分子構建和用於檢測生化反應的方法

2023-09-24 12:42:55

專利名稱：分子構建和用於檢測生化反應的方法
技術領域：
本發明主要涉及分子生物學以及生物化學。本發明提供分子構建以及測定單個或多個生化反應的方法。
背景技術：
細胞中的生化反應決定細胞功能和活動。這些反應包括在受體配體間的複雜的相互作用和酶反應，其調節細胞所發出的信號及其活動。生理條件會影響參與這些反應的酶和蛋白質的活性水平。
例如，對肽鏈上的胺基酸殘基的修飾在調節細胞中的蛋白質功能方面扮演著重要的角色。磷酸基、甲基或碳水化合物的轉移包含了在蛋白質底物中的構象改變，而這種改變又反過來導致蛋白質功能發生變化。這些反應通常是可逆的。蛋白質修飾過程中包含特殊的酶活動種類。例如，甲基化作用通常是由被稱為轉甲基酶的一類酶來進行催化的。蛋白質甲基化作用調節胞質蛋白質(cytosolic protains)對細胞膜的附著並且有助於防止肽的C端蛋白水解的降解反應。例如，大多數的G蛋白質是甲基化的。甲基化的半胱氨酸殘基位於或接近於G蛋白質的羧基末端，並且有助於肽附著到用於信號傳導的細胞膜上(Rando，Biochim BiophysActa 1300(1)5-12(1996)，Hrycyna，Pharmacol.Ther.59(3)281-300(1993))。在幾種肌動蛋白的73位置處的組氨酸也被甲基化。已經表明甲基化對於維持肌動蛋白分子的固有的構象是必須的(Yao，J.Biol.Chem.274(52)37443-9(1999))。在肌球蛋白的S-1區域進行的賴氨酸殘基的甲基化會導致在肌纖蛋白收縮中的ATP降低(Bivin，Proc.Nat』lAcad.Sci USA 91(18)8665-9(1994))。已經表明膜蛋白的甲基化作用會導致糖尿病患者中心血管疾病的發生(Schaffer，Mol.Cell Biochem107(1)1-20(1991))。此外，甲基化作用減少核蛋白中的RNA-蛋白質的相互作用(Kim，Amino Acids 15(4)291-306(1998))，並且選擇性地調整SH3功能域—中介蛋白—蛋白之間的相互作用(Bedford，J.Biol.Chem，275(21)16030-6(2000))。
同樣地，碳水化合物可以被轉移到在許多分泌型蛋白質或細胞表面的蛋白質上的天冬醯胺、絲氨酸或蘇氨酸殘基的側鏈上。將碳水化合物轉移到人體凝結因子V上的2181位置的天冬醯胺上會削弱因子V和磷脂膜之間的相互作用(Nicolaes，Biochemistry 38(41)13584-91(1999))。大型的碳水化合物如多糖可以通過將許多糖單體連結反應後得到。

發明內容
本發明涉及一種具有捕獲部位和底物部位的分子構建。捕獲部位用於將構建從測試的樣品中分離出來，底物部位提供反應的場所用於確定感興趣的目標分子的存在或活動水平。在一種優選的實施方式中，分子構建包括肽核酸(PNA)作為捕獲部位和肽或蛋白質作為底物部位。另一種可選擇的優選底物部位包括非肽類分子，如脂肪酸、類固醇、糖、輔助因子和其它的可以與感興趣的目標分子反應或作為其底物的結構。
本發明也涉及使用分子構建的方法。此外還提供測定一種或多種酶活動的方法，這種方法是通過測定分子構建中被修飾的底物部位，而這反過來又可以指示樣品中存在的一種或多種酶的活性。相似地，本發明還提供在測定細胞、細胞種群或組織樣品中的被分析物的方法。
本發明中具有肽核酸(PNA)捕獲部位的分子構建相對於現有技術中的分子構建來說是特別好的。由於PNA的主鏈具有無電荷性，所以PNA與互補核酸序列的雜交具有更高的特異性和更高的親和力。由於PNA具有核酸如DNA或RNA所不具有的各種特性，所以PNA核酸序列雜交要相對好得多。PNA在較大pH值的範圍內和低離子強度環境中是穩定的。這些性質使得PNA特別適用於本發明的探測測定中。
為了探測和分析生化反應所需進行的測定應該是精確地、省時有效地和能夠高靈敏度地篩選出一個或多個反應的。因此，為了防止和/或治療疾病，特別是由病毒、細菌和寄生蟲引起的人類疾病，如存在一種方法能夠探測一個或多個生化反應，且該方法容易使用、具有高特異性、能夠精確地、靈敏地進行篩選，則是非常有用的。


圖1顯示了使用LEAPS或直接澱積的方法來探測微粒，並且隨後在陣列上使用READ、流式細胞計和沉澱法來進行探測的實施例。
圖2示意性地描述了用於固定到載體表面的多元測定中的PNA-被分析物嵌合體。
圖3顯示了通過抗體來探測經修飾的被分析物/底物。被捕獲到固體表面的修飾的被分析物可以通過用螢光(F)或過氧化物酶(E)標記的抗體在一種抗體-(A)；二種抗體-(B)或三種抗體-(C)的形式中檢測得到。
圖4示意性地描述了MAP致活酶信號傳導通道用於識別在MAP致活酶通道中的特異性致活酶的活性的報導嵌合體。
圖5示意性地描述了使用PNA-STAT嵌合體進行細胞基測定，以確定在以JAK致活酶為媒介的傳遞的信號傳導通道中的致活酶的活性。
圖6示意性地描述了對PKD1和Akt1/PKB致活酶(A)的特異性的致活酶活性的探測，並且其可以用在細胞基的測定(B)中來分析Akt/PKB信號通道。
圖7示意性地描述了使用PNA-caspase嵌合體來探測多個caspase活動。
圖8示意性地描述了在細胞基探測中使用PNA-小分子嵌合體來識別新藥尋靶GPCR。
圖9示意性地描述了根據流式細胞計探測到的將PNA嵌合體雜交到在彩色編碼的微粒上的互補寡核苷酸上。
圖10顯示了一種使用PNA-抗體嵌合體來探測和分離細胞的方法，這些細胞在其表面顯示有特異性蛋白質。
圖11顯示了兩種不同的將寡核苷酸探針固定到固體表面上的方法，包括使用生物素—中性抗生物素蛋白結合進行的間接偶合(A)，以及使用胺—甲苯磺醯基反應進行的直接偶合(B)。在下面的圖中顯示出了以生物素—中性抗生物素蛋白作為媒介，將寡核苷酸間接偶合到固體表面上的滴定結果，以及將寡核苷酸與胺基—甲苯磺醯基的偶合直接結合到固體表面上的滴定結果。
圖12顯示了兩種類型的生物素化寡聚物的高壓液體色譜法純化的過程。
圖13顯示了純化的四甲基若丹明(TMR)標記的PNA-肽嵌合體(A)和Cy5標記的PNA-小分子嵌合體(B)和它們相應的譜圖情況。
圖14顯示了晶片上雜交測定的結果，其測試了將生物素化雙-PNA寡聚物進行序列特異性捕獲到固定在微粒陣列上的各種寡核苷酸上。
圖15顯示了試管內雜交測定(A)與晶片上雜交測定(B)比較的結果，其用於測試將雙-PNA寡聚物進行序列特異性捕獲到固定在彩色編碼的微粒上的DNA寡核苷酸上。
圖16顯示了晶片上雜交測定的結果，其測試將雙-PNA-蛋白質嵌合體進行序列特異性捕獲到固定在微粒陣列上的DNA寡核苷酸(18個鹼基長)上。
圖17顯示了將PNA寡聚物雜交到固定在彩色編碼的磁性顆粒上的互補寡核苷酸上的結果，其中晶片B(B)是晶片A(A)的負對照。
圖18顯示了晶片上雜交測定的結果，其測試了將雙-PNA-小分子嵌合體進行序列特異性捕獲到固定在微粒陣列上的DNA寡核苷酸(10個鹼基長)上，其中，晶片2是對晶片1的負對照。
圖19顯示了三條生物素化的磷酸化的肽標準曲線(肽-P-1，肽-P-2和肽-P-3)隨濃度上升的結果，其中，肽通過使用微粒陣列而偶合到特異性的彩色編碼珠上，該珠被中性抗生素蛋白包覆。
圖20顯示了兩條生物素化的磷酸化的肽標準曲線(肽-P-1和肽-P-2)隨濃度上升的結果，其中，肽用中性抗生素蛋白偶合到特異性的彩色編碼珠上。
圖21顯示了使用酪醯胺(tyramide)試劑在微粒陣列上進行磷酸化的肽(Ty-P-1和Ty-P-2)免疫檢測的結果。用於該測定的單克隆抗體用對磷酸化修飾具有特異性的過氧化物酶進行標記。
圖22顯示了使用在陣列上的磷酸化的肽特異性的單克隆抗體進行磷酸化的肽(Ty-P-1和Ty-P-2)免疫檢測的結果。結合的單克隆抗體用Cy-5標記的次級抗體來探測。
圖23顯示了在微粒陣列上使用螢光標記的抗體同時進行多個磷酸化的肽的免疫檢測的結果。
圖24顯示了雙標記的PNA被分析物嵌合體的常規設計和雙重-測定信號檢測(A)的比例量化；用螢光染料標記的特異性PNA-肽嵌合體和為確定Caspase3活性(B)的比例量化的內部His6標記；以及通過比例量化(C)確定的Caspase3活性的結果。
圖25顯示了通過流式細胞分析探測雜交到彩色編碼的微粒上的PNA嵌合體的結果。在圖25A中，兩個綠色珠(綠A和綠B)與兩種類型的寡核苷酸(A)和(B)偶合。PNA嵌合體特異性地結合到綠B珠上的寡核苷酸上，這可在橙色通道上檢測到。類似的，在圖25B中，結果表示pPNA嵌合體序列特異性地結合到一種可由流式細胞計探測到的珠上。
圖26顯示了用於檢測蛋白酶活性的PNA-肽嵌合體底物的常規設計，其中嵌合體的功能域用一種螢光染料(I)、兩種螢光染料(II)和一種具有內部His6標記的螢光染料(III)標記。
圖27顯示了使用生物素化Caspase3肽底物和在微粒陣列上末端標記的螢光染料確定Caspase活性的結果。
圖28顯示了進行2×2PNA嵌合體競爭測定來測試被捕獲到在微粒陣列上的DNA寡核苷酸(10個鹼基長)上的PNA嵌合體的特異性的結果。晶片1顯示了生物素化PNA夾(生物素-PNA-板)(底板)和用四甲基若丹明(TMR)配合的雙-PNA-肽嵌合體(雙-PNA-肽-TMR)(頂板)被捕獲到用具有特定鹼基序列功能化的彩色編碼珠上的結果。晶片2顯示了對應於生物素-PNA-夾)(底板)和雙-PNA-肽嵌合體-TMR(頂板)的負對照。
圖29顯示了用於解碼彩色編碼的微粒子(橙色珠和綠色珠)的橙色和綠色圖像，該珠分別與合成的非磷酸化的肽和與之相應的磷酸化的肽偶合(左板)。綠色珠上的磷酸化的肽通過使用晶片上的Cy-5標記的抗體而被探測(右板)到。
圖30A示意地顯示了DNA-肽嵌合體，圖30B顯示了將DNA-肽嵌合體雜交到在微粒陣列上的彩色編碼珠上的互補PNA上的結果。
具體實施例方式
本發明涉及一種具有捕獲部位和底物部位的分子構建。捕獲部位能夠將構建從混合分子中分離出來，並優選含有核酸或核酸衍生物。底物部位能夠使構建發生作用，並經歷一可被測量或檢測到的改變。該改變可以是物理的，例如化學修飾或對底物部位的剪切或加成。另外，改變也可以是將配體或細胞結合到構建上的底物部位。
本發明的分子構建可以是含有共價連接組分的PNA-肽嵌合體，包括PNA寡聚物、一種或多個PNA的衍生物形態(例如，pPNA)、連接物和合成肽或其他底物部位。嵌合體的PNA部位(其可以為線性的或為雙—排列的(format))作為將複合體捕獲到互補寡核苷酸上的錨形體(anchor)，其中，寡核苷酸固定在固體支持物上。PNA錨定區域的鹼基序列為嵌合體的底物區域的被分析物提供一種獨特的標記。固體支持物可以具有規定的物理特性。另外，固體支持物可以被光或化學地編碼。
嵌合體的底物部位作為參加生化測定的功能性/底物組分。分子構建的底物部位包含分子結構，其在生化反應中作為配體或酶底物。例如，蛋白質或肽可以被用作酶反應的底物或提供配體結合的場所。肽在探測配體—受體反應中也同樣有用。蛋白質可以用作分離具有特異細胞表面標記的細胞種群的底物。另外，酶輔助因子也可以形成嵌合體的全部或部分的底物，例如，ATP、cAMP、GTP等。類似的，脂肪、類固醇和/或脂肪酸可以形成嵌合體的底物部位，這是由於這些分子也可以在生化反應過程中被修飾，因此可利用本發明可以被測定出。碳氫化合物也可以形成嵌合體的全部或部分的底物部位。這些分子包括，如，單糖、澱粉、多糖或蛋白多糖類等。
底物部位可以被修飾為含有一個或更多的部位，例如可探測標記物或酶剪切識別部位，如磷酸基、糖基、甲基等。在另一種實施方式中，嵌合體的底物部位包含一個或多個螢光標記。這些標記可以與聚組氨酸、生物素、異羥基洋地黃毒疳元(digoxygenin)標記等的使用相結合。通過使用單標記的底物部位，酶消化從消化的底物中消除標記物。通過使用雙標記的底物部位，酶消化從底物中消除猝滅染料，導致從次要染料發射出的螢光保留在剪切產物上。通過使用具有一個可探測的標記物外加內聚組氨酸標記物的底物部位，酶消化將消除螢光。並且，來自為未剪切的底物的可探測信號可以被歸一化以檢測由內聚組氨酸標記物發出的信號。這些實施方式在實施例10、14、16和17中有詳細描述，其表明了這種分子構建可以提供關於感興趣的酶活性的定量信息。在另一實施例中，嵌合體的底物部位含有一個或更多的磷酸基團或其他感興趣的部分，其可作為部分的磷酸酶或其他感興趣的酶的酶剪切位點。
本發明的分子構建可被用於探測底物部位中發生的變化的方法中。這裡公開的方法可被用於確定蛋白質—蛋白質相互作用、配體—受體結合、蛋白質修飾、蛋白質表達、在無細胞和細胞基形式(format)中的酶活性。本發明的方法也可被用作分離具有特異細胞表面標記物的細胞。這些方法可被用作多種用途。構建可用在基因篩選分析中、在疾病的診斷中或在治療和/或防止中、在藥物開發和在對疾病或條件的毒理學測定中，例如但不限於癌症、寄生蟲感染、神經紊亂、造血紊亂、肌肉骨骼紊亂(muscoskeletal)、心血管紊亂、淋巴紊亂、呼吸紊亂、內分泌紊亂和胃腸紊亂。
通常，用於本發明的分子構建的使用方法使PNA-底物嵌合體與蛋白質、配體或酶在測試樣品中反應。反應可以在同質的溶劑中進行，或嵌合體的捕獲部位可以在反應前被事先固定在固體基體上。如果測試反應在樣品表面發生，則該反應對嵌合體的底物部位進行修飾。如果生化反應在溶劑中發生，則嵌合體按照序列特異性的方式被捕獲到寡核苷酸-功能化的固體支持物上。在一種實施方式中，彩色編碼的微粒子被用作固體支持物。微粒子可以使用現有的方法，如LEAPS或直接沉積法組裝。LEAPS是一種已知的粒子在接近表面的光控動電組裝技術，並且是一種根據需求用於多被分析物分子分析而構建微粒子陣列的方法。LEAPS在美國專利6,251,691和WO97/40385中有詳細記載，在此引入作為參考。在生化反應完成後，嵌合體被捕獲到位於固體表面的互補DNA寡核苷酸傳感物上。在隨後的檢測和數據分析中，嵌合體的同一性隨後根據載體表面的編碼(例如珠的彩色編碼)而確定。捕獲後，表面上的嵌合體可根據現有的方法直接被檢測到。這種方法的非限制的例子包括沉澱反應、過氧化物酶或螢光染料、標記的抗體、配體結合檢測或流式細胞計。分子構建的修飾的底物部位可以被一種或多種現有的形式而被探測到，例如，組裝的粒子的隨機編碼陣列檢測(READ)(WO97/40385)、粒子懸浮液的流式細胞計、在空間規定的固體表面上的沉積等。
在固體表面上的DNA寡核苷酸在多元測定中作為對PNA嵌合體的錨定區域的序列特異性捕獲的傳感物。具有確定鹼基序列的寡核苷酸可以含有其他的修飾，例如間隔序列、化學基團、配體和/或標記物，這些修飾有助於偶合、雜交和/或檢測。固體表面也可以含有特定的用於偶合的化學基團。可以直接或間接地將寡核苷酸偶合到固體表面上。用於偶合的具體方法在現有技術中是已知的。在優選的實施方案中，寡核苷酸偶合可以通過以生物素—中型抗生物素蛋白為媒介的間接偶合，或以胺—甲苯磺醯基為媒介的直接偶合。
在本發明的一種實施方式中，分子構建的捕獲部位包含肽核酸(PNA)。PNAs與DNA類似，具有類似肽的主架。PNA主架包括通過醯胺基連接的重複的N-(2-胺乙基)甘氨酸殘基。與DNA或RNA不同，PNA不含任何戊糖和磷酸基。由於PNA的主鏈具有無電荷性，使得將PNA與互補的DNA或RNA序列雜交比其他的核酸材料更加具有特異性和更高的親和力。此外，PNA和雙-PNA可與DNA雜交，其具有的特異性序列適於形成局部的DNA/DNA/PNA三重體。PNAs的特點以及合成這些分子的方法已在如Buchardt等的WO92/20702(1992年11月29日)中公開，其在此將其引入作為參考。由於PNA的雜交是非常特異性的，所以在雜交測定中的PNA探針可以被DNA探針短。PNA在較大pH值的範圍內是穩定的，可使用低離子強度的環境。此外，PNA是一種合成的化合物，其在自然中不存在。因此，蛋白酶和核酸酶均不能識別PNA分子的聚醯胺骨架。這一特性使得PNAs特別適合於使用細胞溶菌產物或細胞或組織的雜交試驗。
PNA-底物嵌合體的PNAs優選為具有10-25個鹼基的長度，更優選為約15個鹼基的長度。在分子的N末端的第一或第二個鹼基是與其他分子結合的隔離物。剩餘的PNA寡聚物作為一種探針，對嵌合體的序列特異性雜交到固定在固體支持物上的寡核苷酸上進行調節。嵌合體的PNA部位可以是單股或雙-PNA。雙-PNA也指「PNA夾」，其含有通過一柔軟的「發卡」連接物連接的兩個呈延伸狀的PNA寡聚物。當雜交時，雙-PNA與互補的DNA形成三重結構。
DNA-DNA和DNA-RNA雜交相比，PNAs與其互補的DNA具有更高的序列特異性結合親和特異性。當用於多元測定時，PNA嵌合體的錨定區域和與它們的互補DNA寡核苷酸傳感物雜交，所述DNA寡核苷酸傳感物固定在感興趣的載體的特定表面上(圖2)。DNA寡核苷酸傳感物優選含有特定的鹼基序列，該鹼基序列與PNA嵌合體文庫中的一個PNA錨形體(anchor)(即捕獲部位)互補。將寡核苷酸固定在載體表面可採用現有方法實現，其可以是通過化學反應如胺基和甲苯磺醯基之間的反應而直接連接到表面，也可以是通過連接分子，如在表面上將生物素化寡核苷酸結合到抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白上而間接偶合到表面。DNA寡核苷酸傳感物可以含有間隔分子、標記物、標記或其它反應基團，以助於固定、雜交和探測。載體優選含有特定的空間的和顏色特性，用於對固定的寡核苷酸進行解碼。在優選的實施例中，載體可以含有微粒子。當具有n3型的DNA寡核苷酸傳感物和n4型的彩色編碼珠時，可以合成得到寡核苷酸官能化的載體文庫(n3×n4)。在多元測定時，每種類型的寡核苷酸官能化的微粒子優選僅捕獲一種類型的PNA嵌合體。
在本發明的一種實施方式中，分子構建包含PNA-底物嵌合體。該實施方式包含通過連接分子連接到多肽上的PNA。通過現有的方法可合成PNA寡聚物。這樣的方法包括Boc化學、Fmoc化學(Nielsen，P.E.，Egholm，M，Peptide Nucleic AcidProtocols and Applications，PP.21-50，Horizon Scientific Press，1999)，它們在此被引入作為參考。
在本發明的另一種實施方式中，嵌合體的底物部位優選為肽，如酶的底物。一類特別適合於本發明的多元形式的優選的酶為相關酶族中的一部分，例如，致活酶、caspases、磷酸(酯)酶、轉移酶、核酸酶等。對本發明的非多元形式，任何利用底物的生化反應都可被測定，其中，底物或活性位點可以結合到嵌合體的捕獲部位。對於多肽底物，用於底物肽的胺基酸序列可通過現有方法得到。
在本發明中，一種優選的結合方法是在肽的末端插入一半胱氨酸，如在合成肽時的N-末端。在半胱氨酸殘基側鏈上的巰基可被用於在合成嵌合體時將肽連接到連接分子上。另外，賴氨酸可被加入到肽的另一末端用作生物素化，該生物素化用於在某些多元生化測定中進行檢測。異型雙官能團交聯劑可被用在PNA-肽嵌合體的合成中。琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己烷-1-(羧基-6-氨基己酸酯)，也稱作LC-SMCC，是一種雙特異性交聯劑，其與被分析物的巰基和氨基反應。如現有技術所知，LC-SMCC的NHS酯首先與PNA寡聚物的N-末端上的氨基反應，在pH為7-8時，能夠活化PNA分子。然後，LC-SMCC的馬來醯亞胺基與肽的巰基反應，在pH為6.5-7.5時，形成官能化的PNA-肽嵌合體。合成的PNA-肽嵌合體用現已知的各種方法進行提純和濃縮。因此，可合成PNA-底物嵌合體文庫，用於多元生化測定。在PNA-底物嵌合體文庫中，每種肽都可以結合到特殊的PNA寡聚物上。但是，給定的一系列PNA寡聚物可被用於建造多個PNA-底物嵌合體的子文庫。
儘管不是必需的，本發明的一個優選實施方式在連接PNA和底物時使用連接物。交聯物可以提供更為屈曲的結構，這是因為它作為PNA和嵌合體的底物部位的空間樞紐。連接物額外的屈曲性有助於酶底物的相互作用以及PNA寡核苷酸雜交。另外，在合成PNA嵌合體時，納米粒子可用作連接物。PNA和肽底物可連續或同時連接到粒子的表面。當磁性納米粒子被用作連接物時，所得的PNA底物嵌合體可根據試驗需要而被純化或富集。
可通過各種方法實現對修飾的PNA底物嵌合體的探測。如果只應用一種PNA底物嵌合體，則已知的任何方法都適用。當使用多元化試驗時，則需使用多個嵌合體群。在這個測定中，給定嵌合體群的捕獲部位優選對應於單個類型的底物部位，使得在生化反應完成後，特異修飾的嵌合體可通過其相應的序列如已知的錨形體(anchor)序列而被分類和識別。這些嵌合體群的捕獲是通過將嵌合體雜交到多個表面上而實現的，每個表面上含有與PNA-底物嵌合體的給定捕獲部位互補的寡核苷酸。多個表面可包含多個不同的固體基質，或可以是單個的固體表面，其中表面部分含有特異類型的寡核苷酸。多種不同的固體基質可以以粒子形式存在，例如磁性粒子、微粒子、納米粒子、有機或無機聚合物、金屬或陶瓷膜等。對這些粒子可以在某些方面加以修飾，以區別不同的群，例如通過顏色、離子電荷、形狀或反射指數，或它們的化學或物理特性等。這些粒子還可以通過物理分離，從而區分不同的群。如果優選的是單個的固體基質時，其例子包括陣列或微陣列，其中不同的嵌合體群被雜交以使陣列的各部分離散。
在本發明的一種實施方式中，寡核苷酸被固定在彩色編碼的微粒子上。這些寡核苷酸作為探針，從溶液中對靶PNA-底物嵌合體的互補捕獲部位進行雜交，以用於檢測。根據序列特異性雜交，微粒子的顏色代碼可被用於對來自多元生化測定中的特定的肽信號進行解碼。寡核苷酸探針優選含有15～50個核苷酸。在寡核苷酸的末端優選引入官能基團如氨基，以用於固定。另外，探針的末端核苷酸也可以被適當地生物素化或標記。合成這些修飾的寡核苷酸的方法在現有技術中是已知的。在某些情況下，期望寡核苷酸探針具有獨特的鹼基序列。彩色編碼的微粒子的表面可以載有特定的化學基團可用於多元生化測定中的生物分子的固定。用於在粒子表面產生活化化學基團的特定化學方法，在現有技術中是已知的，如Polymer ColloidsA copmprehensive Introduction，edited byFitch，R.M.，Academic Press(1997)。寡核苷酸、DNA碎片、RNA分子、合成肽、重組蛋白質、純化的天然蛋白質等可按照已知的方法通過與表面化學基團的相互作用而固定在粒子上，例如，Bioconjugate Techniques，edited Hermanson，G T.，Academic Press(1995)。單個類型的彩色編碼的微粒子可與特定類型的生物分子結合，使得來自多元生化測定的可探測的信號可以根據結合微粒子的顏色而被解碼。粒子與生物分子的官能化可以使用自動設備平行進行以使偏差最小化。另外，寡核苷酸探針可在固體基質的表面定位。例如，定位的寡核苷酸陣列可用於捕獲PNA嵌合體。並且，寡核苷酸探針可以在固體基質表面上直接合成，例如用於捕獲PNA嵌合體的高密度寡核苷酸陣列。
在本發明的另一種實施方式中，公開了捕獲PNA-底物嵌合體文庫的方法。該實施方式在微粒子陣列上捕獲這些文庫。這裡，在進行晶片上的生化測定之前，預先形成的編碼微粒的平面陣列被用於捕獲相應的PNA-底物嵌合體。在另一種優選的實施方式中，在完成了生化反應後，通過寡核苷酸捕獲到PNA-底物嵌合體上的編碼粒子被組裝。
在一種實施方式中，如圖3所示，已知被捕獲到載體固體表面上的修飾的嵌合體可被抗體探測到。修飾的嵌合體可通過使用修飾的被標記的底物—特異性抗體而探測到。抗體可以源自在培養介質、人體或動物體中產生的不同種類的免疫球蛋白分子。來自酶標記抗體，例如，過氧化物酶標記的抗體的信號可通過酪醯胺(tyramide)增加的方法被探測到。也可以使用其它類似的標記和酶。這種分子對於本領域技術人員是熟悉的。螢光染料標記的抗體可用於探測修飾底物。除了在圖3A和B中分別顯示的單抗體和雙抗體探測體系外，捕獲在固體表面上的修飾的嵌合體可以通過使用三抗體探測系統而探測到(圖3C)。簡而言之，結合到修飾底物上的主要抗體可以結合到對主要抗體是特異性的次要抗體上。修飾底物、主要抗體和第二抗體的複合體可通過使用標記的第三抗體而探測到。另外，修飾的底物可通過使用特異性的螯合分子探測到，如胺三醋酸鎵(鎵NTA)，其對磷酸基團具有高度的親合性。因此，鎵NTA可被用於探測PNA嵌合體的磷酸化的肽。
在固體基質上將PNA-底物嵌合體雜交到DNA寡核苷酸上的條件是已知的，如Peptide Nucleic AcidsProtocols and Application，edited bynielsen，P.E. Egholm，M.，pg.87-162，Horizon Scientific Press(1999)。已知的方法提供了範圍較寬的適當的雜交條件和用於將嵌合體捕獲到傳感物寡核苷酸上的方法。在優選的實施方式中，將DNA-底物嵌合體捕獲到寡核苷酸官能化的微粒上是依照上述條件進行的。預—雜交可以在雜交緩衝液(例如，10mM的磷酸鈉，15mM的氯化鈉，1mg/ml的BSA，0.1mg/ml的熱變性的青魚精子DNA，0.1％SDS，10％甲醯胺，pH7.2)中，在45℃以恆定速率培養寡核苷酸官能化的微粒約30分鐘。BSA在預雜交過程中封閉微粒表面的未佔據位點。其它的大的非特異性蛋白質(如脫脂幹牛奶)適合作為BSA的替代物。
雜交步驟優選利用具有與嵌合體的捕獲部位完全互補的序列的寡核苷酸探針。PNA-底物嵌合體被加入到寡核苷酸功能化的粒子的懸浮液中使最終濃度為10～100nM。雜交可在適當條件下進行，優選在約45℃下以恆定轉速進行1小時。雜交後雜交的微粒子優選用洗滌緩衝液進行衝洗，更優選的是，在非常嚴格的緩衝液(如10nM磷酸鈉，15mM的氯化鈉，0.1％SDS，pH7.2)中在約45℃下以恆定轉速進行30分鐘。然後微粒子用第一洗滌緩衝液(如10nM磷酸鈉，15mM的氯化鈉，PH7.2)衝洗，接著用第二洗滌緩衝液(如100nM磷酸鈉，150mM的氯化鈉，pH7.2)衝洗，在室溫下衝洗約10分鐘。雜交條件和衝洗頻率可根據嵌合體捕獲部位的鹼基序列而調整。用於PNA雜交的通用協議被Nielsen和Egholm公開(peptide Nucleci AcidsProtocols and Application，edited by Peter.E.Nielsen and Michael Egholm，Horizon Scientific Press(1999)。
本發明的多元測定特別適用於確定相關實體的存在和活性水平，活性實體如酶族、相關DNA結合分子、相關配體—受體對等。一種較優選的酶族，其可在本發明的多元測定中被確認，是催化蛋白質的磷酸化或脫磷酸的酶。絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸的殘基的磷酸化通常被認為是細胞間最重要的調節機制之一。對細胞膜上的受體的刺激活化致活酶的級聯(cascade)，導致各種細胞內蛋白質的磷酸化。這些反應是可逆的，允許細胞以動態方式響應各種刺激信號。通過使用傳統方法很難同時確定多個用於在相互連接的信號傳導路徑中的致活酶的活性。使用本發明的分子構建，對多個底物中的每一個來說的獨特的標記可以被製得，以用於多元測定。在磷酸化時，磷酸化的PNA嵌合體可以被序列特異性地捕獲到寡核苷酸功能化的彩色編碼的微粒子上，通過使用對磷酸化的底物具有特異反應性的可探測的配體來用於探測，磷酸化的底物如磷酸—底物結合蛋白，磷酸—底物—特異性抗體或磷酸—底物結合螯合物。因此，多種致活酶的活性可在組織，細胞和其它試樣中被同時確定。
測量致活酶蛋白質家族的例子如圖4所示，這裡Raf蛋白質(Raf-1，A-Raf以及B-Raf)是絲氨酸—蘇氨酸致活酶，其同源於PKC族，含有氨基—端基的調控區域和羧基—端基的催化趣味域。Raf家族的成員結合到Ras蛋白質上導致它們遷移到質膜上，然後活化。通過對非活化的MEKl致活酶的磷酸化、Rf致活酶活化MEK1致活酶，反過來活化MAP致活酶2/Erk2。Rf致活酶調節從Ras到MAP致活酶的信號傳遞。最近Kolch綜述了關於這些發出信號的複合體的調節(J.Biochem(2000)，35289-305)。
MAP致活酶2/Erk2的活性可以通過使用PNA-MAP致活酶底物肽嵌合體而得以確任。磷酸化的PNA-肽嵌合體可以被序列特異性地捕獲到寡核苷酸功能化的彩色標記的微粒子上，然後是被磷酸化的絲氨酸/蘇氨酸部分進行探測。通過加入致活酶抑制劑，例如2』-氨基-3』-甲氧黃酮(C16H13NO3)，特異性致活酶可以在信號傳導途中被抑制(見圖4)。因此，級聯致活酶試驗可與本發明的分子構建一同使用來探測細胞試樣中的致活酶活性。這種測定在探測與疾病狀態和疾病過程有關的異常致活酶活性方面是很有價值的。已發現有很多重要的使用Ras/Raf信號傳導通道來刺激細胞增殖的生長因子以及發出信號的複合體在某些癌症中具有異常的活性。這些試驗在與藥物研究和信號傳導通道有關的方法中也是有用的。
第二個用於確定多重致活酶活性的非限制性例子與無受體絲氨酸致活酶的JAK(Janus族絲氨酸致活酶)族有關。JAKs與細胞內的細胞因子受體有關，並被細胞外的細胞因子激活。JAK致活酶(JAK1、JAK2、JAK3和Tyk2)具有致活酶區域和不具有酶活性的假致活酶區域。細胞因子結合引發細胞因子受體的二聚作用，激活相關的JAKs，其對受體自身進行磷酸化。然後，磷酸化的受體作為含SH2的STATs(信號傳導物和轉錄活化劑)的封閉位點。JAK1對於從IL-2、IL-6(gp130)和幹擾素(IFN)發出信號來說是非常重要的。JAK3對於通過共享相同g鏈的細胞因子受體發出信號來說是必須的。另外，JAKs也活化Ras-MAP致活酶通道，並在細胞中通過Tec、PI-3致活酶通道。JAKs的主要效應物STATs是潛在的細胞溶質轉錄因子。一旦被JAK致活酶磷酸化，STATs通過它們的SH區域以頭—尾形式二聚。STAT1是IFN發出信號的關鍵媒介，STAT4對IL-2是特異性的，STAT6主要被IL-4和IL-3激活，而IL-5A和IL-5B被認為是在調節生長荷爾蒙和促乳激素中是最重要的。這些STAT-誘發的磷酸化過程也有利於特異性的轉錄反應。Heinrich等對gp130/JAK/STAT發信通道的調節進行過綜述(Biotech.J.334297-314(1998))。
對本發明的PNA-底物嵌合體的收集可應用到對多重JAK或STAT蛋白質的活性水平的同時監控或探測。通過使用PNA-STAT嵌合體，對多重STATs的磷酸化可在細胞基的測定中同時被確認。一種用於測量多重STAT蛋白質活性水平的方法是通過將各種PNA-STAT嵌合體，包括細胞侵入PNA嵌合體，加入到細胞培養物中開始的。對來自細胞因子或其它化合物的刺激進行響應，JAK-STAT單傳導通道被活化，使得包括PNA-STAT嵌合體在內的STAT蛋白質的磷酸化作用。當細胞以標準方法溶解時，PNA-STAT嵌合體就被釋放到溶液中。然後，PNA-STAT嵌合體被序列特異性地捕獲到寡核苷酸功能化的微粒子上從而被探測。將PNA嵌合體雜交到微粒子上的寡核苷酸可以在試管內(試管內雜交)進行，或在具有微粒子陣列的矽晶片上(晶片上雜交)進行。本發明的這種實施方式如圖5所示。
除了PNA-STAT嵌合體外，其它種類的PNA-蛋白質嵌合體，如PNA-JAK嵌合體和含有抗原決定部位的PNA-肽嵌合體可用在為探測其它信號傳導通道的其它效應物的細胞基的功能性試驗中。這樣的試驗在封閉致活酶—激活的轉錄活性以為了調節疾病情況中是非常有用的。人體中的JAK-STAT信號通道與某些白血病的發展有關。另外，這些試驗在藥物發現測定和功能蛋白質組學測定中也是有用的。
另一個探測多重致活酶活性的例子與Akt，也稱為PKB和RAC有關，其是一種在細胞凋亡的調節和發生中具有活躍角色的蛋白質。Akt/PKB蛋白質致活酶被胰島素和各種生長因子活化。它在Wormannin-敏感(sensitive)通道中起作用，包括PI-3致活酶。Akt/PKB包含氨基端基普列克底物同源(pleckstrin homology，PH)區域，其響應PI-3致活酶的活化而結合細胞膜的磷酸化的脂類。Akt/PKB通過磷酸酯結合和在活化圈中的蘇氨酸308和在C-端基區域的絲氨酸473處的PKD1磷酸化而活化。Akt/PKB通過其自身對多個目標，如Bad，Forkhead轉錄因子(FKHR)，GSK-3和Caspase-9等的磷酸化和去活的能力而抑制細胞凋亡，從而能夠起到促進細胞生存的作用。使用PNA-PKDtide嵌合體和PNA-Akt-SGK肽嵌合體作為底物，可同時在組織和細胞中確定PKD1和Akt/PKB的活性。這種方法包括將PNA肽嵌合體加入到樣品中使之發生磷酸化作用。在磷酸化後，磷酸化的PNA肽嵌合體可被序列特異性地捕獲到寡核苷酸功能化的彩色編碼的微粒子上，包括彩色編碼的磁性微粒子。然後，被捕獲的磷酸化的肽可以使用對磷酸化的肽特異性的配體或對磷酸化的肽特異性的抗體進行探測。該方法的過程如圖6A所示。
另外，如圖6B所示，Akt/PKB發出的信號也可以在PNA嵌合體細胞基試驗中被系統地研究。這種方法包括在感興趣的細胞樣品中加入一個或多個具有底物部位的PNA蛋白質嵌合體，這些底物部位是PKD1/2和/或Akt/PKB，如PKD、Akt/PKB、Caspase9、FKHR、Bad和GSK-3的底物。在這裡，通過收穫PNA嵌合體來確定這些蛋白質的活性狀態和/或水平從而可直接測量內致活酶活性。另外，也可用活性抑揚調節劑(modulator)，如，胰島素或生長荷爾蒙，來處理細胞樣品。將這些抑揚調節劑結合到細胞表面受體上可以活化位於細胞膜內側上的PDK1/2。活化的PDK1/2磷酸化Akt/PKB，反過來，磷酸化Caspase9、FKHR、Bad和GSK-3蛋白質。然後，細胞被溶解，從而釋放PNA-蛋白質嵌合體。PNA嵌合體被雜交到序列特異性的寡核苷酸功能化的微粒子或其它固體基質上。然後，嵌合體的修飾的基質部位通過標準方法而探測到。在圖6B中描繪出了該測定。這一測定在探測與疾病情況和病程有關的異常致活酶活性上是很有用的。早先的研究表明，突變體早衰-1基因引發細胞調亡，並且下調患有老年痴呆病患者體中的Akt/PKB(Wehl，et al.J.Neuroscience 195360-5369(1999))。該試驗對於診斷這種疾病情況也是有用的。
另一可用本發明的方法分析的蛋白質家族是caspases。該酶族與調節細胞調亡，即程序死亡有關。調亡前信號如線粒體細胞色素C的釋放促使起始子caspases，如caspases8，9和10的自催化活化。一旦被活化，這些caspases將剪切並活化下遊效應物如caspases3，6和7，其反過來又剪切調亡細胞的細胞骨架和不確定的蛋白質。另一調亡前刺激包括將Fas配體和TNF-α結合到受體的細胞表面，細胞內的DNA破壞和壓迫內質網(ER)。Fas和TNF受體活化caspases8和10，破壞的DNA導致caspase9的活化，而ER壓迫導致caspase12的以鈣為媒介的活化。這一複雜的過程如圖7所示。本發明的使用PNAqht的多元測定提供了一有力的工具來同時監控發出信號的效率或細胞功能。
在本發明的一種實施方式中，製備PNA-caspase嵌合體，使得每個嵌合體含有確定前-caspase的剪切位點。PNA-caspase嵌合體還含有至少一個標識的標記，優選為兩個標記，例如，一個螢光標記和一個聚組氨酸標記，以用於探測。這些雙標記位於肽底物的剪切位點的任何一側。細胞—可滲透的PNA-caspase嵌合體的混合物被加入到目標細胞樣品中。調亡前刺激，如TNF-α或Fas配體可被加入到選擇的樣品中引發細胞程序死亡信號。細胞調亡通道的活化導致各種caspase底物，包括PNA-caspase嵌合體的剪切。含在雙標記的PNA嵌合體中的一種螢光染料被caspase-催化的剪切而消除。當細胞被溶解時，PNA嵌合體被釋放。然後，釋放的PNA嵌合體被捕獲到寡核苷酸功能化的微粒子上。來自單標記—剪切產物或雙標記—剪切產物的螢光被確認和分析。
在本發明的另一實施方式中，該方法在識別新藥中是有用的。在該實施方式中，小分子藥物候選物被結合到PNAs上測試其效果。這種PNA—小分子嵌合體可被用於藥物研究的配體的高通量的篩選。這種方法的一個例子顯示在圖8中。這裡，製備一PNA-小分子嵌合體文庫用於進行篩選。每種嵌合體含有特定的小分子作為底物區域，以及PNA寡聚物與已知的鹼基序列作為錨定區域。PNA-小分子嵌合體的混合物被加入到目標細胞培養液中，並被結合嵌合到目標對象上，並且引發目標細胞的活化。圖8顯示了G-蛋白質偶合的受體(GPCR)，其引發信號傳導。活化後，有效的PNA-小分子嵌合體被捕獲到位於彩色編碼的微粒子上的與之互補的寡核苷酸上。可通過探測小分子上的標記或結合可探測的小分子特異性配體的方式來進行探測。也可以通過在溫度高於以捕獲或錨定域形成的雙鏈體的融化溫度的溶液中對粒子進行培養而除去捕獲的小分子PNAs。
除了通過螢光光譜探測外，也可以通過流式細胞計來探測雜交到在以彩色編碼的微粒子上的互補寡核苷酸上的PNA嵌合體的平面陣列，以及單個微粒子-顯示的PNA-嵌合體。這種實施方式如圖9所示。因此，將PNA嵌合體特異性地雜交到固定在彩色編碼的微粒上的寡核苷酸上的過程可以在懸浮液中進行。雜交後，粒子用具有高結合親和力的配體進行培養，成為感興趣的嵌合體的修飾的底物部位。另外，配體可以含有特異性的螢光物用於探測。另外，第二可探測的配體可以修飾結合到嵌合體上的主要配體，保證探測螢光物的發射波長與彩色編碼的粒子的螢光不同。為了探測PNA雜交，粒子用流式細胞計數分析。不同類型的粒子根據它們自生的特異性螢光而被識別。具有捕獲PNA嵌合體的粒子可根據來自探測螢光物的特異性螢光而被識別。
在本發明的另一實施方式中，PNA嵌合體被用作探測和分離特定的細胞，即在它們的細胞表面上表達特殊蛋白質或其它識別體的細胞。例如，PNA-抗體嵌合體被產生，其中，抗體對於感興趣的細胞表面受體來說是特異性的。抗體可以用螢光染料標記以監控捕獲過程。該方法的一個例子如圖10所示。CD4+細胞和CD8+細胞被探測和捕獲。Cy3和Cy5是水溶性的花青染料，其是蛋白質、修飾的寡核苷酸和含一級胺的化合物的螢光標記物。
在本發明的另一實施方式中，PNA嵌合體的底物部位包含核酸結合區域。在該實施方式中，PNA嵌合體暴露在可探測的核酸前，該核酸被認為能夠與嵌合體的功能域相互作為。然後，結合核酸被捕獲到固定基質上的寡核苷酸上並被探測到。該實施方式也可能是多元的。
以下的實施例描述了如何製備和使用本發明。並對這些例子加以了圖解說明。但並非用於對本發明作任何限制。在此描述的所有的文獻特別被引入作為參考。
實施例實施例1將DNA寡核苷酸偶合到用於PNA嵌合體的捕獲的微粒表面有兩種不通的方法可以將寡核苷酸探針附著到固體表面上，該固體表明如彩色編碼的微粒。在第一種方法的間接偶合中，結合到固體表面的生物素化寡核苷酸與鏈黴抗生物素蛋白或其衍生物相互作用。將蛋白質結合到固體表面如微粒上的方法在現有技術中已有報導(BioconjugateTechniques，由Greg T.Hermanson編輯，Academic Press，1995)。如圖11A所示，生物素化寡核苷酸有效地偶合到中性抗生物素蛋白上，該中性抗生物素蛋白是一種修飾形式的鏈黴抗生物素蛋白，並且已經被結合到微粒上。簡而言之，對於固定數量的彩色編碼的中性抗生物素蛋白功能化的珠來說，被培養的Cy-5標記的生物素化寡核苷酸(0.488，0.977，1.953，3.906，7.813，15.63，31.25，62.5，125和250nM)的量增加。在室溫條件下，偶合反應在PBS上進行30分鐘。偶合之後，未束縛的寡核苷酸通過用PBST洗滌珠而除去。微粒的表面上未被佔據的位點利用BSA(10mg/ml，在100mM磷酸鹽緩衝液中，pH為7.4)封閉。經100mM，pH值為7.4的磷酸鹽緩衝液的洗滌之後，微粒可以被存儲在4℃的貯存緩衝液中。然後，不同類型的珠一起被放進一個試驗試管中用於組裝形成微粒陣列。在螢光顯微鏡下檢測陣列。圖11A中顯示了中性抗生物素蛋白的滴定系列的結果。31nM的生物素化寡核苷酸的偶合能夠使中性抗生物素蛋白功能化的珠(直徑為3.2μm)上的所有位點飽和，這顯示了當寡核苷酸濃度增加時，以1000ms積分記錄的Cy5信號強度大致從100增加到6000。在圖11A中顯示的誤差條線顯示了平均標準偏差。
寡核苷酸也可以通過形成共價連接而直接結合到固體載體的表面上。根據現有方法，氨基可以結合到寡核苷酸的5』終端。將寡核苷酸結合到甲苯磺醯基活化的微粒上可以在一個單步反應中達到。圖11B中顯示了以胺-甲苯磺醯基為媒介的直接偶合的例子。簡言之，對於固定數量的彩色編碼的甲苯磺醯基-活化珠來說，被培養的Cy-5標記的氨基修飾寡核苷酸(0.977，1.953，3.906，7.813，15.63，31.25，62.5，125，250和500nM)的量增加。一般來說，偶合反應在100mM且pH為7.4的磷酸鈉溶液中在37℃下過夜。偶合之後，未束縛的寡核苷酸通過用PBST洗滌珠除去，並且微粒用牛血清白蛋白(BSA)(10mg/ml，在100mM磷酸鹽緩衝液中，pH為7.4)將微粒表面未佔據的位點封閉。封閉是在37℃下在恆定轉速的狀態下進行1小時。然後，不同類型的珠一起被放進一個試驗試管中用於組裝形成微粒陣列。在螢光顯微鏡下檢測陣列。在圖11B中顯示的滴定系列的結果表明當寡核苷酸濃度增加時，以1000ms積分記錄的Cy5信號強度大致從100增加到5000。在圖11B中顯示的誤差條線顯示了該方法的標準偏差。利用250nM氨標記的寡核苷酸的偶合能夠使甲苯磺醯基-活化包覆的珠(直徑3.2μm)上的所有位點飽和。在用100mM且pH為7.4的磷酸鹽緩衝液洗滌之後，寡核苷酸功能化的微粒可以以恆定轉速存儲在4℃的貯存緩衝液(100mM磷酸鹽，1mM EDTA，含有0.05％疊氮化鈉)中。
實施例2生物素化PNA寡聚物的提純合成的PNA嵌合體可以通過液相色譜提純。圖2顯示了兩種生物素化PNA寡聚物的用高壓液相色譜(HPLC)提純的例子。生物素化的雙-PNA(「PNA夾」)和線性PNA分別具有4.3kD和7.5kD的分子量。PNA寡聚物在凝膠過濾柱上，在10mM的Tris-緩衝液、pH值為7.5、和125mM NaCl中的分離，並以260nm的波長監測色譜的圖像。流率為0.5ml/分鐘的0.5ml洗脫液中的48種餾分被收集。兩個特別的單峰，一短一高分別對應於4.3kDdePNA夾(第25餾分)和7.5kD的線性PNA(第28餾分)。提純的PNA寡聚物的分子量通過質譜分析確定。
實施例3提純的PNA-肽嵌合體的分光光度性能為了驗證PNA嵌合體的螢光標記，通過掃描分光光度計記錄提純的PNA嵌合體的分光光度性能。在圖13A和13B示出的提純的四甲基若丹明(TMR)標記的PNA肽嵌合體以及Cy5標記的PNA的分光光度性能分別顯示了PNA和螢光染料不同的吸收特徵。250-300nm波長範圍的峰對應於含有或不含有肽的PNA，其中，TMR標記(圖13A)通過500-550nm範圍的峰值識別，並且Cy5標記(圖13B)通過625-675nm波長範圍的峰識別。
實施例4將雙-PNA寡聚物進行晶片上雜交到微粒陳列上的DNA寡核苷酸上進行晶片上雜交試驗是為了確定固定在微粒陣列上的DNA寡核苷酸對雙-PNA寡聚物的序列特異性捕獲。簡言之，雙-PNA寡聚物是一個在每個臂上具有12-13個胸腺嘧啶鹼基的PNA夾。在雜交之前，四種類型的生物素化寡核苷酸被偶合到中性抗生物素蛋白功能化的微粒上，每個寡核苷酸分別含有18-mer的低聚腺嘌呤(A-18)、18個核苷酸(N-18)的非相關序列、10-mer聚合腺嘌呤(A-10)以及10個核苷酸(N-10)的非相關序列。偶合之後，所有的低聚核酸功能化的微粒於不含有寡核苷酸捕獲探針的負對照粒子被放入到一個試管中用於在矽片上組裝成微粒陣列。晶片首先在含有90mM NaCl、83mM硫氰酸胍、8mM MgCl2、17nMEDTA、0.1％生物素、0.1Tween-20、70mM Tris-HCl，pH為7.5的緩衝液中，在40℃下預雜交20分鐘。然後，生物素化的雙-PNA被加入到預雜交緩衝液中形成200nM的最終濃度。雜交在40℃的增溼房內進行1小時。負對照晶片在雜交緩衝液中不接受PNA。雜交完成後，在室溫下，晶片用100mM NaCl、10mM Tris-HCl，pH為7.5、0.1％Tween-20衝洗10分鐘。為了對生物素化PNA雜交到有粒子陳列的寡核苷酸控針上進行探測，晶片在100mM NaCl、100mM磷酸鈉，pH為7.5的溶液中用Cy5結合的鏈黴抗生物素蛋白在室溫下培養30分鐘。在用15mM NaCl、10mMTris-HCl，pH為7.5的溶液衝洗後，利用螢光顯微鏡觀察陣列。利用通過特定波長的不同過濾器可從同一晶片中得到不同的圖像。根據微粒各自的顏色代碼可以確定微粒的特徵。來自晶片的Cy5晶片圖像的珠的試驗信號和解碼的粒子合併。來自匹配的A-10和A-18粒子的試驗信號以及來自未匹配的N-10和A-18粒子的試驗信號被提取用來分析。具有Cy5信號的粒子通過標準圖像分析識別。如圖14所示，雙-PNA夾特異性地雜交到聚腺嘌呤的10-mers和18-mers功能化的粒子上，其中，雙-PNA夾不能雜交到非相關的核苷酸系列(N-10或N-18)上。相反，負對照陣列未捕獲PNA。利用電腦程式來自動排列來自晶片的圖像。從圖像中提出不同波長下的螢光強度，並分配給晶片上的對應的粒子。然後，染汙的珠的內部染料的螢光強度被聚集在一起。
實施例5將雙-PNA寡聚物雜交到彩色編碼的微粒上的DNA寡核苷酸上的試管內雜交。
進行試管內雜交試驗是為了確定在彩色編碼的微粒上的DNA寡核苷酸對雙-PNA寡聚物的序列特異性捕獲。簡言之，雙-PNA寡聚物是一種在每個臂上有12-13個胸腺嘧啶鹼基的生物素化PNA夾。在雜交之前，四種類型的生物素化寡核苷酸被偶合到中性抗生物素蛋白功能化的微粒上，寡核苷酸分別含有18-mer低聚腺嘌呤(A-18)、18個核苷(N-18)的非相關序列、10-mer聚腺嘌呤(A-10)以及10個核苷酸(N-10)的非相關序列。在表面上，調控微粒不含寡核苷酸。偶合之後，將所有低聚核酸功能化的微粒放入一個試管。低聚核酸功能化的微粒首先在含有90mM NaCl、83mM硫氰酸胍、8mM MgCl2、17mM EDTA、0.1％生物素、0.1Tween-20、70mM Tris-HCl，pH為7.5的緩衝液中，在40℃下預雜交20分鐘。接著，生物素化的雙-PNA被加入預雜交緩衝液中形成200nM的最終濃度。雜交在40℃的增溼房內進行1小時。負對照在雜交緩衝液中沒有PNA時被檢驗。雜交完成後，在室溫下，粒子用100mM NaCl、10mM Tris-HCl，pH為7.5、0.1％Tween-20衝洗10分鐘，然後在矽晶片上組裝微粒陣列。為了探測被捕獲生物素化PNA，晶片在100mM NaCl、100mM磷酸鈉且pH為7.5的溶液中用Cy5.5結合的鏈黴抗生物素蛋白(20mg/ml)在室溫下培養30分鐘。在用15mM NaCl、10mM Tris-HCl，pH為7.5的溶液衝洗後，利用螢光顯微鏡檢查陣列。根據微粒各自的顏色代碼可以確定微粒的特徵。具有Cy5.5信號的粒子通過電腦程式來識別。如圖15A顯示，雙-PNA夾明顯雜交到A-18功能化的粒子上，而沒有雜交到C-18和N-18上，更具體地，雙-PNA夾被特異地捕獲到A-18上，並且在Cy5.5通道上在1000ms內積分產生一個約4750個規定單元的Cy5.5信號，同時C-18和N-18功能化粒子分別產生了約500和1000的Cy5.5信號。由試管內PNA雜交產生的Cy5.5信號強度(圖15A)可以與實施例4敘述的晶片上雜交(圖15B)相穩合。
實施例6將PNA-蛋白質嵌合體雜交到排列在微粒陣列上的DNA寡核苷酸進行晶片上雜交試驗是為了確定固定在微粒陣列上的DNA寡核苷酸對雙-PNA寡聚物的序列特異性捕獲。簡言之，雙-PNA蛋白質嵌合體是一個Cy5.5標記的鏈黴抗生物素蛋白和生物素化PNA夾的配合體。每個陣列上PNA夾含有12-13個胸腺嘧啶鹼基。在配合中使用適當量的Cy5.5標記鏈黴抗生物素蛋白和生物素化的PNA，該配合在室溫下在PBS中進行30分鐘。在雜交之前，四種類型的生物素化的寡核苷酸被偶合到中性抗生物素蛋白功能化的微粒上，寡核苷酸分別含有18-mer低聚腺嘌呤(A-18)、18個核苷酸(N-18)的非相關序列、10-mer聚合腺嘌呤(A-10)以及10個核苷酸(N-10)的非相關序列。偶合之後，所有的低聚核酸功能化的微粒和不含有寡核苷酸捕獲探針的負對照粒子被放到一個試管內用於在矽晶片上組裝微粒陣列。晶片首先在含有90mM NaCl、83mM硫氰酸胍、8mM MgCl2、17nM EDTA、0.1％生物素、0.1Tween-20、70mMTris-HCl，pH為7.5的緩衝液中，在40℃下預雜交20分鐘。然後，雙-PNA被加入雜交緩衝液中形成200nM的最終濃度。雜交在40℃的增溼房內進行1小時。負對照晶片在雜交緩衝液中沒有接受到PNA。雜交完成後，在室溫下，晶片用100mM NaCl、10mM Tris-HCl，pH為7.5、0.1％Tween-20衝洗10分鐘。利用螢光顯微鏡檢查陣列。通過使用能夠透過特定波的光的不同的過濾器，從相同晶片中取得一些圖像。根據微粒各自的顏色代碼可以識別微粒。具有Cy5.5信號的粒子通過在實施例4中描述的標準圖像分析得以確認。如圖16所示，是雙-PNA蛋白質嵌合體特異性地雜交到與晶片上(以1000ms間隔的140Cy5.5信號強度)18-mers的聚腺嘌呤偶合的粒子上，其與無PNA的對照晶片形成比較。在兩種情況下，C-18，N-18和對照(無；在表面上沒有寡核苷酸)僅導致了約45個單元的Cy5.5信號強度(以1000ms積分)。
實施例7從生物素化PNA寡聚物到固定在磁性彩色編碼碼的微粒子上的寡核苷酸的晶片上雜交從目標分子到寡核苷酸探針的晶片上雜交被固定在彩色編碼的磁性粒子上。具體地，具有已知核苷酸序列(0.4μm)的生物素化寡核苷酸被偶合到表面披覆了中性抗生物素蛋白的以彩色編碼的給定類型的磁性粒子(約6.7×105個粒子)上。偶合反應在0.1ml的緩衝液(150mM NaCl，0.05mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0.5％牛血清白蛋白，0.5mM Tris-HCl和100mM磷酸鈉，pH7.2)中在室溫下旋轉進行30分鐘。偶合之後，粒子利用一種磁性體收集。未反應的中性抗生物素蛋白位點在旋轉的150mM NaCl和100mM磷酸鈉含有0.05％Tween-20且pH值為7.2的溶液中在室溫下利用0.1％的生物素封閉。封閉之後，粒子用0.2ml的150mMNaCl和100mM磷酸鈉0.2ml含有0.05％Tween-20且pH為7.2的溶液衝洗。這種配製也可以應用到將其它生物素化寡核苷酸偶合到其它類型的中性抗生物素蛋白披覆粒子中。
幾種類型的彩色編碼的低聚核酸功能化的微粒，包括磁性粒子和非磁性對照粒子，被一同放到一個試管中用於根據現有方法組裝成微粒子陣列。在這個例子中，陣列形成在2.5×2.5mm的矽質晶片上，其含有4000個位點的陣列模板。生物素化肽核酸(PNA)底聚物在顯示互補寡核苷酸捕獲探針的微粒子陣列上的晶片上雜交是在30微升的雜交緩衝液(90mM NaCl、83mM硫氰酸胍、8mM MgCl2、17nM EDTA、0.02％生物素、0.1Tween-20、70mM Tris-HCl，pH為7.5)中進行的，其中雜交緩衝液含有200nM濃度的生物素化PNA寡聚物。在40℃下，雜交在一個旋轉振蕩器上進行60分鐘。等到雜交完成，在室溫下，將陣列用50微升的250mM NaCl、10mM Tris-HCl且pH為7.5、0.1％Tween-20衝洗10分鐘。通過在150mM NaCl、10mM磷酸鈉且pH為7.2下，用Cy5.5-結合鏈黴抗生物素蛋白(18mg/ml)在室溫下對微粒陣列進行培養30分鐘後，可觀察到捕獲的生物素化的PNA寡聚物。在用15mM NaCl、10mMTris-HCl且pH為7.5的溶液衝洗後，在螢光顯微鏡下檢查陣列。從彩色編碼的微粒和Cy5.5標記的PNA寡聚物發出的螢光可以通過利用具有特定波長的光學過濾器而確定。對磁性或非磁性粒子根據其顏色代碼解碼。具有Cy5信號的粒子通過如圖4顯示的標準圖像分析來識別。如圖17顯示的試驗結果表明，PNAs特異性雜交到陳列在彩色編碼磁性和非磁性粒子上的互補寡核苷酸上。更具體地，從來自晶片上雜交試驗中的兩個微粒陣列(晶片A和B，分別為板A和B)的四種類型的彩色編碼微粒(I、II、III、IV)來確定Cy5.5信號強度。類型I的粒子是彩色編碼的磁性粒子，而類型II、III和IV是三種不同類型的非磁性的彩色編碼的粒子。類型I和II的粒子用與PNA寡聚物互補的生物素化寡核苷酸固定。類型III粒子利用具有非相關鹼基序列的寡核苷酸偶合到PNA上。類型IV粒子在表面上沒有寡核苷酸。晶片B作為晶片A的負對照，其利用沒有PNA的雜交混和物培養。「n」表示晶片上的粒子數量。類型I和類型II的粒子分別產生約2250和1500的信號強度，而類型III和類型IV不產生明顯螢光，約400和250Cy5.5信號強度。直方圖表示了標準平均偏差。
實施例8從PNA小分子嵌合體到微粒陣列上的寡核苷酸的晶片上雜交。
進行試管內雜交分析是為了確定位於彩色編碼的微粒陣列上的DNA寡核苷酸對雙-PNA-小分子嵌合體的序列特異性捕獲。簡言之，雙-PNA-小分子嵌合體是一種在每個臂上含有10個鹼基和Cy5染料的雙-PNA的共軛物，這在圖13和實施例3中已有所述。在雜交之前，如實施例1所述，四種類型的生物素化的寡核苷酸被偶合到中性抗生物素蛋白功能化的微粒上。寡核苷酸分別含有如下序列10-mer聚腺嘌呤(A-10)和10mer、每一個互補到雙-PNA寡聚物(P-10)的一個臂上。還包括有未顯示寡核苷酸捕獲探針的對照微粒。偶合之後，所有低聚核酸功能化的微粒和不含寡核苷酸捕獲探針的負對照粒子放到一個試管中用於在矽晶片上組裝微粒陣列。晶片首先在含有90mM NaCl、83mM硫氰酸胍、8mM MgCl2、17nM EDTA、0.1％生物素、0.1Tween-20、70mM Tris-HCl且pH為7.5的緩衝液中，在40℃下預雜交20分鐘。雙-PNA-Cy5共軛體被加入到預雜交的緩衝液中形成約200nM的最終濃度。雜交在40℃的增溼房內進行1小時。負對照晶片被放到不含有PNA嵌合體的雜交緩衝液中。雜交完成後，晶片用15mM NaCl、10mM Tris-HCl且pH為7.5溶液衝洗，然後在螢光顯微鏡下檢查。根據微粒各自的顏色代碼可以確定微粒。具有Cy5.5信號的粒子通過如實施例4所述的標準圖像分析可從珠中識別出。圖18顯示的晶片分析結果顯示了雙-PNA-小分子嵌合體特異性雜交到用互補P-10捕獲探針功能化的粒子上，但沒有雜交到A-10粒子和對照粒子上，該雙-PNA-小分子嵌合體產生雜交信號(以500ms整段時間記)，而在晶片上的粒子沒有產生明顯的信號。誤差條線表示方法的標準偏差。
實施例9在微粒陣列上同時產生三種磷酸化肽的標準曲線三種不同的生物素化磷酸化肽(肽-P-1，肽-P-2和肽-P-3)。多肽P-1生物素-CKVEKIGEGT[pY]GVVYK(序列ID號1))，衍生於人類酪氨酸致活酶底物p34cdc2，其中，在胺基酸11上的酪氨酸被磷酸化(Cheng，et al.J.Biol.Chem.2679248-9256，1992)。肽-P-2生物素-CEGPWLEEEEEA[pY]GWMDFK-生物素(序列ID號2))，是人類胃泌激素-17，在酪氨酸的13位上被磷酸化(Baldwin et al，Nature，301，435-437，1983)。肽-P-3生物素-CRRLIEDAE[py]AARGK(序列ID號3))，衍生於來自勞氏肉瘤病毒轉移蛋白在p60src上酪氨酸磷酸化位點，在胺基酸10上的酪氨酸上被磷酸化(Casnelli et al，PNAS 79282-286，1982)。在規定濃度0，0.0012，0.0024，0.0048，0.0064，0.008和0.012pg/ml下，肽-P-1、肽-P-2以及肽-P-3被偶合到彩色編碼的微粒上，這種微粒如前述的實施例1已經用中性抗生物素蛋白功能化了。然後，所有肽功能化的微粒按照現有的方法如實施例1所述合併用於組裝成微粒陣列。組裝的微粒陣列利用對所有肽上磷酸化修飾都具有特異性的單克隆抗體進行培養。為了達到將信號放大的目的，用螢光染色標記的次要抗體對晶片進行培養，其中，次要抗體對結合在陣列上的主要單克隆抗體具有特異性。用PBST洗滌後，陣列根據現有技術中的方法如READ分析法利用螢光顯微鏡檢查。通過利用這種方法，三種磷酸化肽的標準曲線通過利用一種微粒陣列而產生(圖19)。隨著肽濃度的增加，在以500ms為整段時間的對應於三種磷酸化肽的Cy5螢光信號強度也增加了，以500ms為整段時間中Cy5信號強度的範圍為400-1400單位。圖19顯示的誤差條線表示方法的標準偏差。
實施例10微粒陣列上磷酸化肽的標準曲線的產生每種如實施例9所述的具有規定濃度0，0.002，0.004，0.008，0.01和0.12μg/ml的生物素化磷酸化的肽(肽-P-1和肽-P-2)被偶合到特定類型的彩色編碼珠上，這種珠已經根據現有技術如實施例1的方法在其表面上披覆了中性抗生物素蛋白。粒子的表面上未反應的位點根據現有技術的方法封閉。然後，根據現有方法，具有相同類型的磷酸化肽的功能化珠一起放到試驗試管中，根據現有方法用於組裝成粒子陣列。現有的方法如LEAPS和在臨時專利申請號60/343,621(2001年12月28日遞交)以及美國申請號10/192,352(2002年7月9日遞交)中描述的直接沉澱組裝的方法。組裝的微粒陣列利用對所有肽上磷酸化修飾具有特異性的單克隆抗體進行培養。為了達到將信號放大的目的，主要單克隆抗體利用特異性的次要抗體和螢光(Cy5)標記的第三種抗體而被進一步結合。用PBST洗滌後，陣列根據現有技術中的方法如READ分析法利用螢光顯微鏡檢查。通過這種方法，利用一種微粒陣列產生磷酸化肽標準曲線(圖20)。對於肽-P-1，以500ms積分的Cy5信號強度從約500增加到5000個單位，峰值出現在0.008μg/ml濃度上。類似地，對於肽-P-2，以500ms積分的Cy5信號強度從約500增加到4500個單位，峰值出現在0.008μg/ml濃度上。圖20顯示的誤差條線表示表示方法的標準偏差。
實施例11利用在微粒陣列上的過氧化酶結合的抗體對磷酸化肽的免疫探測每種生物素化磷酸化肽或生物素化非磷酸化肽被偶合到特定類型的彩色編碼珠上，這種珠已經根據現有技術如實施例1的方法在其表面上披覆了中性抗生物素蛋白。載體表面上的肽密度如實施例1所述達到最大化。偶合之後，將粒子用加入了0.05％Tween-20(PBBST)的磷酸緩衝的鹽水(PBS；0.1M磷酸鈉，0.15氯化鈉，pH值為7.2)洗滌。然後，根據現有方法，所有肽功能化的珠被一起放到測試試管中用於微粒子陣列的組裝。現有的方法如靠近表面光控電動微粒組裝(LEAPS)和臨時專利申請號60/343621(2001年12月28日遞交)以及美國申請號10/192352(2002年7月9日遞交)所述的直接沉積組裝的方法。組裝的微粒子陣列在PBST中利用1％的牛血清白蛋白(BSA)封閉。對於在陣列上磷酸化肽的免疫探測，晶片利用對磷酸化修飾具有特異性的過氧化酶配合的單克隆抗體進行培養。為了將抗體結合到磷酸化的肽上，培養在增溼房內進行。抗體結合的微粒子陣列利用PBST來洗滌，然後根據現有技術利用過氧化酶底物探測，現有技術如分子探針的酪醯胺試劑(如分類號T-20912，T-20916等)。
通過利用酪醯胺試劑對磷酸化肽的免疫探測的結果顯示在圖21中。簡言之，四種類型彩色編碼微粒的每一種和兩種磷酸化肽(Ty-p-1或多肽P-2)之一、或一種非磷酸化肽，或無肽的對照例(PBS)進行偶合，其中，在酪氨酸的14位置上被磷酸化，其中，Ty-1是生物素-KVEKIGEGTYGVVYK(序列ID號4)，Ty-P-1是Ty-1，但在胺基酸10的上有一個磷酸化的酪氨酸(生物素-KVEKIGEGT[pY]GVVYK)，並且肽-P-2生物素-CEGPWLEEEEEEA[pY]GWMDFK(序列ID號2)。肽功能化的微粒被組裝到粒子陣列，利用對修飾具有特異性的鹼性磷酸酶配合的單克隆抗體進行免疫探測。通過利用酪醯胺試劑對結合抗體進行探測。來自珠的螢光信號根據現有方法利用螢光顯微鏡探測，現有的方法如隨機編碼陣列探測(READ)分析。簡言之，從彩色編碼微粒及被分析物發出的螢光通過利用特定的光學過濾器確定。粒子的等同物根據其獨特的顏色代碼被解碼。具有正測定信號的粒子通過如實施例4所述的標準圖象分析識別。由鹼性磷酸酶催化化學反應產生的螢光產物----螢光素isothiocynate(FITC)沉積在結合抗體的珠上。圖21顯示在磷酸化肽中較高的FITC信號強度，對於Ty-P-1在1000ms內的積分為11000單位，對於Ty-P-2在1000ms內的積分為15000單位，沒有磷酸化的Ty-1或對照例中顯示了明顯低的信號，大約在1000ms內的積分為700單位。圖21顯示的誤差條線表示方法的標準偏差。
實施例12在微粒陣列上利用螢光染料標記的抗體對磷酸化肽的探測每種生物素化磷酸化肽或生物素化非磷酸化肽被偶合到特定類型的彩色編碼珠上，這種珠已經根據現有技術如實施例1的方法在其表面上披覆了中性抗生物素蛋白。載體表面上的肽密度如實施例1所述達到最大化。偶合之後，將粒子用PBST洗滌。然後，根據現有方法，所有肽功能化珠被一起放到測試試管中用於微粒子陣列的組裝。現有的方法如(LEAPS)和臨時專利申請號60/343621(2001年12月28日遞交)以及美國申請號10/192352(2002年7月9日遞交)所述的直接沉積組裝的方法。組裝的微粒陣列在PBST中利用1％的BSA封閉。對於在陣列上磷酸化肽的免疫探測，晶片利用對磷酸化修飾具有特異性的單克隆抗體進行培養。為了將抗體結合到磷酸化的肽上，培養在增溼房內進行。未結合的抗體利用PBST來洗滌。為了達到信號放大的目的，用對結合在陣列上的主要單克隆抗體具有特異性的次要抗體培養晶片。通過用對次要抗體具有特異性的螢光標記的抗體對晶片進一步培養，信號可以被進一步放大。用PBST衝洗之後，然後根據現有方法如READ測定，利用螢光顯微鏡驗查陣列。
在微粒陣列上通過利用螢光標記的抗體對磷酸化肽的免疫探測的結果顯示在圖22中。簡言之，四種類型彩色編碼微粒的每一種和兩種磷酸化肽(Ty-p-1或肽-P-2)之一、一種實施例11中所述的非磷酸化多肽(Ty-1)或無肽的對照例偶合。肽功能化微粒被組裝到粒子陣列。利用對磷酸化肽特異的單克隆鼠lgG抗體對晶片進行培養，然後利用對鼠lgG-特異性的次級抗體進行培養，然後用Cy5標記的第三抗體利用螢光顯微鏡進行探測。通過Cy5信號探測螢光。圖22顯示在磷酸化肽中較高的Cy5信號強度，對於Ty-P-1在1000ms內的積分為15000單位，對於肽-P-2在1000ms內的積分為15500單位，沒有磷酸化的Ty-1或對照例中顯示了明顯低的信號，大約在1000ms內的積分為1400單位。圖22顯示的誤差條線表示方法的標準偏差。
實施例13在微粒陣列上利用螢光染料標記的抗體對多磷酸化肽的探測每種生物素化磷酸化肽或生物素化非磷酸化肽被偶合到特定類型的彩色編碼珠上，這種珠已經根據現有技術如實施例1的方法在其表面上披覆了中性抗生物素蛋白。載體表面上的肽密度如實施例1所述達到最大化。偶合之後，將粒子用PBST洗滌。然後，根據現有方法，所有肽功能化珠被一起放到測試試管中用於微粒子陣列的組裝。現有的方法如(LEAPS)和臨時專利申請號60/343621(2001年12月28日遞交)以及美國申請號10/192352(2002年7月9日遞交)所述的直接沉積組裝的方法。組裝的微粒陣列在PBST中利用1％的BSA封閉。對於在陣列上磷酸化肽的免疫探測，晶片利用對磷酸化修飾具有特異性的單克隆抗體進行培養。為了將抗體結合到磷酸化的肽上，培養在增溼房內進行。未結合的抗體利用PBST來洗滌。為了達到信號放大的目的，用對結合在陣列上的主要單克隆抗體具有特異性的次要抗體培養晶片。通過用對次要抗體具有特異性的螢光標記的抗體對晶片進一步培養，信號可以被進一步放大。用PBST衝洗之後，然後根據現有方法如READ測定，利用螢光顯微鏡驗查陣列。
在微粒陣列上通過利用螢光標記的抗體對磷酸化肽的免疫探測的結果顯示在圖22中。簡言之，如實施例9和11，六種類型彩色編碼微粒的每一種和四種磷酸化肽(肽-P-1、肽-P-2、肽-P-3或Ty-p-1)之一、一種非磷酸化肽(Ty-1)或無肽的對照例偶合。肽功能化微粒被組裝到粒子陣列中。利利用對磷酸化肽特異的單克隆鼠lgG抗體對晶片進行培養，然後利用對鼠lgG-特異性的次級抗體進行培養，然後用Cy5標記的第三抗體利用螢光顯微鏡進行探測。通過Cy5信號探測螢光。圖23顯示在磷酸化肽中較高的Cy5信號強度，對於肽-P-1、肽-P-2、肽-P-3和Ty-P-1在1000ms內的積分為約14000單位，沒有磷酸化的Ty-1或對照例中顯示了明顯低的信號，在1000ms內的積分約為500單位。圖23顯示的誤差條線表示方法的標準偏差。
實施例14雙重標記被分析物的比率量化(ratio quantification)一種被分析物可用兩種螢光染料標記。根據現有技術的方法，一種螢光染料標記被分析物的內部或外部，而另一種染料在感興趣的生化反應中參與到被分析物中。來自被分析物的螢光(被分析物信號)和來自測定的螢光可以根據現有技術如READ測定利用螢光顯微鏡確定。和反應效率相關的陣列信號通過比率量化來估計，即，測定中的測定信號與被分析物信號的比率。對於雙重標記被分析物的比率量化的常規設計如圖24A。
一種雙重標記PNA肽嵌合體的特異設計如圖24B中顯示。PNA-肽嵌合體含有合成肽的PNA錨定區域和功能區域。含有Caspase 3剪切位點的合成肽被C-端的螢光染料(Cy3)和N-端的聚組氨酸(His6)合圍。PNA-Caspase 3雙重標記肽嵌合體如下PNA-連接物-Cys(用於配合)His His His His His His Asp Glu Val Asp Ala Lys-(C18-間隔物)-Cy3(序列ID號5)。
嵌合體的Caspase 3消化(通過在冬氨酸殘基的3』位點剪切)導致Cy3螢光染料的剪切。消化後，嵌合體通過序列特異性的DNA/PNA雜交而被捕獲到特定彩色編碼微粒的表面。具有捕獲的PNA-肽嵌合體的微粒被組裝為微粒陣列。嵌合體上的His6標記通過晶片上His6-特異性單克隆抗體探測。主要單克隆抗體通過使用特異性次要抗體和螢光(Cy5)標記第三抗體而被進一步結合。來自微粒陣列的Cy3螢光強度和未剪切嵌合體的部位相關，而Cy5標記的強度對應於在微粒陣列上捕獲的嵌合體總量。這樣，相對Caspase3活性通過確定測定中Cy3與Cy5的比率來定量算出(圖24C)。由比率量化確定的結果顯示當Caspase3濃度(0，0.0625，0.125，0.5，1，2和4ng/μl)增加時，螢光Cy3/Cy5信號比率從約1降到0.6。圖24C顯示的誤差條線表示方法的標準偏差。
實施例15
通過流式細胞計探測雜交到彩色編碼的微粒上的寡核苷酸的PNA嵌合體圖25A顯示了通過流式細胞計探測雜交到彩色編碼的微粒上的寡核苷酸的PNA嵌合體。簡言之，兩種類型的標記綠色編碼的珠(綠A和綠B)分別與兩種具有特定鹼基序列(綠A生物素—間隔物—-AAAAAAAAAA，序列ID號6；綠B生物素—間隔物-AAGGAGAGAA，序列ID號7；)的寡核苷酸偶合。寡核苷酸在珠上的固定如實施例1所述或根據現有技術進行。綠A和B珠在綠色通道上具有獨特的發射波長，雖然橙色波長中發射的波長在珠上基本上重迭(圖25A)。寡核苷酸功能化的微粒被用於如實施例5中描述的試管內PNA雜交中。生物素化的PNA-肽嵌合體的PNA錨定區域結合到固定在綠B珠的互補的寡核苷酸傳感物上，而不會結合到綠A珠上的不匹配的寡核苷酸上。雜交之後，粒子用R-藻紅蛋白配合的鏈黴抗生物素(1∶100)1×PBS培養。R-藻紅蛋配合的鏈黴抗生物素結合到雜交到珠上的生物素化肽嵌合體。雜交PNA嵌合體的探測通過流式細胞計進行。(如圖25C的示意圖)。如圖25A，測定後，綠B珠獲得了明顯量的橙色螢光，其對應於R-藻紅蛋白的發射波長，這表明在測定中PNA肽嵌合體雜交到綠B上(圖25A)。流式細胞計的探測被用在試管內pPNA雜交到固定在微粒上的互補寡核苷酸上。兩種類型的中性抗生物素蛋白披覆的微粒之一利用生物素間隔A(10)固定，其它類型的微粒沒有用任何寡核苷酸固定。這兩種類型的珠用生物素化雙-pPNA嵌合體培養。雙-pPNA的錨定部位在用於雜交的每個臂上含有12-13胸腺嘧啶鹼基。在試管內條件下的洗滌和雜交如上所述。雜交之後，珠用螢光素(DTAF)-配合的鏈黴抗生物素(1∶300)在1×PBS中培養。螢光素(DTAF)-配合的鏈黴抗生物素被結合到雜交到珠上的生物素化pPNA嵌合體上。雜交的pPNA嵌合體的探測使用流式細胞計進行。
實施例16利用微粒陣列確定蛋白酶活性的底物肽的常規設計PNA-肽嵌合體底物可以用於確定蛋白酶活性的存在。合成的肽通常被用於蛋白酶活性的確定。這些PNA-肽嵌合體底物以至少三種形式的一種設計(圖26)。嵌合體的功能區域用一種螢光染料(I)，兩種螢光染料(II)和一種螢光染料加內部His6標記(III)標記。通過能夠剪切蛋白質的酶的蛋白酶消化作用利用三種不同標記PNA-肽嵌合體底物而被探測到。這種蛋白酶的例子包括胰島素、胰凝乳蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、鏈黴蛋白酶以及HIV-1蛋白酶。當使用單標記PNA肽嵌合體底物(I)時，蛋白酶的消化除去了來自消化的底物的螢光染料的。當使用雙標記PNA-肽嵌合體底物(II)時，蛋白酶的消化除去了來自底物的猝滅染料(Dye1)，導致分離產物發出Dye-2的螢光。當使用具有一種螢光標記的和一種內部對照標記(III)的PNA-肽嵌合體時，蛋白酶的消化除去了螢光染料。來自未剪切底物的螢光信號被歸一化到內部His6標記產生的探測信號水平，如實施例16所示。
實施例17使用微粒子陣列確定Caspase活性蛋白酶活性，如Caspase活性，通過使用末端標記的固定在固體表面的生物素化Caspase3肽底物而測得。等量的生物素化Caspase3肽底物與末端標記的螢光染料Cy5通過逐漸降低的純化的重組Caspase3(8，4.8，2.88，1.728，1.037，0.62，0.373，0.224，0.134，0.048和0mg/ml)而在溶液中被消化。消化後，消化產物被偶合到特定彩色編碼的微粒子的表面上，微粒子上按照現有技術，在其表面披覆了中性抗生物素蛋白。然後，肽-功能化的微粒子按照已知方法被組裝成微粒子陣列中，所述方法如LEAPS，和在臨時專利申請號60/343,621(2001年12月28日遞交)以及美國申請號10/192,352(2002年7月9日遞交)中描述的的直接沉積組裝方法。來自未剪切肽底物的螢光根據現有方法，如隨機編碼陣列檢測(READ)，使用螢光顯微鏡確定。蛋白酶消化將螢光染料從消化產物中除去。如圖27所示，在測定中產生了用於Caspase3消化的滴定。隨著Caspase3濃度由8降到0mg/ml，以1000ms積分得到的Cy5信號強度由2600上升至5200單元。圖27中的誤差條線表示方法的標準偏差。
實施例18微粒陣列上2×2PNA嵌合體竟爭測定微粒陣列上2×2PNA嵌合體竟爭測定被用來測試在其它PNA嵌合體存在的條件下捕獲到微粒陣列上的DNA寡核苷酸上的PNA嵌合體。簡言之，在測定中，用到了兩種具有不同鹼基序列的雙-PNA類型。一種是生物素化PNA夾(生物素-PNA-夾)，而另一種是配合了四甲基若丹明的雙-PNA-肽(雙-PNA-肽-TMR)。雜交之前，兩種類型的生物素化的寡核苷酸被偶合到限定類型的彩色編碼的微粒上，這種微粒根據已知的方法如實施例1所述的在其表面上披覆中性抗生物素蛋白。這些寡核苷酸序列分別是10-mer的聚腺嘌呤(A-10)和10-mer限定的核苷酸序列(P-10)。對照微粒(無)在其表面上不含有寡核苷酸。A-10寡核苷酸與生物素PNA夾的PNA互補，而P-10寡核苷酸與雙-PNA-肽-TMR嵌合體的PNA互補。偶合之後，所有的低聚核酸功能化的微粒被放入到一個試管中用於在矽片上組裝成微粒陣列。晶片首先在含有90mM NaCl、83mM硫氰酸胍、8mM MgCl2、17nM EDTA、0.1％生物素、0.1Tween-20、70mM Tris-HCl，pH為7.5的雜交緩衝液中，在40℃下預雜交20分鐘。然後，類似量的生物素-PNA-夾和雙-PNA-肽-TMR被加入到相同用於放置晶片的雜交緩衝液中。負對照晶片在雜交緩衝液中不接受PNA。雜交在40℃的增溼房內進行1小時。雜交完成後，在室溫下，晶片用100mM NaCl、10mM Tris-HCl，pH為7.5、0.196％Tween-20衝洗10分鐘。為了對雜交到粒子的生物素化PNA的探測，晶片用100mM NaCl、100mMTris-HCl，pH7.5，0.196 Tween-20，在室溫下衝洗10分鐘。為了探測雜交到粒子上的生物素化的PNAs，晶片在100mMNaCl，100mM磷酸鈉，pH為7.5的溶液中，用Cy5配合的鏈黴抗生物素蛋白(20pg/ml)在室溫下培養30分鐘。在用15mM NaCl、10mM Tris-HCl，pH為7.5的溶液衝洗後，利用螢光顯微鏡觀察晶片。粒子的標識根據其彩色代碼被解碼。具有若丹明的Cy5信號或Cy3信號的粒子通過使用如實施例4所述的電腦程式來識別。如圖28所示，如Cy5螢光所探測的，生物素-PNA-夾被特異性地捕獲到偶合了10-mer聚腺嘌呤的粒子上(以500ms積分大約為2250單位的Cy5信號強度)，如Cy3螢光所探測的，雙-PNA-肽-TMR嵌合體結合到晶片上具有P-10寡核苷酸的粒子上(以500ms積分大約為4500單位的Cy3信號強度)。
實施例19利用LEAPS組裝肽功能化微粒陣列兩種類型的彩色編碼的微粒，橙色球和綠色球，分別用一種合成的肽及其對應磷酸化肽偶合。除了在磷酸化肽的酪氨酸殘基上存在磷酸鹽基團外，肽的胺基酸序列是相同的。在一個試驗試管中將兩種類型的肽功能化微粒混和。微粒在矽質晶片上由如美國專利6251691公開的LEAPS的方法被組裝成微粒陣列。然後，微粒陣列利用對肽的磷酪氨酸為特異性的鼠單克隆抗體培養。在如實施例12所述，在晶片上通過利用Cy5標記的山羊抗鼠lgG探測單克隆抗體的結合。然後，晶片利用螢光顯微鏡檢查。橙色和綠色圖像用於將微粒解碼，而Cy5染色標記用磷酸化肽固定的綠色珠。更具體地，橙色珠的圖像表示非磷酸化的肽，而綠色珠表示磷酸化的肽。最終的分析圖像如圖29顯示含磷酪氨酸的特異性抗體的Cy5螢光染色。
實施例20DNA-肽嵌合體與偶合到微粒陣列上的彩色編碼珠的PNA的雜交與上述PNA-肽嵌合體相似，DNA寡核苷酸通過使用雙功能交聯劑配合到合成肽上。最終得到的配合被稱為DNA-肽嵌合體。DNA-肽嵌合體可以用於在微粒陣列上固定在彩色編碼珠的互補PNA寡聚物的雜交。肽部分可以含有至少一種標記，如生物素或螢光染料，用於探測珠上雜交的DNA-肽嵌合體。此外，對肽具有高親合性的配體或修飾的肽也可以用於探測。將DNA-肽嵌合體雜交到PNA-功能化微粒的原理在圖30A中說明。在本實施例中，DNA-肽嵌合體是脫氧腺嘌呤寡聚物(dA寡聚物)和生物素化合成肽的配合體，其具有雙功能交聯劑，SMCC(琥珀醯亞胺基4-(N-馬來醯亞胺甲基，環己胺-1-羧酸酯))。DNA-肽配合體利用液相色譜提純。提純的DNA-肽嵌合體用於與微粒陣列上固定在彩色編碼珠上的PNA胸腺嘧啶寡聚物雜交。雜交的DNA-肽嵌合體通過利用Cy3配合的鏈黴抗生物素探測。微粒陣列利用螢光顯微鏡檢查。珠顏色和Cy3雜交信號的螢光強度從陣列中確定。根據微粒顏色的代碼可以對微粒的身份識別。具有Cy3螢光染料的珠被探測和識別。如圖30B，DNA-肽嵌合體特異性地結合到PNA上，從以1000ms積分的Cy3信號強度為約1000個單位可以看出具有完全配對鹼基序列，而未完全配對鹼基序列的結果是以1000ms積分的Cy3信號強度約為300單位。
實施例21多底物的CASPASE消化caspase對多肽底物的反應性可以利用PNA-肽嵌合體來同步確定。在本實施例中，合成三種類型的PNA-肽嵌合體，I、II和III。每一個嵌合體含有具有限定的鹼基序列的獨一的PNA錨定部分，其與特異性caspase底物肽配合作為功能部分。PNA嵌合體I、II和III的功能部分分別含有胺基酸Asp-Glu-Val-Asp(序列ID號8)，Val-Glu-lle-Asp(序列ID號9)和Ile-Glu-Thr-Asp(序列ID號10)。這些合成的肽為已知的Caspase3，6，8。肽的C端標記有特定的螢光染料。嵌合體底物的Caspase消化導致了螢光染料從PNA的錨定部分除去。
多底物caspase消化建立如下一定量的嵌合體I、II和III被混合放到一個試驗試管中。嵌合體的等分試樣被加入分別含有Caspase3，6，8反應溶液中。嵌合體底物的Caspase的消化通過在水浴中培養反應混合物進行一定的時間進行。負對照是沒有任合caspase的反應混合物。消化之後，在反應混合物中加入含有胍HCl和去汙劑的等量雜交緩衝液形成雜交混和物。然後，雜交混合物用預組裝的微粒陣列培養。
根據現有方法，微粒陣列含有組裝在矽質晶片上的四種類型的彩色編碼珠。三種類型的珠被具有確定鹼基序列的寡核苷酸功能化，這三種類型分別以序列特異性的形式結合到PNA-肽嵌合體I、II和III上。除了編碼彩色外，四種類型的珠還含有與在標記在嵌合體上螢光染料匹配的顏色。
雜交之後，非特異性結合物從陣列洗去，並利用螢光顯微鏡檢查。雜交PNA嵌合體的測定信號顏色強度由陣列上珠確定。珠根據其預先確定的彩色代碼解碼。強度比，測定信號的比率和來自對照珠的信號被確定了。負對照反應給出測定中強度比的最高水平。對特殊底物的Caspase活性被表達為殘餘測定強度相對於每個晶片上負對照的比的百分比。研究中測定強度比的相對百分數概括如下表

粗體表示測定中比預期更強的消化實施例22利用PNA進行酶測定的流程圖此處公開的利用PNA嵌合體底物的多元測定具有相對於現有技術的幾種優勢。在PNA嵌合體構建中，PNA錨定部位在多元測定中起到了兩個重要的作用。首先，PNA的鹼基序列作為配合底物的代碼。其次，PNA寡聚物作為嵌合體的特異性錨形體，這種嵌合體可以被捕獲到在標記的固體表面的互補寡核苷酸上。沒有已知的蛋白酶和核酸酶用於PNA降解。這樣，PNA寡聚物在組織溶解產物中非常穩定。與DNA-DNA雜交相比，PNA在非常溫和的條件下雜交到互補的DNA寡核苷酸上。PNA-DNA複合體在低鹽溶液中是穩定的，即，該條件不適合DNA-DNA雜交。這樣，多PNA嵌合體底物可以被加入到普通的單一或多個類型酶反應的反應混和物中。如圖31所示，此處公開的多元測定可以以單一形式進行，其包括合成PNA嵌合體底物的步驟，進行多元測定的步驟，雜交到在彩色編碼微粒上的寡核苷酸上的步驟，探測修飾的底物的步驟，圖像獲取和數據分析的步驟。
實施例23多元測定作為優選實施方式之一，對於多底物酶反應，PNA-肽嵌合體是理想的底物，所述酶反應如致活酶測定(圖32A)，磷酸酶測定(圖32B)，caspase測定(圖32C)，配體結合測定(圖32D)。簡言之，PNA-肽嵌合體文庫可用感興趣的致活酶培養。在溶液中磷酸化反應後，磷酸化的肽可以在捕獲的PNA嵌合體上確定(圖32A)。這樣，用於致活酶的底物肽可以從文庫中識別。這種測定的設計可以應用到在藥物發現，以用於靶識別和在疾病中對改變的致活酶活性的識別。通過使用PNA-磷酸化肽嵌合體作為底物，類似的設計可以應用到多底物磷酸酶分析中(圖32B)，其可以用在藥物發現中，用於在不同的疾病階段識別特異性的磷酸酶抑制劑。此外，如實施例17所示，PNA-肽嵌合體可以被用於在試管中確定Caspase的活性。如圖32C所示，PNA-肽嵌合體文庫可以用感興趣的caspase培養。在消化後，底物肽可以從文庫中識別。這種測定的設計可以用於在調亡細胞中caspase抑制劑的識別。此外，PNA-肽嵌合體也可以用於蛋白質-蛋白質或蛋白質-核酸的相互反應的結合測定。如板C(圖32D)，在配體結合測定中，PNA-肽嵌合體文庫可以用感興趣的靶來培養。與特異性靶結合的PNA-肽嵌合體可以從文庫中識別(圖32D)。
上述不同優選實施例的描述用於說明和描述本發明的目的。但並不窮舉可限定本發明的公開的特定形式。根據上述教導的啟示，可以作出明顯的改進與修飾。所選擇和說明的實施例是用來為本領域技術人員實現各種實施例以及對實施例作出適於應用的不同修飾而提供的說明和實際應用例子。所有這些修飾與改進都應當包括在所附權利要求根據其要求的寬度解釋的範圍內，這些權利要求是平等，合法，公正賦予資格的。
序列表110生物晶片分析有限公司120分子構建以及生化反應探測的使用方法130PNA14010/2270121412002-08-2216010170FastSEQ for Windows Version 4.0210121116212PRT213人工序列220
223人類酪氨酸致活酶底物p34cdc2衍生的人工序列221磷酸化222(11)...(11)4001Cys Lys Val Glu Lys Ile Gly Glu Gly Thr Tyr Gly Val Val Tyr Lys1 5 10 15210221l19212PRT213人工序列220
223人類酪氨酸致活酶底物p34cdc2衍生的人工序列221磷酸化222(13)...(13)4002
Cys Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met1 5 10 15Asp Phe Lys210321115212PRT213人工序列220
223人類酪氨酸致活酶底物p34cdc2衍生的人工序列221磷酸化222(10)...(10)4003Cys Arg Arg Leu Ile Glu Asp Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Gly Lys1 5 10 15210421115212PRT213人工序列220
223人工序列-對照肽4004Lys Val Glu Lys Ile Gly Glu Gly Thr Tyr Gly Val Val Tyr Lys1 5 10 15210521112212PRT213人工序列220
223人工序列--caspase3衍生的
4005His His His His His His Asp Glu Val Asp Ala Lys1 5 10210621110212DNA213人工序列220
223人工序列-探針4006aaaaaaaaaa10210721110212DNA213人工序列220
223人工序列-探針4007aaggagagaa1021082114212PRT213人工序列220
223caspase衍生的肽4008Asp Glu Val Asp121092114212PRT213人工序列
220
223人工序列--caspase衍生的肽4009Val Glu Ile Asp1210102114212PRT213人工序列220
223caspase衍生的肽40010Ile Glu Thr Asp權利要求
1.一種分子構建，其包括(a)捕獲部位，其包括核酸或核酸衍生物；以及(b)底物部位。
2.權利要求1所述的構建，其中，底物部位包括從蛋白質、肽、碳水化合物、脂肪、核酸和輔助因子組中選擇出的實體。
3.權利要求1所述的構建，其中，底物部位包括蛋白質。
4.權利要求1所述的構建，其中，底物蛋白質包括肽。
5.權利要求1所述的構建，其中，底物部位用標記修飾。
6.權利要求5所述的構建，其中，標記從六組氨酸殘基、螢光部分、磷酸鹽基團以及糖基中選擇。
7.權利要求5所述的構建，其中，標記包括可探測的部分。
8.權利要求1所述的構建，其中，底物部位包括caspase或其活性肽。
9.權利要求1所述的構建，其中，底物部位包括JAK蛋白質或其的活性肽。
10.權利要求1所述的構建，其中，底物部位包括用於酶的底物。
11.權利要求1所述的構建，其中，底物部位包括用於核酸的結合位點。
12.權利要求1所述的構建，其中，底物部位包括酶的輔助因子。
13.權利要求1所述的構建，其中，捕獲部位是一種肽核酸。
14.權利要求1所述的構建，其中，底物部位包括STAT蛋白質或其的活性肽。
15.權利要求1所述的構建，其中，底物部位包括MAP致活酶或其活性肽。
16.權利要求1所述的構建，其中，底物部位包括Akt/SGK蛋白質或其活性肽。
17.權利要求1所述的構建，其中，底物部位包括PKD蛋白質或其活性肽。
18.權利要求1所述的構建，其中，底物部位包括小分子藥物候選物。
19.權利要求1所述的構建，其中，底物部位包括抗體或其的結合片段。
20.權利要求13所述的構建，其中，捕獲部位包括雙-PNA。
21.權利要求13所述的構建，其中，捕獲部位包括線性PNA。
22.權利要求1所述的構建，進一步包括連接物。
23.多個分子構建，其包括(a)多個捕獲部位群，其包括核酸和核酸衍生物，以及(b)多個底物部位，其中每個底物部位群配合到所選擇的捕獲部位群上。
24.一種在試樣中探測酶活性的方法，其包括以下步驟(a)將具有捕獲部位和底物部位的PNA-底物嵌合體加到被認為含有酶活性的試樣中，以使酶與嵌合體的底物部位發生反應；(b)從試樣中分離反應的PNA-底物嵌合體；(c)通過嵌合體的捕獲部位雜交到固定固體基質上的互補寡核苷酸上，而將反應PNA-底物嵌合體捕獲到固體基質上；(d)探測被捕獲的反應的PNA-底物嵌合體，其中，探測是對酶活性的測量。
25.權利要求24所述的方法，其中，樣品被認為是疾病細胞並且所探測的酶活性將指示疾病的存在。
26.權利要求25所述的方法，其中，酶從包括致活酶、caspases、磷酸酶、轉移酶以及蛋白酶的組中選擇。
27.權利要求25所述的方法，其中，疾病從神經紊亂、造血紊亂、肌肉骨骼紊亂心血管紊亂、淋巴紊亂、呼吸紊亂、內分泌紊亂以及腸胃紊亂中選擇。
28.權利要求24所述的方法，其中，PNA-底物嵌合體的捕獲部位包括雙-PNA。
29.權利要求24所述的方法，其中，PNA-底物嵌合體的底物部位為肽。
30.權利要求24所述的方法，其中，反應的PNA-底物嵌合體通過在底物部位的標記而被探測到。
31.一種在單個試樣中探測多種酶活性的方法，其包括(a)將多個PNA-底物嵌合體群加到樣品中，所述的PNA-底物嵌合體具有捕獲部位和底物部位，其中，每個群具有用於選擇的PNA序列的單一底物，以使酶與嵌合體群的底物部位反應；(b)從取樣中分離反應的PNA底物嵌合體群；(c)將反應PNA-底物嵌合體群捕獲到多個基質上，其中，每個基質在其上含有寡核苷酸，該核苷酸雜交到反應的PNA-底物嵌合的選擇群的捕獲部位；以及，(d)探測捕獲的反應的PNA-底物嵌合體群，其中，對多個群的探測是對多個酶活性的測量。
32.權利要求31所述的方法，其中，多個基質發生在單一固體表面上。
33.權利要求32所述的方法，其中，單一固體表面是微陣列。
34.權利要求31所述的方法，其中，多個基質包括微粒子。
35.權利要求34所述的方法，其中，微粒子是彩色編碼的。
36.權利要求31所述的方法，其中，PNA-底物嵌合體含有兩個標記。
37.權利要求36所述的方法，其中，標記為螢光部分。
38.權利要求31所述的方法，其中，PNA-底物嵌合體的底物部位是caspase的底物。
39.權利要求31所述的方法，其中，PNA-底物嵌合體的底物部位被致活酶磷酸化。
40.權利要求31所述的方法，其中，PNA-底物嵌合體的捕獲部位是雙-PNA。
41.一種在試樣中探測配體存在的方法，其包括(a)將具有捕獲部位和底物部位的PNA-底物嵌合體加到被認為含有配體的樣品中，以使配體結合到嵌合體的底物部位；(b)從試樣中分離結合配體的PNA底物嵌合體；(c)將結合配體的PNA-底物嵌合體捕獲到固定基質上，該過程通過將嵌合體的捕獲部位雜交到固體基質上的互補寡核苷酸上進行，以及，(d)探測捕獲的結合配體的PNA-底物嵌合體，其中，在探測是測量樣品中的配體存在。
42.權利要求41所述的方法，其中，配體包括核酸。
43.權利要求41所述的方法，其中，配體包括細胞表面受體。
44.權利要求41所述的方法，其中，PNA-底物嵌合體的底物部位包括抗體或其的片斷。
45.權利要求43所述的方法，其中，細胞表面受體為cd4。
46.權利要求41所述的方法，其中，樣品被認為是病態細胞樣品，並且配體的存在指示疾病的存在。
47.權利要求46所述的方法，其中，疾病從神經紊亂、造血紊亂、肌肉骨骼紊亂心血管紊亂、淋巴紊亂、呼吸紊亂、內分泌紊亂以及腸胃紊亂中選擇。
48.權利要求41所述的方法，其中，探測包括將可探測的抗體結合到結合配體的PNA-底物嵌合體上。
49.權利要求41所述的方法，其中，PNA-底物嵌合體的底物部位包括碳水化合物。
50.權利要求41所述的方法，其中，PNA-底物嵌合體的底物部位包括脂肪。
51.一種在單一試樣中探測多個配體存在的方法，其包括(a)將多個PNA-底物嵌合體群加到樣品中，所述的PNA-底物嵌合體具有捕獲部位和底物部位，其中，每個群具有用於選擇的PNA序列的單一底物部位，以使配體結合到嵌合體的底物部位；(b)從取樣中分離反應的PNA-底物嵌合體群；(c)將結合配體的PNA-底物嵌合體群捕獲到多個基質上，其中，每個基質在其上含有寡核苷酸，該核苷酸雜交到選擇的結合配體的PNA-底物嵌合體群的捕獲部位；以及，(d)探測捕獲的結合配體的PNA-底物嵌合體群，其中，在在多個群中的探測是對樣品中多個配體存在的測量。
52.權利要求51所述的方法，其中，配體為核酸，PNA-底物嵌合體的底物部位包括核酸結合區域。
53.權利要求51所述的方法，其中，配體為細胞表面受體，並且底物部位包括小分子藥物候選物。
54.權利要求51所述的方法，其中，多個基質為微粒子。
55.權利要求51所述的方法，其中，多個基質發生在單一固體表面上。
56.權利要求55所述的方法，其中，固體表面為矽晶片。
57.權利要求55所述的方法，其中，固體表面為微陣列。
58.權利要求54所述的方法，其中，微粒被彩色編碼。
59.權利要求54所述的方法，其中，微粒為磁性體。
60.權利要求51所述的方法，其中，PNA-嵌合體的捕獲部位為雙-PNA。
全文摘要
本發明涉及分子構建和使用它們探測生化反應的方法。本發明特別涉及具有捕獲部位和底物部位的分子構建，其中，捕獲部位能夠將構建從樣品中分離出來，底物部位能夠使構建發生作用，並經歷一可被測量或檢測到的改變。這些分子構建可以用於疾病診斷、對個體患某些疾病的可能進行基因篩選、以及通過使用高通量的化合物篩選的藥物發現以及毒性基因組學。
文檔編號C12Q1/68GK1495263SQ0315582
公開日2004年5月12日 申請日期2003年8月22日 優先權日2002年8月22日
發明者楊嘉誠 申請人:生物陣列技術有限公司