蛋白類蛋白酶體激活劑亞基3(pse3)作為結直腸癌標記物的用途的製作方法

2023-10-27 17:16:02 4

專利名稱：蛋白類蛋白酶體激活劑亞基3(pse3)作為結直腸癌標記物的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及結直腸癌的診斷。本發明公開了蛋白類蛋白酶體激活劑亞基3(＝PSE3)在結直腸癌診斷中的用途。而且，本發明特別涉及通過檢測個體來源的液體樣品中的PSE3而由所述樣品診斷結直腸癌的方法。PSE3的檢測例如可用於結直腸癌的早期檢測或診斷。
癌症仍然是一種主要的公共健康挑戰，儘管檢測和治療有所進展。在各種類型的癌症中，結直腸癌(＝CRC)是在西方世界中最常發生的癌症之一。
癌症被檢測/診斷得越早，整體存活率就越好。這對CRC來說尤為正確。晚期腫瘤的預後很差。超過1/3的患者在確診後5年內死於進行性疾病，相當於5年內的存活率約為40％。目前的治療僅治癒了一小部分患者，並且明顯地對那些在疾病早期獲得診斷的患者的作用最好。
鑑於CRC是一種公共健康問題，必須開發出更有效地篩選和預防性檢測結直腸癌的方法。
目前可用的最早期結直腸癌檢測方法包括使用便血檢查或內窺鏡方法。但是，在檢查便血前，一般必須存在明顯的腫瘤大小。基於愈瘡木脂的大便潛血檢查的敏感性約為26％，這意味著74％的具有惡性腫瘤病灶的患者仍然不能被檢測出來(Ahlquist，D.A.，Gastroenterol.Clin.North Am.26(1997)41-55)。目測癌症前期和癌症病灶是最好的早期檢測方法，但結腸鏡檢查是侵入性的，成本高、風險大且有併發症(Silvis，S.E，et al.，JAMA 235(1976)928-930；Geenen，J.E.，et al.，Am.J.Dig.Dis.20(1975)231-235；Anderson，W.F.，et al，J.Natl.Cancer Institute 94(2002)1126-1133)。
在近些年，已經報導了海量的所謂結腸特異性基因乃至所謂的結直腸癌特異性基因。大多數的相應研究論文或專利申請都是基於通過分別分析結腸(癌)組織和不同組織或鄰近正常組織的RNA表達譜所獲得的數據。這樣的方法可概括為差異mRNA展示技術。
作為可由mRNA展示技術獲得數據的實例，應提及和討論WO01/96390。該申請描述並要求保護200種以上的分離的多核苷酸以及同樣多的對應的多肽，以及其檢測CRC的用途。但是，通過對應蛋白的水平不能監測mRNA水平的差異是常識。稀有mRNA編碼的蛋白的存在量可能非常大，而高豐度mRNA編碼的蛋白可能仍然難以檢測到或根本無法發現。mRNA水平和蛋白水平之間缺乏關聯是源於以下的原因，如mRNA穩定性、翻譯效率、蛋白穩定性等。
還有一些新方法研究不同組織之間或健康組織和患病組織之間的蛋白譜差異，以鑑別可用於診斷CRC的侯選標記分子。Brünagel，G.，et al.，Cancer Research 62(2002)2437-2442鑑別了7種核基質蛋白，這些蛋白在CRC組織中的豐度似乎高於鄰近的正常組織。沒有報導得自個體的液體樣品的數據。
WO 02/078636報告了約9種由表面增強雷射吸收和離子化(SELDI)發現的結直腸癌相關蛋白質點。與得自健康對照的血清相比，在得自CRC患者的血清中更常觀察到這些蛋白質點。但是，不知道這種點中包含的分子的身份(例如其序列)。
儘管CRC領域中列出的侯選蛋白標記龐大且不斷增長，但迄今為止這些分子的臨床/診斷效用還未知。為了在臨床上有效用，作為單個標記物的新診斷標記物至少應當和本領域已知的最好單個標記物一樣好。或者，新標記物分別在單獨使用或和一種或多種其它標記物聯用的情況下，應當使診斷的敏感性和/或特異性有進步。檢查的診斷敏感性和/或特異性最好通過下文詳述的其受試者操作特徵曲線來評價。
目前，在CRC領域僅有基於癌胚抗原(CEA，一種腫瘤相關糖蛋白)的診斷性血檢可用於幫助診斷。在95％的得自結直腸癌、胃癌和胰腺癌患者的組織樣品中，以及在大多數乳癌、肺癌以及頭頸癌患者中，CEA增加(Goldenberg，D.M.，et al.，J.Natl.Cancer Inst.(Bethesda)57(1976)11-22)。CEA水平提高在非惡性患者中也有報導，而許多結直腸癌患者血清中的CEA水平正常，尤其是在疾病早期(Carriquiry，L.A.，and Pineyro，A.，Dis.Colon Rectum 42(1999)921-929；Herrera，M.A.，et al.，Ann.Surg.183(1976)5-9；Wanebo，H.J.，et al.，N.Engl.J.Med.299(1978)448-451)。由血清或血漿檢測的CEA在檢測重現性方面的效用在報導上有爭議，迄今還未廣泛應用(Martell，R.E.，et al.，Int.J.Biol.Markers 13(1998)145-149；Moertel，C.G.，et al.，JAMA 270(1993)943-947)。
根據可得到的數據，血清CEA測定過程所具有的敏感性和特異性均不能使其用作無症狀群體的結直腸癌篩選檢查(Reynoso，G.，et al.，JAMA 220(1972)361-365；Sturgeon，C.，Clinical Chemistry 48(2002)1151-1159)。
全血、血清或血漿是最廣泛使用的臨床途徑樣品源。鑑別出使癌症檢查可靠或提供早期診斷信息的早期CRC腫瘤標記物，可產生一種診斷性實驗，極大地幫助診斷和處理該疾病。因此，存在著急迫的臨床需要來改進CRC的血液診斷。特別重要地是改善CRC的早期診斷，因為對於早期診斷的患者來說，其存活機會遠高於在疾病進行期被診斷出來的患者。
本發明的任務是研究是否可以鑑別出可能有助於CRC診斷的新標記物。
令人驚奇地是，已經發現使用蛋白PSE3至少可以部分地克服目前技術水平已知的問題。
因此，本發明涉及結直腸癌診斷方法，該方法包括以下步驟a)提供由個體獲得的液體樣品；b)在適於PSE3特異性結合物和PSE3形成複合物的條件下，使所述樣品接觸所述結合物，和c)將(b)中形成的複合物的量與結直腸癌診斷相關聯。
本發明的另一個實施方案是診斷結直腸癌的方法，該方法包括以下步驟a)在適於PSE3特異性結合物和PSE3形成複合物的條件下，使得自個體的液體樣品接觸所述PSE3特異性結合物，和b)將(a)中形成的複合物的量與結直腸癌診斷相關聯。
技術人員應當認識到，任何這樣的診斷都可以體外進行。其後廢棄患者樣品。患者樣品僅用於本發明的體外診斷方法，患者樣品材料不轉移回患者體內。通常，樣品為液體樣品。
26S蛋白酶體是一種具有高度有序結構的多催化蛋白酶複合體，由兩種複合體20S核心和19S調節體組成。蛋白酶體以高濃度分布於整個真核細胞中，以ATP/泛蛋白依賴性方式切割肽(Coux et al.(1996)，Annu.Rev.Biochem.65，801-847；Bochtler et al.(1999)，Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.28，295-317)。免疫蛋白酶體是一種改良的蛋白酶體，其是加工MHC I類肽必須的。在免疫蛋白酶體中，19S調節體由11S調節體取代(Rock and Goldberg(1999)，Annu.Rev.Immunol.17，739-779)。已經鑑別出11S調節體的3種亞基(α、β和γ)(Kandil et al.(1997)，Immunogenetics 46，337-344)。PSE3(蛋白酶體激活蛋白亞基3；SWISS-PROTQ12920)是11S調節體的γ亞基，6個γ亞基組合形成同源六聚體環。
已經鑑別出編碼不同同工型的兩種轉錄物變體(SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)。
最初在1990年分離出PSE3編碼基因，對應的蛋白稱為Ki。系統性紅斑狼瘡(SLE)患者產生抗多種核抗原的自身抗體，Ki是其中之一。Nikaido等(Nikaido et al.(1990)，Clin.Exp.Immunol.79，209-214)使用牛cDNA作為探針篩選SLE患者cDNA文庫，分離出對應的cDNA。稍後，發現重組Ki活化蛋白酶體，該蛋白被確定為PSE3(Realini et al.(1997)，J.Biol.Chem.272，25483-25492；Tanahashi et al.(1997)，Genes Cells2，195-211)。
最近的工作揭示，根據免疫組織化學染色和蛋白質印跡的評價，PSE3在甲狀腺癌中不正常高表達，尤其是在其生長促進細胞中不正常高表達(Okamura et al.(2003)，J.Clin.Endocrin.Metab.88，1374-1383)。
對技術人員來說顯而易見地是，本發明不應當被解釋為限於SEQID NO1或SEQ ID NO2的全長PSE3蛋白。PSE3的生理或人工片段、PSE3的次級修飾物以及PSE3的等位基因變體也包含在本發明中。人工片段優選包括合成或通過重組技術產生的肽，其至少包含診斷目標的一個表位，該表位由至少6個連續胺基酸組成，這6個連續胺基酸來源於在SEQ ID NO1或SEQ ID NO2中公開的序列。這樣的片段最好可用於產生抗體，或用作免疫實驗中的標準。人工片段更優選包含目標的至少兩個表位，以供建立夾心免疫實驗。
在優選的實施方案中，新標記物PSE3可用於監測以及篩選目的。
當用於患者監測時，本發明的診斷方法可能有助於評價腫瘤載荷、治療效率和患者隨訪中腫瘤復發。PSE3水平增加與腫瘤載荷直接相關。在短期(幾小時至14天)化療後，PSE3增加可用作腫瘤細胞死亡指標。在患者隨訪(3個月至10年)中，PSE3增加可用作腫瘤復發指標。
在一個優選實施方案中，本發明的診斷方法用於篩選目的。即其通過檢測PSE3水平，並將所檢測的水平與CRC的存在與否相關聯，用於評價預先未進行CRC診斷的患者。
結直腸癌最經常由腺瘤(息肉)發展為惡性腫瘤。CRC的不同分期常常按照Dukes的A-D期分期。
癌症分期是根據程度、發展和嚴重性對疾病分級。其將癌症患者分組，以使預後和治療選擇普遍化。
目前，TNM系統最廣範地被用於對癌症的解剖學程度進行分期。其代表了國際公認的一致的分期系統。有三種基本變量T(原發腫瘤程度)、N(區域淋巴結狀況)和M(有或沒有遠處轉移)。TNM標準公開於UICC(International Union Against Cancer)，Sobin，L.H.，Wittekind，Ch.(eds)TNM Classification of Malignant Tumours，fifthedition，1997。
尤其重要地是，CRC的早期診斷轉化為非常好的預後。結直腸惡性腫瘤由良性腫瘤產生，即由腺瘤產生。因此，最好的預後是那些在腺瘤階段確診的患者。早在T1S、N0、M0期或T1-3、N0、M0期確診的患者如果治療適當的話，其在診斷後存活5年的機率超過90％，相比之下已出現遠處轉移時確診的患者的5年存活率只有10％。
在本發明的意義上，CRC的早期診斷是指在惡性前腫瘤狀態(腺瘤)或在根本未出現轉移(無論是鄰近還是遠距離，即腺瘤、T1S、N0、M0或T1-4、N0、M0)的腫瘤期確診。T1S代表原位腫瘤。
在一個優選的實施方案中，PSE3用於診斷早在腺瘤期的CRC。
進一步優選診斷出CRC時其尚未完全生長過腸壁，因此既沒有使腹膜髒層穿孔，也沒有侵入其它器官和結構，即在T1S、N0、M0期或T1-3、N0、M0(＝T1S-3、N0、M0)期確診。
本發明的診斷方法基於個體來源的液體樣品。與本領域已知的方法不同，PSE3是通過使用特異性結合物由該液體樣品中特異性檢出。
特異性結合物為例如PSE3受體、結合PSE3的凝集素或PSE3抗體。特異性結合物與其對應靶分子的親和性至少為107l/mol。特異性結合物與其靶分子的親和性優選為108l/mol，或更優選為109l/mol。技術人員應當認識到，術語特異性用於表示樣品中存在的其它生物分子不明顯結合PSE3特異性結合物。結合靶分子以外的生物分子的水平產生的結合親和性優選僅為靶分子親和性的10％，更優選僅為靶分子親和性的5％或更少。最優選的特異性結合物既實現以上的親和性最低標準，也實現特異性最低標準。
特異性結合物優選為PSE3反應性抗體。術語抗體指多克隆抗體、單克隆抗體、這些抗體的片段以及含抗體結合結構域的遺傳構建物。
任何保持以上特異性結合物標準的抗體片段都可以使用。抗體通過本領域公開的方法生產，例如Tijssen(Tijssen，P.，Practice andtheory of enzyme immunoassays 11(1990)全書，尤其是第43-78頁；Elsevier，Amsterdam)描述的方法。另外，技術人員完全了解基於免疫吸收劑的方法可用於抗體的特異性分離。利用這些方法可提高多克隆抗體的質量，並由此增強其在免疫實驗中的效能(Tijssen，P.，出處同上，108-115頁)。
為實現本發明公開的內容，使用在兔中產生的多克隆抗體。但是，很明顯，也可以使用其它物種例如大鼠或豚鼠的多克隆抗體以及單克隆抗體。因為單克隆抗體可以需要的任意量生產，並具有穩定的特性，所以它們是開發臨床途徑實驗的理想工具。在本發明方法中，PSE3單克隆抗體的生產和使用是又一個優選實施方案。
現在，技術人員應當認識到，PSE3已經被確定為有效診斷CRC的標記物，使用替代方法可達到和本發明成果相當的結果。例如，可使用替代策略生產抗體。這樣的策略其中包括使用合成肽，該肽具有PSE3表位，用於免疫。或者，可使用又稱為DNA接種的DNA免疫。
為進行檢測，在適於形成結合物-PSE3複合體的條件下，使得自個體的液體樣品和PSE3特異性結合物溫育。這樣的條件不必指定，因為技術人員不需要創造性勞動就可以輕易確定這樣的合適溫育條件。
作為本發明公開方法的最後一步，檢測複合體的量，並將其與CRC診斷相關聯。技術人員應當認識到，有眾多方法來檢測特異性結合物-PSE3複合體的量，其全部細節都描述在相關的教科書(參閱例如Tijssen P.，出處同上，或Diamandis，et al.，eds.(1996)Immunoassay，Academic Press，Boston)中。
優選以夾心型實驗形式檢測PSE3。在這樣的實驗中，使用第一種特異性結合物將PSE3捕獲在一側，在另一側使用第二種特異性結合物，其被標記得可直接或間接檢測。
如上所述，已經令人驚奇地發現，可檢測得自個體樣品的液體樣品中的PSE3。在CRC診斷中應用標記物PSE3不需要組織和活組織檢查樣品。
在一個優選實施方案中，用血清作為液體樣品材料實施本發明的方法。
在進一步優選的實施方案中，用血漿作為液體樣品材料實施本發明的方法。
在進一步優選的實施方案中，用全血作為液體樣品材料實施本發明的方法。
此外，可以技術人員已知的各種方法製備糞，同樣獲得液體樣品。這種來源於糞的樣品液體也代表了本發明的優選實施方案。
對組織樣品應用常規蛋白酶體方法導致鑑別出選定組織的多種潛在標記侯選物，但本發明的發明人令人驚奇地能檢測體液樣品中的蛋白PSE3。甚至更令人驚奇地是，他們能夠證明，在得自個體的這種液體樣品中存在的PSE3可與結直腸癌診斷相關聯。
具有巨大優勢的PSE3抗體可用於建立方法，例如在原位、活組織檢查中或免疫組織學方法中檢測結直腸癌細胞。
PSE3抗體優選用於定性(PSE3存在與否)或定量(測定PSE3量)免疫實驗。
檢測蛋白PSE3水平已被證實在CRC領域非常有優勢。因此，在進一步優選的實施方案中，本發明涉及使用蛋白PSE3作為標記分子，用於由得自個體的液體樣品診斷結直腸癌。
術語標記分子用於表示根據個體體液檢測，分析物PSE3的水平增加標誌著存在CRC。
特別優選在結直腸癌的早期診斷中使用新標記物PSE3。
蛋白PSE3本身的使用代表著挑戰CRC診斷領域的顯著進步。聯合檢測PSE3和其它已知標記物如CEA或迄今已發現的其它CRC標記物，獲得了進一步的改進。因此，在進一步優選的實施方案中，本發明涉及在由得自個體的液體樣品診斷結直腸癌時聯合使用為結直腸癌標記分子的PSE3和一種或多種結直腸癌標記分子。在這點上，表述「一種或多種」代表1-10種，優選1-5種，更優選3種。可與PSE3檢測組合的其它CRC標記物優選為CEA、CA 19-9、CA 72-4和/或CA 242。因此，本發明非常優選的實施方案是在由得自個體的液體樣品診斷結直腸癌時使用為結直腸癌標記分子的蛋白PSE3連同一種或多種結直腸癌標記分子，其中至少一種其它標記分子選自CEA、CA 19-9、CA 72-4和CA 242。非常優選標記物PSE3和CEA聯用。
在特異性結合實驗如免疫實驗領域中的診斷試劑，通常最好以試劑盒的形式提供，其含有特異性結合物和進行實驗需要的輔助試劑。本發明因此還涉及免疫學試劑盒，其含有至少一種PSE3特異性結合物和用於檢測PSE3的輔助試劑。
檢查的受試者操作特徵曲線(ROC)最好地描述了檢查的準確度(特別參見Zweig，M.H.，and Campbell，G.，Clin.Chem.39(1993)561-577)。ROC圖是全部敏感性/特異性對的曲線，其由觀測數據完整範圍內不斷變化的判斷閾值產生。
實驗室檢查的臨床效能取決於其診斷準確度或正確將患者分類成臨床相關亞組的能力。診斷準確度衡量檢查正確分辨所研究患者的兩種不同狀況的能力。這樣的狀況例如為健康和疾病或良性對惡性疾病。
在每種情況下，通過在完整判斷閾值範圍內畫出敏感性對1-特異性的曲線，ROC圖都描繪出了兩種分布之間的重疊。在y軸上為敏感性或真陽性率[定義為(真陽性檢查結果數)/(真陽性檢查結果數+假陰性檢查結果數)]。這也稱為在疾病或病症存在下的陽性。其僅僅是由受感染亞組計算出來。在x軸上為假陽性率，或1-特異性[定義為(假陽性結果數)/(真陰性結果數+假陽性結果數)]。其是特異性的指標，完全由未感染亞組計算出來。因為真陽性和假陽性率完全獨立地通過使用兩個不同小組的檢查結果計算出來，所以ROC曲線與樣品中疾病的發病率無關。ROC曲線上的每個點都代表對應於特定判斷閾值的敏感性/-特異性對。具有理想辨別力的檢查(兩種分布結果之間無重疊)的ROC曲線經過左上角，其真陽性率為1.0，即100％(理想的敏感性)，而假陽性率為0(理想的特異性)。無辨別力的檢查(兩組的分布結果一致)的理論曲線為從左下角至右上角的45°對角線。大多數曲線處於這兩個極端之間。(如果ROC曲線完全處於45°對角線以下，則其很容易通過將「陽性」標準由「大於」轉變為「小於」而矯正，反之亦然)。定性地看，曲線越接近於左上角，檢查的整體準確度越高。
定量實驗室檢查的診斷準確度的一個便利目標是以單個數字表示其效力。最常見的整體檢測是ROC曲線下面積。根據慣例，該面積經常≥0.5(如果不是，可倒轉決策規則使其是)。值位於1.0(兩組的檢查值完全分開)和0.5(兩組檢查值之間沒有顯著的分布差異)之間。面積不僅僅取決於曲線的特定部分，例如最接近對角線的點或90％特異性的敏感性，而是取決於整條曲線。這是ROC曲線如何接近理想曲線(面積＝1.0)的定量描述性表達。
使用受試者操作特徵曲線分析(ROC；Zweig，M.H.，and Campbell，G.，Clin.Chem.39(1993)561-577)，評價新標記物PSE3與已確立的標記物CEA相比或組合的臨床效用。該分析基於意義明確的患者群，其由50個各自分別得自T1-3、N0、M0期患者、更惡化的腫瘤即T4和/或各種嚴重程度的轉移(N+和/或M+)以及健康對照的樣品組成。
提供以下的實施例、參考文獻、序列表和圖是為了幫助理解本發明，其真正範圍在所附權利要求書中提出。要理解地是，可對所提出的方法進行修改，而不偏離本發明的精神。


圖1結腸腫瘤組織中PSE3的鑑別，其表觀分子量約為30kDa，等電點約為pH 5.5(較高處)。圖1顯示了用腫瘤樣品上樣的2D-凝膠(左側)和用得自鄰近健康黏膜的相配對照樣品上樣的凝膠(右側)的典型實例。這些凝膠的放大部分中的圖表示蛋白PSE3的位置。該蛋白用相同方法在健康黏膜中無法檢測到。標示的蛋白斑在對照和腫瘤組織中以相同的程度明顯存在。這是由於以下事實經常在和腫瘤組織中的ANX4(膜聯蛋白4)相同的蛋白斑處鑑別出PSE3。PSE3(剪接變體2)(31kDa/5.79)和ANX4(35kDa/5.85)的MW和PI非常相似，這解釋了這種表觀上的共遷移。PSE3從未在該蛋白斑中被鑑別出來，也沒有在對照凝膠中的任何其它蛋白斑中被鑑別出來，但PSE3專門在腫瘤組織中表達。
圖2蛋白質印跡的典型實例。用4名患者(患者34結腸癌，DukesB；患者36直腸癌，Dukes B；患者37直腸癌，Dukes A；和患者39結腸癌，Dukes A)的結直腸腫瘤組織和鄰近健康對照組織的組織裂解物上樣聚丙烯醯胺凝膠，在電泳後將蛋白印跡在硝酸纖維素膜上。使用多克隆兔抗PSE3血清測試樣品中PSE3的存在情況。含腫瘤裂解物的泳道用「T」表示，含正常對照組織的泳道用「N」表示。箭頭表示凝膠中PSE3條帶的位置。所有的腫瘤樣品都在PSE3位置產生強烈信號，而在鄰近正常對照組織的裂解物中僅可檢測到微弱信號。
簡寫ABTS 2，2′-連氮基-雙-[3-乙基苯並噻唑啉磺酸(6)]二銨鹽BSA 牛血清白蛋白cDNA 互補DNACHAPS(3-[(3-膽醯氨基丙基)-二甲銨]-1-丙磺酸鹽)DMSO 二甲基亞碸
DTT 二硫蘇糖醇EDTA 乙二胺四乙酸ELISA酶聯免疫吸附實驗HRP 辣根過氧化物酶IAA 碘乙醯胺IgG 免疫球蛋白GIEF 等電聚焦IPG 固定化pH梯度LDS 十二烷基硫酸鋰MALDI-TOF基體輔助雷射解吸/電離-飛行時間質譜MES 三甲苯基，2，4，6-三甲苯基OD 光密度PAGE 聚丙烯醯胺凝膠電泳PBS 磷酸緩衝鹽水PI 等電點RTS 快速表達系統SDS 十二烷基硫酸鈉實施例1鑑別PSE3為潛在的結直腸癌標記物組織來源為鑑別作為潛在結直腸癌診斷標記物的腫瘤特異性蛋白，使用蛋白酶體方法對三種不同組織進行分析。
總而言之，分析10名患結直腸癌的患者的組織標本。對於每名患者，由治療性切除物收集三種不同的組織類型腫瘤組織(＞80％腫瘤)(T)、鄰近健康組織(N)和鄰近健康黏膜的剝離黏膜(M)。後兩種組織類型用作相配的健康對照樣品。在切除後立即將組織速凍，並在處理前儲存於-80℃。用組織病理學標準診斷腫瘤。
組織製備將0.8-1.2g冷凍組織放入臼中，並利用液氮完全冷凍。將組織在臼中研磨成粉，並溶解在10倍體積(w/v)的裂解緩衝液(40mM檸檬酸鈉、5mM MgCl2、1％ Genapol X-080、0.02％疊氮化鈉、無EDTA的Complete[Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany，目錄號1873580])中，隨後在Wheaton玻璃均質機(20x松配合(fitting)，20x緊配合)中勻漿。以4500xg對3ml勻漿液進行1小時的蔗糖密度離心(10-60％蔗糖)。在此離心步驟後，獲得三種組分。梯度頂層級分含可溶性蛋白，將其用於進一步的分析。
等電聚焦(IEF)和SDS-PAGE對於IEF，將3ml懸浮液與12ml樣品緩衝液(7M尿素、2M硫脲、2％ CHAPS、0.4％ IPG緩衝液pH 4-7、0.5％ DTT)混合，並溫育1小時。將樣品在AmiconUltra-15裝置(Millipore GmbH，Schwalbach，Germany)中濃縮，使用Bio-Rad蛋白實驗(目錄號500-0006；Bio-Rad Laboratories GmbH，München，Germany)按照供應商的說明測定蛋白濃度。向相當於1.5mg蛋白樣品的體積中加入緩衝液，至終體積為350μl。該溶液用於過夜再水合IPG條帶pH 4-7(Amersham Biosciences，Freiburg，Germany)。使用以下的梯度方案進行IEF1.)1分鐘達到500V；2.)2小時達到3,500V；3.)3,500V穩定22小時，產生82kVh。在IEF後，將條帶儲存於-80℃，或直接用於SDS-PAGE。
在SDS-PAGE前，將條帶在平衡緩衝液(6M尿素、50mMTris/HCl、pH 8.8、30％甘油、2％ SDS)中溫育，對於還原，加入DDT(15分鐘，+50mg DTT/10ml)，對於烷基化，加入IAA(15分鐘，+235mg碘乙醯胺/10ml)。將條帶放在12.5％聚丙烯醯胺凝膠上，並以1W/凝膠電泳1小時，然後以17W/凝膠電泳。隨後，固定(50％甲醇、10％乙酸鹽)凝膠，並用NovexTM膠體藍染色試劑盒(Invitrogen，Karlsruhe，Germany，目錄號LC6025，45-7101)染色過夜。
檢測為結直腸癌潛在標記物的PSE3通過用ProteomeWeavers軟體(Definiens AG，Germany，Munchen)進行影像分析，獨立地分析每名患者。另外，凝膠的所有蛋白斑都通過挑選機器人切除，蛋白斑中存在的蛋白通過MALDI-TOF質譜鑑別(UltraflexTMToF/ToF，Bruker Daltonik GmbH，Bremen，Germany)。對於每名患者，將腫瘤樣品的4個凝膠與鄰近正常和剝離黏膜組織的各自4個凝膠進行對比，並分析對應於差異表達蛋白的不同蛋白斑。利用這種方法，發現蛋白PSE3在腫瘤組織中特異性表達或強烈過表達，而在健康對照組織中未檢測到或不太強烈地表達。因此，其和許多其它蛋白一道，有資格成為用於結直腸癌診斷的候選標記物。
實施例2生產結直腸癌標記蛋白PSE3的抗體生產結直腸癌標記蛋白PSE3的多克隆抗體，通過免疫檢測實驗如蛋白質印跡或ELSIA，進一步使用這些抗體檢測血清、血漿和血液的PSE3水平。
在大腸桿菌中表達的重組蛋白為了生產抗PSE3抗體，進行蛋白重組表達，以獲得免疫原。使用RTS 100表達系統和大腸桿菌的組合進行表達。在第一步中，分析DNA序列，使用「ProteoExpert RTS E.coli HY」系統獲得推薦的高產量cDNA沉默突變體和各自的PCR引物序列。這是一個基於商業站點的服務(www.proteoexpert.com)。使用推薦的引物對，使用「RTS100大腸桿菌線性模板生產裝置，His-tag」(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany，目錄號3186237)系統，由cDNA生產線性PCR模板，用於PSE3蛋白編碼核苷酸序列的體外翻譯和表達。為了蛋白質印跡檢測和隨後的純化，表達的蛋白含His-tag。鑑別出最佳表達的變體。由PCR至表達和檢測的所有步驟都按照生產商的說明進行。各自的PCR產物含所有必需的T7調節區(啟動子、核糖體結合位點和T7終止子)，按照生產商的說明將其克隆入pBAD TOPO載體(Invitrogen，Karlsruhe，Germany，目錄號K 4300/01)中。為使用T7調節序列進行表達，將構建物轉化入大腸桿菌BL 21(DE 3)(Studier，F.W.，et al.，Methods Enzymol.185(1990)60-89)中，轉化的細菌以1L批次培養，用於蛋白表達。
按照標準方法在Ni-螯合柱上進行His-PSE3融合蛋白純化。簡而言之，通過離心沉澱1L含His-PSE3融合蛋白表達載體的細菌培養物。將細胞沉澱重懸浮在裂解緩衝液中，該裂解緩衝液含磷酸鹽pH8.0、7M鹽酸胍、咪唑和硫代甘油，接著使用Ultra-Turraxe勻漿。通過高速離心沉澱不溶性物質，將上清液上Ni-螯合層析柱。用幾個柱床體積的裂解緩衝液衝洗柱，接著用含磷酸鹽pH 8.0和尿素的緩衝液衝洗。最後，使用含SDS的磷酸鹽緩衝液在酸性條件下洗脫結合的抗原。
生產抗PSE3的單克隆抗體a)免疫小鼠首先用100μg PSE3腹膜內免疫12周齡的A/J小鼠。在6周後接著再進行兩次間隔1個月的腹膜內免疫。在此過程中，每隻小鼠都給予100μg吸附至氫氧化鋁的PSE3和109g百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)。隨後，每次使用100μg PSE3的PBS緩衝液在融合前第3天和第2天靜脈內進行最後兩次免疫接種。
b)融合和克隆按照Galfre，G.，and Milstein，C.，Methods in Enzymology 73(1981)3-46所述，將按照a)免疫的小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞融合。在該過程中，將免疫小鼠的約1×108脾細胞與2×107骨髓瘤細胞(P3X63-Ag8-653，ATCC CRL1580)混合併離心(300xg，10分鐘，4℃)。然後用無胎牛血清(FCS)的RPMI 1640培養基漂洗細胞1次，並在50ml圓錐管中以400xg再離心。廢棄上清液，通過輕敲溫和地使細胞沉澱鬆散，加入1ml PEG(分子量4000，Merck，Darmstadt)，通過移液操作混合。在37℃水浴中1分鐘後，於室溫在4-5分鐘內滴加5ml無FCS的RPMI 1640。此後，在約1分鐘內滴加入5ml含10％ FCS的RPMI 1640，徹底混合，用培養基(RPMI 1640+10％ FCS)補充至50ml，隨後以400xg於4℃離心10分鐘。將沉澱的細胞由含10％ FCS的RPMI 1640中取出，並接種在次黃嘌呤-重氮絲氨酸選擇培養基(100mmol/l次黃嘌呤、1μg/ml重氮絲氨酸的RPMI 1640+10％ FCS溶液)中。向培養基中加入100U/ml的白介素6作為生長因子。
大約10天後，測試初級培養物的特異性抗體。利用螢光活化細胞分揀儀在96孔細胞培養板中克隆PSE3陽性初級培養物。在該過程中，再加入100U/ml的白介素6作為生長因子。
c)由細胞培養物上清液分離免疫球蛋白將獲得的雜交瘤細胞以1×105細胞/ml密度接種在含10％ FCS的RPMI 1640中，並在發酵罐(Thermodux Co.，Wertheim/Main，型號MCS-104XL，序號144-050)中增殖7天。在培養物上清液中獲得平均濃度為100μg/ml的單克隆抗體。通過蛋白質化學的常規方法(例如Bruck，C.，et al.，Methods in Enzymology 121(1986)587-695描述的方法)由培養物上清液進行此抗體的純化。
生產多克隆抗體a)免疫接種為進行免疫接種，以1∶1比率製備蛋白溶液(100μg/ml蛋白PSE3)和完全弗氏佐劑的新鮮乳濁液。每隻兔在第1、7、14和第30、60和90天用1ml乳濁液免疫接種。取血，獲得的抗PSE3血清進一步用於實施例3和4描述的實驗。
b)用辛酸和硫酸銨通過連續沉澱由兔血清純化IgG(免疫球蛋白G)用4體積的乙酸鹽緩衝液(60mM，pH 4.0)稀釋1體積的兔血清。用2M Tris-鹼將pH調節至4.5。在劇烈攪拌下滴加辛酸(25μl/ml的稀釋樣品)。30分鐘後，離心樣品(13,000xg，30分鐘，4℃)，廢棄沉澱，收集上清液。通過加入2M Tris-鹼將上清液pH調節至7.5，並過濾(0.2μm)。
在劇烈攪拌下，通過滴加4M硫酸銨溶液至終濃度為2M，沉澱上清液中的免疫球蛋白。通過離心(8,000xg，15分鐘，4℃)收集沉澱的免疫球蛋白。
廢棄上清液。將沉澱溶解在10mM NaH2PO4/NaOH，pH 7.5、30mM NaCl中，並徹底透析。透析液進行離心(13,000xg，15分鐘，4℃)並過濾(0.2μm)。
生物素化多克隆兔IgG用10mM NaH2PO4/NaOH，pH 7.5、30mM NaCl使多克隆兔IgG達到10mg/ml。每ml IgG溶液加入50μl生物素-N-羥基琥珀醯亞胺(3.6mg/ml的DMSO溶液)。於室溫30分鐘後，在Superdex 200(10mMNaH2PO4/NaOH，pH 7.5、30mM NaCl)上層析樣品。收集含生物素化IgG的級分。按照相同的方法生物素化單克隆抗體。
地高辛配基化多克隆兔IgG用10mM NaH2PO4/NaOH、30mM NaCl，pH 7.5使多克隆兔IgG達到10mg/ml。每ml IgG溶液加入50μl地高辛配基-3-O-甲基羰基-ε-氨基辛酸-N-羥基琥珀醯亞胺酯(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany，目錄號1 333 054)(3.8mg/ml的DMSO溶液)。於室溫30分鐘後，在Superdex200(10mM NaH2PO4/NaOH，pH 7.5、30mMNaCl)上層析樣品。收集含地高辛配基化IgG的級分。按照相同的方法用地高辛配基標記單克隆抗體。
實施例3使用實施例2生產的多克隆抗體以蛋白質印跡檢測人結直腸癌組織中的PSE3如實施例1「組織製備」所述製備腫瘤樣品和健康對照樣品的組織裂解物。
使用Invitrogen，Karlsruhe，Germany的試劑和設備進行SDS-PAGE和蛋白質印跡。對於測試的每種組織樣品，將10μg組織裂解物稀釋在還原性NuPAGE(Invitrogen)SDS樣品緩衝液中，並於95℃加熱10分鐘。樣品在MES電泳緩衝體系中在4-12％ NuPAGE凝膠(Tris-甘氨酸)上電泳。使用Invitrogen XCell IITMBlot Module(Invitrogen)和NuPAGE轉移緩衝體系將凝膠分離的蛋白混合物印跡到硝酸纖維素膜上。用PBS/0.05％ Tween-20漂洗膜3次，並用Roti-Block封閉緩衝液(A151.1；Carl Roth GmbH，Karlsruhe，Germany)封閉2小時。初級抗體多克隆兔抗PSE3血清(如實施例2所述產生)用Roti-Block封閉緩衝液以1∶10,000稀釋，並與膜溫育1小時。用PBS/0.05％ Tween-20漂洗膜6次。用POD-綴合的多克隆綿羊抗兔IgG抗體標記特異性結合的初級兔抗體，用0.5xRoti-Block封閉緩衝液稀釋至10mU/ml。溫育1小時後，用PBS/0.05％ Tween-20漂洗膜6次。為檢測結合的POD-綴合的抗兔抗體，將膜與Lumi-LightLUS蛋白質印跡底物(序號2015196，Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)溫育，並對放射自顯影膠片曝光。
典型實驗的結果示於圖2。發現在檢查的16名結直腸癌患者中，有15名患者其PSE3在腫瘤組織中相比於鄰近對照組織強烈過表達。
實施例4ELISA用於檢測人血清和血漿樣品中的PSE3為檢測人血清或血漿中的PSE3，開發了夾心ELISA。為捕獲和檢測抗原，將等份的抗PSE3多克隆抗體(參見實施例2)分別與生物素和地高辛配基綴合。
在10mM磷酸鹽，pH 7.4、1％ BSA、0.9％ NaCl和0.1％ Tween-20中，將鏈黴抗生物素蛋白包被的96孔微量滴定板與100μl的10μg/ml生物素化抗PSE3多克隆抗體溫育60分鐘。溫育後，用0.9％NaCl、0.1％ Tween-20漂洗板3次。然後將孔與連續稀釋的作為標準抗原的重組蛋白(參見實施例2)或稀釋的患者血漿樣品溫育2小時。在結合PSE3後，用0.9％ NaCl、0.1％ Tween-20漂洗板3次。為特異性檢測結合的PSE3，在10mM磷酸鹽，pH 7.4、1％ BSA、0.9％ NaCl和0.1％ Tween-20中將孔與100μl的10μg/ml地高辛配基化抗PSE3多克隆抗體溫育60分鐘。此後，漂洗板3次，以去除未結合的抗體。在下一步中，在10mM磷酸鹽，pH 7.4、1％ BSA、0.9％ NaCl和0.1％Tween-20中將孔與20mU/ml抗地高辛配基-POD綴合物(RocheDiagnostics GmbH，Mannheim，Germany，目錄號1633716)溫育60分鐘。隨後用相同的緩衝液漂洗板3次。為檢測抗原-抗體複合物，將孔與100μl ABTS溶液(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany，目錄號11685767)溫育，在30-60分鐘後用ELISA讀數器於405nm檢測OD。
實施例5根據診斷準確度評價臨床效用的ROC分析通過分析得自特徵明確的患者群的個體液體樣品，評價準確度，所述特徵明確的患者群即分別為50名進行結腸鏡檢查並發現無腺瘤或CRC的患者、50名確診並分期為T1-3、N0、M0的CRC患者和50名確診為進行性CRC的患者，進行性CRC患者至少在至少一個鄰近淋巴結具有腫瘤侵潤或具有更嚴重形式的轉移。用市售可得的實驗(Roche Diagnostics，CEA實驗(目錄號1 173 1629，用於ElecsysSystems免疫實驗分析儀)檢測CEA，並如上所述檢測PSE3，由此定量得自這些個體每一個的血清中的CEA和PSE3。按照Zweig，M.H.，and Campbell(出處同上)所述進行ROC分析。通過正則化判別分析(Friedman，J.H.，Regularized Discriminant Analysis，Journal of theAmerican Statistical Association 84(1989)165-175)計算PSE3和已確立標記物CEA的組合區分T1s-3、N0、M0組患者和健康個體的判別力。
初步的數據表明，PSE3還可能對手術後患者的隨訪非常有幫助。
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序列表110霍夫曼-拉羅奇有限公司(F.Hoffmann-La Roche AG)120蛋白類蛋白酶體激活劑亞基3(PSE3)作為結直腸癌標記物的用途13021882150EP 03017582.21512003-08-081602170PatentIn version 3.22101211254212PRT213智人(Homo sapiens)220
221MISC_FEATURE223蛋白酶體活化蛋白亞基3，同工型4001Met Ala Ser Leu Leu Lys Val Asp Gln Glu Val Lys Leu Lys Val Asp1 5 10 15Ser Phe Arg Glu Arg Ile Thr Ser Glu Ala Glu Asp Leu Val Ala Asn20 25 30Phe Phe Pro Lys Lys Leu Leu Glu Leu Asp Ser Phe Leu Lys Glu Pro35 40 45Ile Leu Asn Ile His Asp Leu Thr Gln Ile His Ser Asp Met Asn Leu50 55 60Pro Val Pro Asp Pro Ile Leu Leu Thr Asn Ser His Asp Gly Leu Asp65 70 75 80
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221MISC_FEATURE223蛋白酶體活化蛋白亞基3，同工型4002Met Ala Ser Leu Leu Lys Val Asp Gln Glu Val Lys Leu Lys Val Asp1 5 10 15Ser Phe Arg Glu Arg Ile Thr Ser Glu Ala Glu Asp Leu Val Ala Asn20 25 30Phe Phe Pro Lys Lys Leu Leu Glu Leu Asp Ser Phe Leu Lys Glu Pro35 40 45Ile Leu Asn Ile His Asp Leu Thr Gln Ile His Ser Asp Met Asn Leu50 55 60Pro Val Pro Asp Pro Ile Leu Leu Thr Asn Ser His Asp Gly Leu Asp65 70 75 80Gly Pro Thr Tyr Lys Lys Arg Arg Leu Asp Glu Cys Glu Glu Ala Phe85 90 95Gln Gly Thr Lys Val Phe Val Met Pro Asn Gly Met Leu Lys Ser Asn100 105 110Gln Gln Leu Val Asp Ile Ile Glu Lys Val Lys Pro Glu Ile Arg Leu115 120 125Leu Ile Glu Lys Cys Asn Thr Pro Ser Gly Lys Gly Pro His Ile Cys130 135 140Phe Asp Leu Gln Val Lys Met Trp Val Gln Leu Leu Ile Pro Arg Ile145 150 155 160Glu Asp Gly Ash Ash Phe Gly Val Ser Ile Gln Glu Glu Thr Val Ala165 170 175
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1.一種結直腸癌的診斷方法，所述方法包括以下步驟a)提供得自個體的液體樣品，b)在適於蛋白酶體激活蛋白亞基3(PSE3)特異性結合物和PSE3形成複合體的條件下，使所述樣品與所述結合物接觸，c)將(b)中形成的複合體的量與結直腸癌診斷相關聯。
2.權利要求1的方法，其進一步的特徵在於所述樣品是血清。
3.權利要求1的方法，其進一步的特徵在於所述樣品是血漿。
4.權利要求1的方法，其進一步的特徵在於所述樣品是全血。
5.蛋白PSE3的用途，所述蛋白在由得自個體的液體樣品進行的結直腸癌診斷中用作標記分子。
6.蛋白PSE3的用途，所述蛋白在由得自個體的液體樣品進行的結直腸癌早期診斷中用作標記分子。
7.權利要求6的用途，其中所述早期診斷用來源於腺瘤期CRC患者的樣品進行。
8.權利要求6的用途，其中所述早期診斷用來源於T1S-3、N0、M0期CRC患者的樣品進行。
9.蛋白PSE3的用途，所述蛋白作為結直腸癌標記分子與另一種結直腸癌標記分子聯用於由得自個體的液體樣品進行的結直腸癌診斷。
10.一種免疫學試劑盒，所述試劑盒包含至少一種PSE3特異性結合物和用於檢測PSE3的輔助試劑。
全文摘要
本發明涉及結直腸癌診斷。本發明公開了蛋白PSE3(蛋白酶體激活蛋白亞基3)在結直腸癌診斷中的用途。本發明涉及通過檢測來源於個體的液體樣品中的PSE3而由所述樣品診斷結直腸癌的方法。PSE3檢測例如可用於結直腸癌的早期檢測或診斷。
文檔編號G01N33/574GK1833170SQ200480022266
公開日2006年9月13日 申請日期2004年8月6日 優先權日2003年8月8日
發明者M·塔克, P·伯恩德特, M·-L·哈格曼, J·卡爾, H·蘭根, S·帕爾梅, M·勒斯勒, W·羅林格爾, W·措爾格 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司