一種新的分子量為140kDa的活化T細胞表面抗原的製作方法
2023-10-20 19:31:37
專利名稱：一種新的分子量為140kDa的活化T細胞表面抗原的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術。
機體免疫系統是由中樞淋巴器官、外周淋巴器官、免疫細胞和免疫分子所組成。免疫應答過程有賴於免疫系統中細胞間的相互作用，包括細胞間直接接觸和通過釋放細胞因子或其它介質的相互作用。免疫細胞間或細胞與介質間相互識別的物質基礎是免疫細胞膜分子。免疫細胞膜分子的研究對於深入了解免疫應答機制，以及對臨床某些疾病的診斷、預防和治療都具有十分重要的意義。截止2000年8月份，美國FDA已經批准了5種識別免疫細胞膜分子的單克隆抗體用於臨床疾病的治療，另有幾十種單克隆抗體正在進行臨床試驗。
本發明一種新的分子量為140kDa的活化T細胞表面抗原，獨特分布於混合淋巴細胞反應活化的CD4+、CD8+、TCRγδ+T細胞和活化的NK細胞，而在其它活化途徑(如固相CD3刺激、PHA、PMA及PMA+A23187刺激)中，活化T細胞表面不表達該分子。其能夠和CD3分子協同刺激T細胞活化。其獨特的分布、表達規律和功能表明它是一種新分子。
本發明的技術路線混合淋巴細胞培養獲取的活化T細胞免疫BALB/c鼠，在加強免疫後3天，取脾，製備脾細胞懸液，和骨髓瘤細胞NS-1融合，用HAT選擇性培養。通過間接免疫螢光標記和流式細胞術，篩選能夠和混合淋巴細胞培養獲取的活化T細胞結合的雜交瘤上清，分泌陽性抗體的融合細胞被克隆化，得到了A2單克隆抗體。通過免疫螢光染色、流式細胞術和重導向細胞毒實驗分析A2單克隆抗體所識別的活化T細胞表面抗原，表明其具有獨特的分布、表達規律和功能。經生物素標記、免疫沉澱及化學發光鑑定其分子量為140kDa。
木發明分子量為140kDa的活化T細胞表面抗原表達於活化的T細胞亞群TCRγδ+T細胞，因此，可作為TCRγδ+T細胞的一個活化標誌，在移植免疫的研究和臨床治療移植排斥反應中具有重要意義。
本發明技術路線的
具體實施例方式1．混合淋巴細胞培養(MLC)無菌抽取正常人外周血10毫升，肝素抗凝，採用密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(PBMC)，按2ml完全培養基中含有1.5×106PBMC和0.5×1063000Rad照射過的Daudi細胞培養於24孔板中，37℃、5％CO2孵箱培養7天，獲取活化的T細胞。
2．細胞免疫混合淋巴細胞培養獲取的活化T細胞1×107腹腔內注射免疫BALB/c鼠，4周內同法免疫2次，1周後，尾靜脈內注射活化T細胞1×107加強免疫，3天後，取脾融合。
3．單克隆抗體的製備加強免疫後3天，取脾，製備脾細胞懸液，和骨髓瘤細胞NS-1融合，用HAT選擇性培養。通過間接免疫螢光標記和流式細胞術，篩選能夠和混合淋巴細胞培養獲取的活化T細胞結合的雜交瘤上清，分泌陽性抗體的融合細胞被克隆化，得到了A2單克隆抗體。
4．研究A2單克隆抗體所識別膜分子p140的分布4.1人PBMC的活化同1.方法獲取人PBMC，按2ml完全培養基中含有2×106細胞培養於24孔板，分別加入PHA(4μg/ml)、PMA(40ng/ml)、PMA(40ng/ml)+A23187(0.9μg/ml)，另有一孔為已包被有CD3mAb(用8μg/ml濃度進行包被)。其中PMA、PMA+A23187兩組培養48h，PHA、CD3 mAb兩組培養72h，另有PHA刺激的PBMC通過加入rHuIL-2(100u/ml)維持培養至12天。同時還有一組混合淋巴細胞培養的細胞通過加入rHuIL-2(100u/ml)維持培養至12天。用於下面免疫雙色分析的混合淋巴細胞培養細胞在刺激第一天時便加入rHuIL-2(100u/ml)。
4.2免疫螢光染色和流式細胞術分析用含10％小牛血清的完全培養基調整各種細胞濃度至1×107/ml，各取50μl細胞懸液加入預先加有50μl 1∶20稀釋(用DPBS稀釋)滅活正常兔血清的管中，再加入不同的mAb，充分振搖，4℃作用30min，用洗滌液洗2次。棄上清，加入工作濃度的羊抗鼠FITC標記二抗(1∶20稀釋)，充分振搖，4℃作用30min，用洗滌液洗2次，加適量固定液，FCM檢測。在直接免疫螢光雙色實驗中，調整細胞濃度至1×107/ml，取50μl細胞懸液加入預先加有50μl 1∶20稀釋滅活正常兔血清中，4℃孵育10min後再每管加入PE和FITC標記特異性抗體，再繼續4℃孵育30min，最後洗3次後加適量固定液，FCM檢測。
4.3所獲結果A2單克隆抗體所識別的免疫細胞膜分子p140在靜止外周血單個核細胞(PBMC)沒有表達，選擇性表達於混合淋巴細胞培養所活化的T細胞表面，其它活化途徑如固相CD3刺激、PHA、PMA及PMA+A23187刺激，不能誘導它的表達。PHA刺激的PBMC直至12天時還沒有表達p140，而混合淋巴細胞培養所活化的T細胞從第3天開始即有較高表達。經流式細胞術分析發現，p140分子表達於活化的T和NK細胞表面，尤其在TCRγδ+T細胞表達較高。
5．研究p140分子所參與的功能5.1重導向細胞毒試驗收集對數生長期P815細胞，標記51Cr(100μCi/1×106細胞)，37℃孵育2h，每隔15min晃動一次。標記完畢後洗滌3次，調整靶細胞濃度為1×106/ml，加入96孔U型板，100μl/孔。收集MLC後7天的活化淋巴細胞作為效應細胞，調整細胞濃度為1×106/ml。每組取600μl細胞懸液並分別加入相應的抗體在37℃孵育30min，離心，用600μl完全培養基重懸，進行倍比稀釋後分別加入含已標記的P815細胞的96孔U型板中，100μl/孔，37℃、5％CO2孵箱培養4h，收集上清，用γ記數儀檢測cpm值。
5.2所獲結果p140分子具有和CD3分子的協同作用，在效靶比為10∶1和5∶1時，分別提高CD3刺激的細胞毒活性12.1％和9.2％。
6．鑑定p140分子的分子量6.1生物素標記、免疫沉澱及化學發光收集處於對數生長期的JM細胞1×107，按照生物素標記和免疫沉澱試劑盒所述步驟進行操作，所得樣品經SDS-PAGE電泳後，轉移至PVDF膜上，用POD標記Avidin化學發光試劑盒進行曝光顯色。
6.2所獲結果最終鑑定p140分子的分子量為120-140kDa。
權利要求
1．一種新的分子量為140kDa的活化T細胞表面抗原，其特徵是混合淋巴細胞培養獲取的活化T細胞免疫BALB/c鼠，在加強免疫後3天，取脾，製備脾細胞懸液，和骨髓瘤細胞NS-1融合，用HAT選擇性培養；通過間接免疫螢光標記和流式細胞術，篩選能夠和混合淋巴細胞培養獲取的活化T細胞結合的雜交瘤上清，分泌陽性抗體的融合細胞被克隆化，得到了A2單克隆抗體通過免疫螢光染色、流式細胞術和重導向細胞毒實驗分析A2單克隆抗體所識別的活化T細胞表面抗原，表明其具有獨特的分布、表達規律和功能，經生物素標記、免疫沉澱及化學發光鑑定其分子量為140kDa。
2．根據權利要求1所述的一種新的分子量為140kDa的活化T細胞表面抗原，其特徵是該細胞表面抗原獨特分布於混合淋巴細胞反應活化的CD4+、CD8+、TCRγδ+T細胞和活化的NK細胞，而在其它活化途徑(如固相CD3刺激、PHA、PMA及PMA+A23187刺激)中，活化T細胞表面不表達該分子，其能夠和CD3分子協同刺激T細胞活化，其分子量為140kDa。
全文摘要
一種新的分子量為140kDa的活化T細胞表面抗原,涉及生物技術。免疫細胞膜分子已廣泛應用於臨床某些疾病的診斷、預防和治療。本發明用混合淋巴細胞培養獲取的活化T細胞免疫BALB/c鼠,製備脾細胞懸液,和骨髓瘤細胞NS－1融合,用HAT選擇性培養。經過篩選雜交瘤上清得到了A2單克隆抗體。分析該單抗所識別的活化T細胞表面抗原,表明其具有獨特的分布、表達規律和功能,分子量為140kDa。
文檔編號C12P21/02GK1314414SQ0110679
公開日2001年9月26日 申請日期2001年3月16日 優先權日2001年3月16日
發明者金伯泉, 張繼帥, 賈衛, 張贇, 歐陽為明, 韓衛寧, 劉雪松 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學