天山雪蓮sikRbcS2基因在培育抗寒植物中的應用的製作方法
2023-10-11 22:14:54
專利名稱：天山雪蓮sikRbcS2基因在培育抗寒植物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種從菊科鳳毛菊屬植物天山雪蓮(Saussurea involucrata Kar. et Kir)中克隆得到sikRbcS2基因，構建組成型植物表達載體，轉化植物，並對抗寒效果進行 評價，增加植物的抗寒性能。
背景技術：
低溫是危害農業生產的主要自然災害之一。低溫脅迫可使植物光合作用降低，呼 吸作用增強，能量產生和物質合成受阻，消耗增強，植物處於飢餓狀態，嚴重影響了植物的 正常生長發育，甚至導致死亡(郭子武，李憲利等，植物低溫脅迫響應的生化與分子生物學 機制研究進展，中國生態農業學報，2004，12 (2) 54-57)。提高植物的抗寒性是科技工作者亟待解決的問題。從18世紀末開始，許多科學 工作者對植物抗寒凍害機理進行了研究，相繼提出了 「生理乾旱」、「飢餓」、「代謝失調」、「毒 物積累」和「膜脂相變」等假說(馬建忠.膜脂與植物的抗寒性[J].生物技術通報.1997， (2) 6-9)，至20世紀下葉，隨著分子生物技術的發展，對植物寒凍害及抗寒凍機理的研究 進一步深入，並分離和鑑定了植物抗寒凍相關基因(馬建忠.植物的冷誘導基因[J].農業 生物技術學報.1996，4(1) :8-14)。低溫對植物細胞中多種酶活性有著明顯的影響。至於共影響的機制， Guy (Guy GL.Cold acclimationand freezing stress tolerance :role of protein metabolism[J]. Ann Rev Plant Physiol. 1990，41 :187-223)認為可能是由於其三級或四 級結構的破壞，明顯地改變了 PH值和離子強度，類囊體膜的蛋白質釋放出來造成膜酶複合 物的解離或者通過分子間的聚集(如形成二硫鏈)而導致酶與蛋白鈍化。當組織結冰脫水 時，巰基(-SH)減少，而二硫鍵(-S-S-)增加。二硫鍵是由於蛋白質分子內部失水或相鄰蛋 白質分子的巰基失水而形成的。當解凍再度失水時，肽鏈鬆散，氫鍵斷裂，但-S-S-鍵還保 存，肽鏈的空間位置發生變化，蛋白質分子的空間構象改變，因而蛋白質結構被破壞，進而 弓I起細胞的傷害禾口死亡(Levitt J. Responses of Plants to Environmental Stress [M]. New York =Academic Press. 1972，697)。例如，C4植物光合過程中的關鍵酶丙酮酸磷酸雙 激酶在低溫條件下由四聚體變為二聚體，導致活性喪失；核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶，在低 溫下發生構像的可逆變化，使其內部疏水基外露，導致功能喪失。另外，有許多研究表明，低 溫也可通過影響酶的數量以及同功酶譜等來影響其活性(沈曼，王明麻，董敏仁.植物抗寒 機理研究進展[J].植物學通報.1997，14(2) :1-8)。這些冷感酶類經冷馴化後，其敏感性 降低，活性增加，抗寒凍性也不同程度提高(Schaffer MA,Fischer RL. Analysis of mRNAs thataccumulate in response to low temperature identifies a thiolprotease gene in Tomato [J], Plant Physiol. 1988，87 :431_436)。還有一些酶類在寒凍過程中，可以通過 變構調節正向調控其動力學行為，以達到克服低溫的鈍化作用。Rubisco (1，5-二磷酸核酮糖羧化酶 / 加氧酶，ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase)是光合碳代謝中的關鍵酶，催化1，5_ 二磷酸核酮糖和CO2生成二分子3-磷酸甘油酸反應的酶，亦稱羧基歧化酶，可由Mg離子的存在被激活。1，5- 二磷酸核 酮糖羧化酶/加氧酶是光合作用中固定CO2的酶，是催化卡爾文循環中的CO2固定的第一步 反應Rubp和CO2反應生成3-磷酸甘油酸；該酶也同時催化光呼吸作用的第一步，使Rubp 和O2反應生成3-磷酸甘油酸和磷酸乙醇酸。處於光合碳還原和光合碳氧化這兩個方向相 反但又相互連鎖的循環的交叉點上，調節著光合作用和光呼吸的代謝比例，它對淨光合速 率起者決定性的影響，是光合碳同化的關鍵酶。其活性大小對光合速率起著決定性作用。在 所有自養性生物中都有所發現。作為新疆的特色植物，新疆雪蓮(Saussurea involucrata Kar. et Kir)，又名天 山雪蓮、雪蓮花等。屬菊科鳳毛菊屬，主要生長於海拔2400 4100m的高山草甸、高山冰磧 石和流石灘石隙、懸崖峭壁石縫等處。那裡氣候多變，冷熱無常，雨雪交替，最高月平均溫 3 5°C，最低月平均溫-19 -21 °C，年降水量約800毫米，無霜期僅有50天左右。天山雪蓮經過長期的自然選擇，形成了穩定的特殊結構、功能和遺傳基因，產生了 適應極端環境條件下的生理和生化機制，這種與環境相適應的機制，與一般的耐冷、抗寒應 答性的適應機制不同，主要表現在其低溫條件下能夠正常的生長發育，而一般的抗寒性植 物在相應的低溫條件下，生長發育受到抑制。
發明內容
本發明的一個目的是為植物抗寒育種提供有價值的Rubisco基因sikRbcS2，其發 明的目還在於構建植物表達載體PCAMBIA2301-SikRbcS2，在轉基因植物中得到表達，提高 轉基因植物的抗寒性，通過該基因的過量表達，使植物的抗低溫脅迫性能得到提高，最終獲 得抗(耐)低溫能力明顯增強的植物。本發明的目的是通過以下過程和方法實現的本發明所述的從天山雪蓮中克隆sikRbcS2基因，其序列為1。本發明的從天山雪蓮中克隆sikRbcS2基因的過程如下以天山雪蓮cDNA文庫單克隆質粒為模板，用RPl其序列為2和RP2其序列 為3為引物進行擴增，得到目的基因；sikRbcS2基因植物表達載體構建構建植物表達載體pCAMBIA2301_sikRbcS2 ；利用上述基因構建植物表達載體，通過農桿菌介導法遺傳轉化獲得抗寒轉基因植 物轉sikRbcS2基因菸草進行低溫處理後光化學效率分析，可分成三個等級(高，中， 低)，這與sikRbcS2基因插入菸草基因組中不同位置有關，導致基因的表達量有所不同，引 起低溫處理後光化學效率有所不同。其光化學效率並不是和溫度直接相關。轉sikRbcS2基因菸草從室溫降至0°C的過程中，轉基因菸草和對照菸草的電導率 差異較小(1%左右)；當溫度降至0°c，轉sikRbcS2菸草電導率低於對照菸草7%;在-2°c 時，轉sikRbcS2菸草電導率則低於對照菸草92%。轉sikRbcS2基因菸草在低溫下表現出 極強的抗性，提高植物的光合作用，提高植物的抗寒性。本發明不僅得到天山雪蓮Rubisco基因sikRbcS2，而且將其構建成的植物表達載 體，在轉基因植物中研究了該基因在提高植物耐低溫性能中的重要功能。這對於揭示雪蓮 的抗寒機理，豐富植物抗寒分子生物學理論，提高植物的耐低溫能力，具有重要的意義。
圖 1 是天山雪蓮 sikRbcS2 基因 PCR 擴增圖 Figl :sikRbcS2gene PCR amplified圖 2 是 pUCm-sikRbcS2 酶切鑑定圖 Fig2 =Restriction enzyme digestion identification of pUCm_sikRbcS2圖 3 是 pCAMBIA1301-sikRbcS2 PCR 鑑定 Fig3 :PCR identification of pCAMBIA1301-sikRbcS2圖 4 是 pCAMBIA2301-sikRbcS2 PCR 鑑定 Fig4 :PCR identification of pCAMBIA2301-sikRbcS圖 5 是 pCAMBIA2301-sikRbcS2 酶切鑑定 Fig5 =Restriction enzyme digestion identification ofpCAMBIA2301-sikRbcS2圖 6 是 pCAMBIA2301-sikRbcS2 轉化 AGL1PCR 鑑定 Fig6 :PCR identification ofpCAMBIA2301-sikRbcS2-AGLl圖 7 是 pCAMBIA2301-sikRbcS2 轉化菸草 PCR 檢測 Fig7 :PCR identification of pCAMBIA2301-sikRbcS2transformed tobacco圖 8 是轉基因菸草 RT-PCR 分析 Fig8 :RT-PCR analysis on transgenic tobacco圖9是溫度處理對不同菸草Fv/Fm的影響，圖中數據為三個重複的平均值 + S. EFig 9 :Effect of temperature treatment on the Fv/Fm in different tobacco, Resultasmeans士S. Ε. (η = 3)圖10 是sikRbcS2基因轉化菸草葉片相對電導率的測定FiglO =Relative conductivity of tobaccoleaves圖11是天山雪蓮sikRbcS2植物表達載體pCAMBIA2301_sikRbcS2的構建流程 1 中1,2 :sikRbcS2 ；3 陰性對照；M =Marker圖2 中1,2 :pUCm-sikRbcS2 ；3 :plasmid ；M =Marker III ；圖 3 中1 陰性對照；2-4 :pCAMBIA1301-sikRbcS2 ；M =Marker III圖 4 中1 陰性對照；2-4 :pCAMBIA2301-sikRbcS2 ；M =Marker III圖 5 中1 jplasmid ；2-5 :pCAMBIA2301-sikRbcS2 ；M =Marker圖 6 中1 陰性對照；2-6 :pCAMBIA2301-sikRbcS2-AGLl ；M =Marker圖7 中1 :Negetive control ；2 :positive control ；3-12 :Transgenic tobacco ；M MarkerIII圖 8 中1 陰性對照；2-5 :pCAMBIA2301-sikRbcS2 轉化菸草；M =Marker
具體實施例方式實驗所涉及的藥品瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒為上海生工公司生產；LA PCRTM in vitro CloningKit 購自 TaKaRa 公司；RNA 酶、Taq 酶、T4-DNA 連接酶(T4-DNA ligase)、 Marker,TRNzol總RNA提取試劑購於TIANGEN公司；限制性內切酶為Fermentas公司原裝； 抗生素購自上海Sangon公司。實施例1 天山雪蓮cDNA文庫單克隆質粒的提取取天山雪蓮cDNA文庫單克隆保存的甘油管於IOmlLB液體培養基(Cm 50 μ g/ml) 中，37°C 220rpm振蕩培養過夜。蘸取菌液於LB固體培養基(Cm 50 μ g/ml)平板上劃線培 養，37°C暗培養12-16hr。挑取單克隆於20mlLB液體培養基(Cm 50 μ g/ml)中，37°C 220rpm 振蕩培養14hr，提取質粒，具體方法如下1)將菌液分裝於1. 5ml Ep管，12000rpm離心3min，棄上清液；2)加入400ml STE溶液，重懸，12000rpm離心3min，棄上清液；3)沉澱用150 μ L鹼裂解溶液I重懸，混勻；4)加入新鮮配製的300 μ L鹼裂解溶液II，輕輕混勻，至溶液清澈；5)加入225 μ L鹼裂解溶液III，輕輕混勻，冰上放置5min ；離心(12000rpm， 5min)；6)吸取上清於另一新Ep管，加入等體積三氯甲烷，充分混勻，室溫放置5min ；離心 (10000rpm,5min)；7)小心吸取上清於另一新Ep管，加入兩倍體積無水乙醇約為850 μ L，-20°C放置 IOmin ；離心(12000rpm, 5min)；8)棄去上清，沉澱用70%乙醇洗滌兩次，室溫吹乾後溶於40 μ L TE (含RNase A 20 μ g/ml)溶液中，37°C溫育 30min。實施例2 從天山雪蓮中克隆到sikRbcS2基因以天山雪蓮cDNA文庫單克隆質粒為模板，用RPl其序列為2和RP2其序列為 3為引物進行擴增，得到目的基因；同時以去離子水為模板進行擴增作為陰性對照。RPl 為2
5 『 ttatcagtcgaaggtacgg3'
RP2 為3
5' gctttctagaccattcgttggcgcg 3'
PCR反應體系(20 μ 1)為:
10XPCR Buffer2. 0μ 1
dNTPs(各 2. 5mM)0. 5μ 1
MgC12(25mM)1. 0μ 1
上遊引物(25 μ Μ)0. 5μ 1
下遊引物(25 μ Μ)0. 5μ 1
模板 DNA (ddH20)0. 5μ 1
Taq DNA Polymerase (2. 5U,/μ 1) 0. 3ul
ddH2014. 7μ 1
Total20. 0μ 1PCR 反應程序為94°C預變性 5min ；94°C變性 30s，68°C復性 120s，30cycles ；72°C 延伸IOmin ；4°C保溫。PCR反應結束後，產物經濃度為1. 0 %的瓊脂糖凝膠電泳分離後，使用上海生工 的瓊脂糖凝膠回收試劑盒按照說明書方法分別回收目的基因，得到的目的片段命名為 sikRbcS2。如圖1所示。實施例3 構建sikRbcS2基因植物表達載體構建植物表達載體pCAMBIA1301-sikRbcS2和 pCAMBIA2301_sikRbcS2。將 PCAMBIA1301 和 pCAMBIA2301 的 E. coli DH5 α 用 Nco I/BstE II 分別雙酶切植物表達載 體，獲得載體片段。回收目的基因片段和載體片段。將目的基因片段與載體片段進行體外連 接，經鑑定正確的重組質粒分別命名為pCAMBIA1301-sikRbcS2和pCAMBIA2301_sikRbcS2。 在本實施方案中，我們選用菸草作為轉基因植物材料，也可選用其它植物作為轉基因材料。在本實施方案中，sikRbcS2基因和pCAMBIA2301構成植物表達載體，用於植物的 轉化。根據本發明的這一實施方案，構建所選用的植物表達載體除了 PCAMBIA2301之外，還 可以選用其他植物表達載體。如圖3、4、5所示。實施例4 農桿菌的轉化4. 1農桿菌感受態的製備1)從新鮮的AGLl平板上挑取一個單菌落於LB液體培養基(5ml)+Rif (50ug/ ml)+Gen(50ug/ml)中，於 28°C、200rpm 振蕩培養 48hr ；2)取 200ul 菌液於 20ml 的含 Rif (50ug/ml)及 Gen (50ug/ml)的 LB 液體培養基中 活化培養至OD6tltl = 0. 5-0. 8收集菌液，冰浴30min ；3)分裝菌液於1.5ml離心管，於4°C，6000rpm離心5min，棄盡上清，收集農桿菌細 胞；4)將沉澱的農桿菌用750ul預冷的0. 05mol/LCaCl2重懸，4 °C，8000rpm離心 5min ；5)棄上清用75ul 0.05mol/lCaCl2(10%甘油)重懸細胞，保存於_70°C。4. 2植物表達載體轉化根癌農桿菌AGLl (凍融法)1)吸取10 μ 1上述重組載體質粒(約0. 5 μ g/ μ 1)，與75 μ 1 AGLl感受態細胞輕 輕混勻，冰浴30min，然後液氮凍存5min ；2)迅速置於37°C水浴2min ；3)加入 600 μ 1 液體 LB 培養基(Rif+Gen)，28°C、200rpm 振蕩培養 5hr ；4)將上述培養液於6000rpm離心5min，收集農桿菌細胞，棄去500 μ 1液體培養 基，剩餘100 μ 1重懸細胞；5)將菌液塗布在含有 Kan 50 μ g/ml, Rif50 μ g/ml 及 Gen50 μ g/ml 的固體 LB 培 養基平板上，28°C培養24-48hr。4. 3陽性克隆篩選挑取若干單菌落，進行菌落PCR，將篩選出的陽性克隆命名為 pCAMBIA2301-sikRbcS2-AGLl。在本實施方案中，植物表達載體導入農桿菌的方法為凍融法。凍融法為本領域技術人員非常熟悉的技術操作，不是本發明的關鍵。通過PCR檢測陽性的農桿菌菌株，用於轉 化植物。如圖6所示。實施例5 菸草遺傳轉化及再生本發明中對於靶植物的轉化方法不是關鍵，可以使用本領域技術人員所熟悉的各 種不同的轉化技術將重組DNA序列導入待轉化的靶植物細胞。這些方法包括但不僅限於農 桿菌侵染法，微粒轟擊法，顯微注射法，共沉澱法，電穿孔法，以及子房注射植物受精胚囊法 等均可。本方案中用於轉化的方法，可以使用適合於其他靶植物。最好使被轉化的序列穩 定的整合到靶植物細胞的基因組中，從而使其在傳代的過程中不被丟失。另外，用於轉化靶 植物的核苷酸序列可以以線性，環形或其它重組載體的形式如人工染色體的形式存在。5. 1農桿菌浸染液的製備1)從_70°C保存的含有PCAMBIA2301-sikRbcS2-AGLl農桿菌甘油管中挑取菌塊， 接種於 5ml 附加有 Kan 50 μ g/ml，Rif50 μ g/ml，Gen 50 μ g/ml 的 LB 液體培養基中，28 °C， 200rpm振蕩培養約30hr ；2)吸取 200 μ 1 菌液，再用 20ml LB 液體培養基(Kan 50 μ g/ml，Rif50 μ g/ml，Gen 50 μ g/ml)稀釋，28°C，200rpm 振蕩培養約 4hr ；3)活化的菌液培養至OD6tltl = 0. 4-0. 6時，即為轉化用的浸染液。5. 2 浸染1)超淨工作檯上將浸染液倒入無菌培養皿中，將無菌菸草葉片剪成Icm2大小的方 塊，放入菌液中，振蕩浸染IOmin ；2)取出菸草葉片，用濾紙吸乾淨葉盤上附著的菌液；3)在共培養基(MS+6-BA2. 0mg/L+IAA0. 3mg/L)上覆一張無菌濾紙，將浸染過的葉 盤均勻地擺放在濾紙上；在26°C暗培養條件下共培養2-3天。5. 3抗性愈傷組織篩選及出芽誘導將共培養過的菸草葉盤轉移至MS+6-BA 2. Omg/L+IAA 0. 3mg/L+Kan 50mg/L+Cb 500mg/L的菸草誘導選擇培養基上，葉盤傷口充分接觸培養基。每15-20天轉接一次，轉接
1-2次以後，葉盤邊緣逐漸產生淡綠色、緻密的愈傷組織，繼續培養直至誘導出叢生芽。5. 4轉化植株的生根培養和移栽待叢生芽長至2-3cm左右時，將其切下轉接到MS+IAA 0. 3mg/L+Kan 50mg/L+Cb 500mg/L的菸草生根選擇培養基上進行生根培養。轉基因菸草15天左右開始有根生成，待根系發達時，將根系生長良好的轉化植 株，去除封口膜，室溫環境中進行煉苗7天左右，然後用水洗淨培養基，將苗轉入基質(蛭 石腐質土 = 2 1)中，26 ，16^40μπιΟ1 · πΓ2 · s—1光照，70 %相對溼度條件下培養，前
2-3天需遮陰、避光、保溼。實施例6 轉基因菸草的分子檢測6. 1轉基因菸草的PCR鑑定6. 1. 1 菸草 DNA 的提取(SDS 法)1)取0. Ig新鮮葉片，用玻棒在1. 5ml離心管內充分研磨；2)加入400 μ 1提取緩衝液，充分混勻，12000rpm離心5min ；
3)小心吸取300 μ 1上清液，加入300 μ 1異丙醇，室溫沉澱20min, 12000rpm離心 lOmin，收集沉澱；4)將沉澱充分風乾，加400 μ 1 TE溶解沉澱；5)加入400 μ 1氯仿/異戊醇(24/1)，充分混勻，靜置20min，12000rpm離心 IOmin ；6)小心吸取上清，加入40 μ 1 3麗aAC(pH5. 2), 800 μ 1無水乙醇，_20°C沉澱過夜；7)4°C，12000rpm 離心 15min，棄上清；8) 70%酒精洗滌兩次，吹乾後用30 μ 1 ddH20溶解。6. 1.2轉基因菸草的PCR鑑定以提取的轉化基因的菸草DNA為模板，用RP3其序列為4和RP4其序列為 5為引物進行擴增，同時以去離子水為模板進行擴增作為陰性對照，擴增體系如實施 例2。如圖7所示。6. 2轉基因菸草的RT-PCR檢測6. 2. 1待檢測植株總RNA的提取TIANGEN公司的TRNzol總RNA提取試劑提取已鑑定的轉基因菸草和未轉化的菸草 總 RNA 1)將研缽及所用的器具在180°C烘箱烘烤6hr以上，其餘所使用的槍頭、離心管均 使用0. 1 %的DEPC處理，高壓滅菌；2)取植物幼嫩葉片約0. Ig於研缽中，加液N充分研磨至粉末狀；3)將粉末分裝至1. 5mL的小離心管中，加入Iml的TRNzol提取試劑，充分快速混 勻，室溫放置3-5min。4) 10000rpm，4°C離心5min，吸上清至一新的離心管，加入200 μ 1氯仿，劇烈振蕩 混勻；5) 10000rpm，4°C離心5min，吸取上層液體至另一新的離心管後，加入600 μ 1預冷 的異丙醇，於_20°C沉澱30min ；6) IOOOOrpm,4°C離心IOmin後，倒掉液體，在離心管底部即可見到白色沉澱，即為 總 RNA。7)用70%的乙醇(DEPC處理)洗滌沉澱2次後，吸乾液體，吹乾後加入30 μ 1 ddH20 (DEPC處理)溶解，保存於_20°C備用。6. 2. 2cDNA 第一鏈的合成在DEPC 處理的 0. 2ml 離心管中加入 RNA 2 μ 1，dNTP (2. 5mM) 1 μ 1，Oligo dT 1μ l,ddH20 5μ 1後，在70°C水浴5min後迅速置於冰上lmin。然後在離心管中加入Rnase Inhibitor 0. 5 μ 1，AMV 反轉錄酶 0. 5 μ 1，42°C lhr,95°C 5min 後，冷卻至 4°C。7. 2. 3cDNA第二鏈的合成及擴增在PCR反應管中加入cDNA第一鏈反應產物1 μ l，5XTaq buffer 4 μ 1， MgCl2 (25mM) 1. 0μ 1，dNTP (2. 5mM) 0. 5 μ 1，上下遊引物(25ymol)各 0.5 μ 1，ddH20 補足至 20 μ 1，反應條件同實施例2。如圖8所示。實施例7 光化學效率的測定Fv/Fm是重要的螢光參數之一，習慣上稱其為PS II最大光化學效率，它是暗適應下PSII反應中心完全開放時的最大光化學效率，反映了 PS II反應中心最大光能轉換效 率。在非脅迫條件下，Fv/Fm的值很穩定，但在逆境條件下，Fv/Fm顯著降低。因此，Fv/Fm 的降低常作為發生光抑制或PSII遭受傷害的指標。本試驗採用Dual-pamlOO儀器測定，如 圖9所示。
0138]實施例8 轉基因植株的模擬寒害處理及葉片質膜透性測定
0139]轉基因植株被鑑定後，通過無性繁殖獲得無菌苗，在MS培養基上生根後。植株成 舌後選取生長一致的苗(5-7葉期)，進行模擬寒害處理。分別用打孔器從葉片中打取小圓 片測定葉片質膜透性。如圖10所示。
0140]序列表
0141]石河子大學
0142]天山雪蓮sikRbcS2基因在培育抗寒植物中的應用
0143]3
0144]1
0145]965
0146]DNA
0147] 天山雪蓮(Saurrea. involucrata Kar. et Kir.)
0148]
0149]5， UTP
0150](1). . . (142)
0151]
0152]CDS
0153](143). . . (563)
0154]
0155]3， UTP
0156](564). . . (965)
0157]1
0158]Translation of DNAMAN2(143-563)
0159]Universal code
0160]Total amino acid number :140, MW = 35075
0161]Max ORF starts at AA pos 47(may be DNA pos 143)for 140 AA(420bases), MW = 15631
0162]1 gagcgaagaa agcggccgca taacttcgta tagcatacat tatacgaagt tatcagtcga
0163]61 cggtacggga catatgcccg ggaattcggc cattacggcc ggggggattt gcaaaggcta
0164]130140 150 160170179
0165]120 ccctttaaag caaaattacc aaa atg gcc tcc ate tcc tcc tcc gcg gta gcc acc gtc
0166]40MET Ala Ser lie Ser Ser Ser Ala Val Ala Thr Val
0167]190200 210220230239
0168]180 aac egg tcc gcc tcc get caa gcc aac atg gtg get cca ttt acc ggc ctc aag tcc aac
0169]60 Asn Arg Ser Ala Ser Ala Gln Ala Asn MET Val Ala Pro Phe Thr Gly Leu Lys Ser Asn
0170]250260 270 280 290 299
100171]240gtcgccttc ccagttacc aagaaggcc aacgacttttcctcc cttCCCage aac0172]80ValAlaPhe RroValThr LysLysAla AsnAspPheSerSer LeuRroSer Asn0173]3103203303403503590174]300agagttcag tgcatgaag gtgtggcca ccaCttggattgaag aagtacgag act0175]100ArgValGln CysMETLys ValTrpRro RroLeuGlyLeuLys LysTyrGlu Hir0176]3703803904004104190177]360tacctaccc ccattaagt gaagcatcg ttggccaaggaagtg gactactta ttc0178]120TyrLeuRro RroLeuSer GluAlaSer LeuAlaLysGluVal AspTyrLeu Phe0179]4304404504604704790180]420aaatgggtt CCttgcttg gaattcgag ttggagcacggtttc gtgtaccgt gag0181]140LysTrpVal RroCysLeu GluPheGlu LeuGluHisGlyPhe ValTyr Arg Glu0182]4905005105205305390183]480teatccctg gatattatg acggaagat actggacaatgtgga agttgccta tgt0184]160SerSerLeu AsplieMET IhrGluAsp ThrGlyGlnCys Gly SerCysLeu Cys0185]550560570580590600
ggt gga Gly Gly
ctt tcg Leu Ser
cgc aac Arg Asn
cac aac His Asn
tcg ggt Ser Gly
0186]540 gca ctg att ccg ccc agg tgt tgaaggagct tgaagagtgc aagaaggagt acccgaacgc
0187]180 Ala Leu lie Pro Pro Arg Cys * * *
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0196]2
0197]20
0198]DNA
0199]人工序列
0200]2
0201]gttatcagtcgaaggtacgg
0202]3
0203]25
0204]DNA
0205]人工序列
0206]3
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0208]4
0209]22
DNA人工序列4ggcctccatctcctcctccgcg522DNA人工序列5actgattccgcccaggtgttga
權利要求
一種從天山雪蓮中克隆sik RbcS2基因，其特徵在於該基因全長965bp，其序列為1，編碼區420bp，編碼139個胺基酸，5』非編碼區142bp，3』非編碼區402bp。
2.一種利用上述基因sik RbcS2基因構建的植物表達載體。
3.一種從天山雪蓮中克隆序列為1的sik RbcS2基因的用途，其特徵在於利用上 述基因構建植物表達載體，通過遺傳轉化獲得抗寒轉基因植物。全文摘要
本發明涉及一種天山雪蓮sikRbcS2基因在培育抗寒植物中的應用，本發明從天山雪蓮中克隆sikRbcS2基因，利用上述基因構建植物表達載體pCAMBIA2301-sikRbcS2，遺傳轉化獲得抗寒逆轉基因植物。本發明從天山雪蓮中克隆sikRbcS2基因，並在轉基因植物中得到表達，提高轉基因植物的抗寒性，通過該基因的過量表達，使植物抗低溫脅迫的性能得到提高，最終獲得抗寒逆能力明顯增強的植物。
文檔編號C12N15/82GK101899459SQ20091011359
公開日2010年12月1日 申請日期2009年12月22日 優先權日2009年12月22日
發明者孫建富, 張煜星, 王愛英, 祝建波 申請人:石河子大學