一種植物耐硒蛋白及其編碼基因與應用的製作方法
2023-10-26 06:56:02 1
專利名稱：一種植物耐硒蛋白及其編碼基因與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程領域中一個植物耐硒相關基因及其編碼蛋白與應用和利用該基因增強植物耐硒的方法。
背景技術：
硒是環境中一種重要的生命元素，是人體必需的微量元素，對機體發揮著極其重要的作用。然而一方面硒在地殼中的含量相當稀少和分散，硒缺乏在全世界是一種很普遍的現象，另一方面硒汙染在某些地區也同時存在著。硒汙染的產生主要與人類的生產活動有關，它可以從一些礦業、農業、石化產品和工業製造業所產生的廢棄原料中釋放出來，從而在土壤、水體中富集形成汙染。植物、動物吸收了土壤或水體中過量的硒就會產生毒害作用，在植物、動物體內形成富集，並最終通過食物鏈對人體產生毒害作用。因此，硒的缺乏和過剩都與人的生命活動休戚相關，深入探討植物對硒耐受性機制具有重要理論意義和實踐價值。利用先進的分子生物學手段分離耐硒的抗性基因，再利用轉基因技術培育出更多的耐硒植物是未來的發展趨勢。其潛在的應用價值一方面是通過在農作物中表達硒代謝關鍵基因來調節農產品含硒水平，滿足人類健康攝硒的需要；另一方面利用轉基因技術實現通過植物治理環境硒汙染的目標。擬南芥是一種模式植物，廣泛用於植物遺傳學、發育生物學和分子生物學等研究領域。擬南芥的大多數基因在其它植物中都能找到，有關擬南芥的任何發現都能應用於其它植物研究。因此，對擬南芥耐硒的分子生物學機制的研究對提高植物的耐硒能力具有重要的理論與經濟意義。擬南芥基因組已完全測序，根據擬南芥測序資料庫尋找和發現新的具有自主智慧財產權的功能基因是國際植物學研究領域的熱點之一。利用突變技術研究基因功能已成為一種有效的方法，通過對突變體的研究，發現了一些耐硒基因的功能，如AtGPX， AtHMT，APS等，這些基因在突變體和野生型中的轉錄水平不一樣。目前定位出的耐硒基因還非常有限，我們從化學誘導型激活標籤子系統構建的擬南芥突變體庫中篩選到功能獲得性耐硒及增加硒吸收的突變體vsel，克隆獲得具有耐硒功能的基因VSEl，基因轉錄水平分析顯示，在硒鹽脅迫條件下，其轉錄水平提高。為此，我們研究了該基因功能，並在分子生物學水平上闡明了該基因耐硒脅迫的機理。
發明內容
本發明的目的是提供一種新的植物耐硒及增加植物硒吸收相關蛋白及其編碼基因，本發明所提供的植物耐硒及增加植物硒吸收相關蛋白的編碼基因VSE1，來源於哥倫比亞野生型的擬南芥(Col-O)，其蛋白是具有下述胺基酸殘基序列之一的蛋白質，胺基酸殘基序列如序列表中SEQ ID No :2所示或是將SEQ ID No :2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與SEQ ID No :2限定的蛋白質具有相同活性的由SEQ ID No 2衍生的胺基酸殘基序列。序列表中的序列2由250個胺基酸殘基組成。
所述一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過10個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。VSEl的編碼基因也屬於本發明的保護範圍。VSEl的cDNA基因，選自下述核甘酸序列之一；(I)序列表中 SEQ ID No 1 的 DNA 序列；(2)編碼序列表中SEQ ID No 2蛋白質序列的多核苷酸；(3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID No 1限定的DNA序列雜交的核甘酸序列；(4)與序列表中SEQ ID No 1限定的DNA序列具有90%以上同源性、且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。序列表中的序列I由1269個鹼基組成，其開放閱讀框架(ORF)為自5』端第446 位至1876位喊基，編碼序列SEQ ID No 2的蛋白質。含有本發明VSEl的表達載體，細胞系和宿主菌均屬於本發明的保護範圍。擴增 VSEl中任一片段的引物對也屬於本發明的保護範圍。本發明的第二個目的是提供一種利用該基因增強植物對硒耐受性及增加植物中硒含量的方法。本發明所提供的增強植物對硒耐受性及增加硒含量的方法，是抑制植物耐硒及增加植物硒含量相關蛋白編碼基因的表達，該表達可通過多種方法實現。本發明抑制基因表達的方法並不限於上述幾種方法，只要能抑制VSEl表達即可。利用任何一種植物基因敲除技術，將此基因敲除後，植物表現為耐硒性狀；利用任何一種可以引導外源基因在植物中表達的載體，將本發明所提供的VSEl轉入野生型植物中，植物就表現出對硒非耐受。本發明利用正向遺傳學手段從化學誘導型激活標籤子系統構建的突變體庫中篩選並通過表型和生理生化鑑定得到功能獲得型耐硒突變體vsel，用經典的CTAB法提取 vsel基因組DNA，再通過Tail-PCR獲得耐硒基因VSE1，後經上海生工生物工程有限公司測序鑑定並在TAIR資料庫中進行序列比對，最後進行基因定位，獲得一個新的耐硒基因。構建了 VSEl基因的過量表達載體，並導入根癌農桿菌C58菌株中，用花絮浸潰法進行擬南芥植株的遺傳轉化，並用抗生素篩選轉化株，以期觀察該轉基因植株在硒脅迫下的表型，並研究其功能。本發明的VSEl基因在構建到植物表達載體中時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強啟動子或誘導型啟動子。為了便於對轉基因植物細胞或植物進行鑑定及篩選，可對所使用的載體進行加工，如加入植物可選擇性標記(GUS基因、螢光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標記物(慶大黴素，卡那黴素等)。被轉化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以植物耐硒症狀來篩選轉化植株。攜帶有本發明VSEl基因的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化植物細胞或組織，並將轉化的植物經組織培育成植株。本發明的植物耐硒相關基因為農作物耐硒育種提供基因與技術的支持。下面結合實施例對本發明的技術方案作進一步的說明。
圖1是本發明以40mg/LNa2Se03作為篩選的臨界濃度，獲得耐硒突變體vsel圖2是本發明突變體vsel和野生型植株在土培條件下生長狀況比較圖3是本發明突變vse 1在不同Na2Se03濃度下發芽率比較圖4是本發明突變體vsel和野生型植株對硒鹽耐受性比較圖5是本發明vsel和野生型主根長、鮮重、蛋白質、GSH_Px、APX、硒含量等比較圖6是本發明vsel突變體在硒鹽脅迫下相關基因的表達圖7是本發明T-DNA插入位點圖譜分析圖8是本發明VSE1基因基因表達模式分析
具體實施例方式
下述實施例中的實驗方法如無特別說明，均為常規方法。實施例1、VSE1基因的獲得利用正向遺傳學手段從化學誘導型激活標籤子系統構建的突變體庫中通過對野 生型和突變體擬南芥在20mg/L、30mg/L和40mg/L三個Na2Se03濃度梯度選擇培養基中進行 培養，在40mg/L Na2Se03濃度下，WT完全不能存活而突變體有三株能夠生長，得到疑似耐硒 突變體，並通過表型和生理生化鑑定得到功能獲得型耐硒突變體vsel，用經典的CTAB法提 取vsel基因組DNA，以提取出來的DNA為模板，進行如下Tail-PCR反應20iil反應體系， 內含10XPCR緩衝液、dNTPs(2. 5mM)混合物、巢式引物(2 u M)和隨機引物(50yM)、Taq酶 (5U/iU)，其餘加雙蒸水至 20iU。其中，巢式引物 1 :LexA2、LexA3、LexA4、LexA5、LexA6 以 及隨機引物2 :AD1、AD2、AD3、AD4見表一。Tail-PCR所用的引物序列
權利要求
1.一種植物耐硒及增加植物硒吸收相關蛋白，其特徵在於胺基酸殘基序列如序列表中SEQ ID No 2所示或是將SEQ ID No 2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與SEQ ID No 2限定的蛋白質具有相同活性的由SEQ ID No 2衍生的胺基酸殘基序列。
2.權利要求I所述的植物耐硒及增加植物硒吸收相關蛋白的編碼基因，其特徵在於 選自下列核苷酸之一(1)序列表中SEQID No I的DNA序列；(2)編碼序列表中SEQID No 2蛋白質序列的多核苷酸；(3)在高嚴謹條件下與SEQID No 1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；(4)與SEQID No :1限定的DNA序列具有90%以上同源性、且編碼相同功能蛋白質的 DNA序列。
3.根據權利要求2所述的植物耐硒及增加植物硒吸收相關蛋白的編碼基因，其特徵在於，所述基因序列的開放閱讀框架為SEQ ID No 2自5』端第446位至1876位鹼基。
4.含有權利要求2或3所述的植物耐硒及增加植物硒吸收相關蛋白的編碼基因序列的載體。
5.含有權利要求2或3所述的植物耐硒及增加植物硒吸收相關蛋白的編碼基因序列的轉基因細胞系。
6.含有權利要求2或3所述的植物耐硒及增加植物硒吸收相關蛋白的編碼基因序列的宿主菌。
7.一種增強植物對硒耐受性及增加植物中硒含量的方法，其特徵在於是抑制植物中如權利要求2所述的耐硒及增加植物硒含量相關蛋白編碼基因的表達。
8.根據權利要求7所述的一種增強植物對硒耐受性及增加植物中硒含量的方法，其特徵在於抑制植物中耐硒相關蛋白編碼基因表達的方法包括植物病毒載體介導基因沉默的方法，或者反義核酸技術沉默基因的方法，或者SiRNA介導的基因沉默方法。
9.權利要求2或3所述的植物耐硒及增加植物硒吸收相關蛋白的編碼基因在增強植物對硒耐受性及增加植物中硒含量的應用。
全文摘要
本發明公開了一種植物耐硒及增加植物硒吸收相關蛋白及其編碼基因與應用。植物耐硒及增加植物硒吸收相關蛋白是序列表中SEQ ID No2，其編碼基因是序列表中SEQ ID No1 DNA序列。本發明所提供的增強植物耐硒及增加植物中硒含量的方法，是抑制植物中的上述植物耐硒及增加植物中硒含量相關蛋白編碼基因的表達。為農作物耐硒育種提供基因與技術支持。
文檔編號C07K14/415GK102603877SQ20121004484
公開日2012年7月25日 申請日期2012年2月24日 優先權日2012年2月24日
發明者盧雲峰, 慈凌坤, 曹樹青, 江力 申請人:合肥工業大學