗脫結合蛋白。凍幹該材料，並在10mM HCl中被重組。
在表1中列出具有蛋白值的方法流程圖。
表1
被加載在1.2g基質上的500μg的實施例1中步驟8的材料，誘導人的頑固性長骨不結合處的新骨形成。通過S-200凝膠過濾層析(Pharmacia)分析步驟8中的材料，並發現含有20％質量的高分子量組分。這些組分可以通過使用S-200基質(Pharmacia)上的凝膠排阻層析和用8M脲，1M NaCl，50mM pH7.4的Tris-HCl洗脫的「純化」步驟被任選地去除。最終的產率範圍為30mg～50mg的成骨蛋白。這些產率比那些已報導的使用相當的起始骨材料和基於羥磷灰石親和性、肝磷脂親和性和在S-200基質(Pharmacia)上的凝膠排阻層析的方法的狒狒骨提取(Ripamonti U，Ma SS，Cunningham NS，Yeates L，Reddi AH(1993)Reconstruction of the bone-bone marrow organ by osteogenin，abone morphogenetic protein，and demineralised bone matrix in calvarialdefects of adult primates(Plastic and Reconstructive Surgery 91(1)27-36))的產率高4倍。在人和狒狒的髂嵴骨活組織切片檢查之間的對比組織形態研究已經表明在兩個物種之間具有顯著程度的相似性(SchnitzlerCM，Ripamonti U，and Mesquita JM(1993)Histomorphometry of iliaccrest trabecular bone in adult male baboons in captivity，Calcif，Tiss.Int.，52，447-454)。
實施例2成骨蛋白的成骨活性的測定大鼠的生物鑑定成骨活性的生物試驗如Sampath和Reddi(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)806591-6595)所述。該試驗包括在被醚麻醉的受體鼠的皮下植入含有不溶性骨基質和人成骨蛋白的測試樣品。在無菌條件下在胸部區域的皮膚上切開垂直的切口(1cm)，並且通過鈍器解剖製成對稱的小袋。植入物包括25mg的大鼠ICBM，50mg溶於0.5M乙酸中的鼠尾I型膠原，和可變量的成骨蛋白。測試樣品被對稱植入到各小袋中，並且縫合切口。異向的位點使能夠進行骨誘導的研究，而無由於使用骨質位點而導致的可能的混淆。
在植入後的第12天取出再生組織，並且如所述的(Reddi andSullivan 1980 Endocrinology 1071291-1299)進行骨形成標記的鹼性磷酸酶活性的試驗。結果和數據如表2所示。
表2
*hICBM-人不溶性骨基質大鼠植入模型顯示了通過成骨蛋白誘導的軟骨內骨發育的階段的可控制的進展。該後胚胎骨生成可以被認為概要重現了正常的胚胎骨發育過程中的活動。新骨的形成經過局部間葉細胞濃縮、軟骨階段和細胞外基質形成、血管侵入和礦質化，以及最後經由骨原細胞系分化的新骨的形成。
使用甲苯胺藍或蘇木精/伊紅(hemotoxylin/eosin)染色的組織學分析清晰地表明軟骨的發育。十二天的植入通常足以確定是否該植入物具有骨誘導活性。
鹼性磷酸酶活性可以作為骨生成的標記。在植入物均質化和在鹼性條件下以p-磷酸硝基苯做底物進行酶活性試驗後，可以通過分光光度測定酶活性。在組織學上不顯示骨發育的植入物在這些試驗條件下應該不具有鹼性磷酸酶活性(Reddi AH and Sullivan NE(1980)Endocrinology 107，1291-1299)。該試驗對於鹼性磷酸酶的特異的和總活性的定量是有用的，並且這可能與所述被製備的成骨蛋白的骨誘導能力相關。
根據Reddi和Sullivan(1980，Endocrinology 107，1291-1299)的方法測定鹼性磷酸酶活性。鼠植入物誘導的1單位或更多的鹼性磷酸酶說明了有效的性生成。
實施例3人明膠的製備在硼矽酸鹽玻璃瓶中混合一定量的ICBM和5～10體積的水，並在高壓鍋中加熱1小時。用Whatman No.1濾紙或20微米的不鏽鋼篩過濾上清。將明膠溶液冷卻到25℃，並向膠原沉澱物中加入5體積冷乙醇(-20℃)。在真空中乾燥沉澱物，並且被研磨至75～425微米的尺寸範圍。
實施例4
成骨設備的製造人ICBM被用作製備骨誘導性的組合生物材料的可吸附性的載體基質。當足夠量的成骨蛋白與ICBM混合時，無活性的ICBM被恢復生物活性。ICBM的顆粒尺寸影響新骨的量反應。75～420μm的顆粒引起最大反應。一定量的ICBM與成骨蛋白在10mM HCl中混合，並且用無菌調藥刀徹底混合。所得材料被凍乾乾燥。
然後，將該材料與人ICBM源的明膠混合。將各組分充分乾燥混合到一起，以獲得均質分布的混合物。人明膠發揮使生物材料可被擠壓的易水合性材料的作用。該組合物被裝載到注射器中。當使用時，該骨誘導性組合物被再水合。當將一定量的無菌鹽水或水吸入到注射器中時，再水合作用被實現，並且需要約10分鐘以使再水合作用發生。然後，可以通過推動活塞而容易地將所述物質排出注射器。這使在手術時能夠將精確量的植入物置入缺陷部位。植入物可以通過使用標準的明膠海綿如Spongostan(Johnson and Johnson Medical Limited，U.K.)而進一步在原位被施用。
載體可以被可生物降解的合成物或合成的無機基質(如，HAP、膠原、磷酸三鈣、或聚乳酸、聚乙醇酸及其各種共聚物)替代。
表3中列出成骨組合物的典型配方。
表3
周的平均術後階段內達到高於2的分值。由受過訓練的臨床醫生根據1～5的標準通過放射線照相來估測橋變(bridging)，其中1＝骨未連合/無骨痂，2＝無橋變的骨痂，3＝中等橋變，4＝良好的橋變，5＝完全結合。與1.44的治療前值相比，治療組在20周的術後階段時的平均值為2.80。該結果說明本發明的成骨組合植入物對難治性骨不連具有有效治療作用。圖1中列出了在不同術後階段所測定的值。
本發明的優點在於由本發明的成骨生物材料組合物誘導的骨骼的多步發育階段包括纖維蛋白和纖維結合蛋白與生物材料的結合、細胞的趨化現象、纖維原細胞的繁殖、間葉細胞的濃縮、分化為成軟骨細胞、軟骨發生、血管侵入、骨骼形成、再成型和骨髓分化。
本發明的可注射的生物材料具有很多優點。它可以在室溫下被儲存很長時間，而沒有明顯的生物活性下降。當手術時，本發明的可注射的生物材料可以容易地被再水合，並且易於操作，僅需要推動注射器的活塞以推出所需量的成骨物質。
由臨床觀察來看，該成骨生物材料組合物具有以下優點。它具有在植入位點誘導骨骼的成骨性。它避免了在患者的髖部進行再次手術以獲得自體骨的需要，並且避免使用組織庫的骨的需要。這樣降低了傳染疾病的危險。
ICBM結合成骨蛋白，並且起到緩慢釋放運送系統的作用，以活化植入位點處的祖細胞。本發明的複合生物材料適應骨骼發育過程中細胞應答的各步驟。該組合生物材料是可生物相容的，並且在成骨過程中可以被再吸收，並被宿主自身的骨骼替代。
由其顆粒尺寸所測定的所述生物材料幾何形狀對於進行細胞滲透和分化是最優的。
權利要求
1.對從骨骼中分離成骨蛋白的方法的改進，在該方法中，含有片斷的成骨蛋白從骨骼中被提取，並且通過選自超濾和層析的富集步驟的順序被富集，所述改進在於在富集步驟之前去除含有片斷的成骨蛋白中的較高分子量組分。
2.如權利要求1所述的改進，其中該較高分子量組分具有約100～300kDa的分子量。
3.如權利要求1或2所述的改進，其中該較高分子量組分選自膠原、膠原片斷、膠原聚集體及其混合物。
4.如權利要求1或2所述的改進，其中通過超濾去除較高分子量組分。
5.如權利要求3所述的改進，其中通過經100～300kDa標準分子量的聚碸薄膜的超濾而去除所述較高分子量組分。
6.如權利要求8～10中任意一項所述的改進，其中含有片斷的成骨蛋白通過連續的超濾步驟被濃縮並被去鹽。
7.一種包括成骨蛋白、不溶性骨基質(ICBM)和明膠的誘導骨骼生長的組合物。
8.根據權利要求7所述的誘導骨骼生長的組合物，其中通過如權利要求1～6中任意一項所述的改進方法製備成骨蛋白。
9.根據權利要求8所述的誘導骨骼生長的組合物，該誘導骨骼生長的組合物為水合性粉末形式。
10.如權利要求7～9中任意一項所述的誘導骨骼生長的組合物，其中成骨蛋白、hICBM和明膠之間的質量比為0.4～0.6∶800～1200∶100～1000。
11.一種製備誘導骨骼生長的組合物的方法，該方法包括混合成骨蛋白、不溶性骨基質和明膠的步驟。
12.如權利要求11所述的步驟，其中通過如權利要求1～6中任意一項所述的改進方法製備成骨蛋白。
13.一種用於誘導哺乳動物骨骼生長的設備，該設備包括含有成骨蛋白、不溶性骨基質和明膠的誘導骨骼生長的組合物，和用於向治療部位輸送所述組合物的輸送裝置。
14.如權利要求13所述的設備，其中通過如權利要求1～6中任意一項所述的改進方法獲得成骨蛋白。
15.如權利要求13或14所述的設備，其中該輸送裝置為注射器。
16.如權利要求13～15中任意一項所述的設備，其中所述組合物為水合性粉末。
全文摘要
在從骨骼中分離成骨蛋白的方法中，含有片斷的成骨蛋白從骨骼中被提取，並且通過選自超濾和層析的富集步驟的順序被富集。本發明的改進在於在富集步驟之前從含有片斷的成骨蛋白中去除較高的分子量組分。該較高分子量組分具有約100～300kDa的分子量，並且選自膠原、膠原片斷、膠原聚集體及其混合物。
文檔編號A61K38/39GK1678631SQ03814401
公開日2005年10月5日 申請日期2003年6月18日 優先權日2002年6月20日
發明者尼古拉斯·杜內斯 申請人:尼古拉斯·杜內斯