用於以原本狀態觀察生物試樣的利用電子顯微鏡的觀察方法、以及用於該方法的真空下...的製作方法

2023-10-22 17:16:37 4

用於以原本狀態觀察生物試樣的利用電子顯微鏡的觀察方法、以及用於該方法的真空下 ...的製作方法
【專利摘要】本發明提供一種利用電子顯微鏡進行觀察的方法、和用於該方法的真空下的蒸發抑制用組合物、掃描電子顯微鏡及透射電子顯微鏡，使用所述電子顯微鏡能夠在存活的狀態下觀察生物試樣，並且可以觀察活動情況。本發明的利用電子顯微鏡觀察試樣的方法包括以下工序：在試樣表面應用含有選自兩親性化合物、油脂類及離子液體中的至少1種的蒸發抑制用組合物形成薄膜，從而利用薄膜覆蓋該試樣的工序；和在顯示裝置上顯示收容於真空下的試樣室的用該薄膜覆蓋的試樣的電子顯微鏡圖像的工序。
【專利說明】用於以原本狀態觀察生物試樣的利用電子顯微鏡的觀察方法、以及用於該方法的真空下的蒸發抑制用組合物、掃描電子顯微鏡及透射電子顯微鏡
【技術領域】
[0001]本發明涉及對於掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡等，用於以原本狀態觀察生物試樣的利用電子顯微鏡的觀察方法及用於其的在真空下的蒸發抑制用組合物、掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡。
【背景技術】
[0002]為了使用掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡進行試樣觀察，要預先將試樣置於真空下，因此，有必要賦予試樣以耐真空性和為了獲得圖像而必要的導電性。
[0003]掃描電子顯微鏡的試樣的製備可如下地進行:通過預先對試樣進行真空乾燥而除去水分後，為了賦予導電性並提高二次電子的產生效率，利用蒸鍍、濺射等方法對導電材料(鉬、碳、金、鈀、鋨等)的試樣表面進行包覆。
[0004]對於像金屬、半導體等這樣具有導電性、有耐真空性的材料而言這樣的前處理不是必要，但對於沒有導電性的材料而言通過導電性材料的導電膜覆蓋是必要的。另外，耐真空性等差的材料，即為真空乾燥、電子顯微鏡觀察時在真空中由於電子束照射而變形的材料的情況下，通過導電性材料的導電膜覆蓋也是必要的。
[0005]由於生物/活體試樣含有大量的水分，需要預先真空乾燥的情況較多。因此，有表面的形狀顯著變形的情況，不容易以本身的狀態用電子顯微鏡觀察存活狀態。
[0006]凝膠狀物質、食品等溼潤試樣的含水狀態可以使用低真空SEM、冷凍SEM、環境控制型SEM(ESEM)等在常溫下觀察。根據這些方法，不限於溼潤試樣，可以在未處理的狀態下觀察試樣。但是，為了實施以高倍率的觀察，有必要抽成高真空，試樣的耐真空性或導電性也是必要的。因此，在進行生物/活體試樣的觀察時，不容易得到存活狀態下的高倍率的成像。
[0007]近年來，提出了使用離子液體的電子顯微鏡觀察方法。專利文獻I和非專利文獻2記載有使用離子液體SEM觀察了溼潤的試樣。關於細胞中的應用也在非專利文獻2有記載。另外，專利文獻2公開了將離子液體的技術用於透射電子顯微鏡觀察的方法。
[0008]現有技術文獻
[0009]專利文獻
[0010]專利文獻1:國際公開W02007 / 083756號小冊子
[0011]專利文獻2:日本特開2009-266741號公報
[0012]非專利文獻
[0013]非專利文獻1:Langmuir, 2011，27，9671-9675
[0014]非專利文獻2:Microsc.Res.Tech.2011,74,415-420

【發明內容】
[0015]發明要解決的問題
[0016]但是，即便使用環境321的觀察、利用上述各文獻的方法，也不能得到試樣的本身的狀態直接在高倍率下的電子顯微鏡圖像。而且對於生物/活體試樣而言，沒有達到在存活狀態下電子顯微鏡觀察存活的狀態。
[0017]即，對於生物試樣而言，沒有達到進行存活狀態下的生物試樣的活動情況的電子顯微鏡觀察。
[0018]另外，使用電子顯微鏡觀察後，回收的試樣不能繼續成長、繼續生存。即實現生還的電子顯微鏡觀察是不可能的。
[0019]由於電子顯微鏡的測定環境為真空狀態，因此試樣被置於極度的乾燥狀態。因而試樣發生變形、變質，不能觀察接近存活狀態的狀態。
[0020]此外，含水試樣置於真空下時瞬間凍結，試樣由於冰晶而發生變形、變質，不能觀察接近原本狀態的狀態。
[0021]對於生物試樣而言，由於置於真空下，隔絕來自外界的氧氣供給，陷入缺氧狀態。另外，由於置於乾燥狀態，變成像乾物一樣(墨魚變成墨魚乾一樣。)，不容易將生物試樣在存活的狀態下放入電子顯微鏡的鏡體內。
[0022]即使是能夠耐乾燥狀態的生物，由於生物內所含的水凍結，其在觀察活動狀態之前或在觀察中死亡。
[0023]雖然為了進行利用電子顯微鏡的觀察而照射電子束，但有必要在不引起由於該電子束的照射造成的電氣方面的重要原因、熱方面的重要原因等而變形、變性的情況下，得到生物試樣在存活的狀態下的電子顯微鏡圖像。
[0024]對於阻隔性能而言，雖然目前提出了使用有機物、無機物、有機/無機混合材料，使試樣通過旋塗、蒸鍍、塗布等方式在試樣表面製作膜從而賦予阻隔性能的技術，但目前還沒有在電子顯微鏡的試樣製作中應用這樣的阻隔性能的實例。
[0025]本發明鑑於上述問題而完成，課題在於提供即使在真空下也能夠在不使試樣變形的情況下抑制損害試樣本身的狀態，利用電子顯微鏡的觀察方法和用於其的在真空下的蒸發抑制用組合物、掃描電子顯微鏡及透射電子顯微鏡。
[0026]此外，本發明的課題還在於提供能夠使用電子顯微鏡在存活的狀態下觀察生物試樣、能夠觀察活動情況、利用電子顯微鏡的觀察方法和用於其的在真空下的蒸發抑制用組合物、掃描電子顯微鏡及透射電子顯微鏡。
[0027]為了解決上述問題，利用本發明的電子顯微鏡的試樣的觀察方法的特徵在於包括以下工序:將含有選自兩親性化合物、油脂類及離子液體中的至少1種的蒸發抑制用組合物適用於試樣的表面形成薄膜，用薄膜覆蓋該試樣的工序；以及，將收容在真空下的試樣室內的用該薄膜覆蓋的試樣的電子顯微鏡圖像顯示於顯示裝置的工序。
[0028]此外，使用本發明的電子顯微鏡的試樣的觀察方法的特徵還在於包括以下工序:在試樣的表面上應用含有選自兩親性化合物、油脂類及離子液體中的至少1種的蒸發抑制用組合物的工序；向應用了蒸發抑制用組合物的試樣照射電子束或等離子體體從而在試樣的表面上形成作為薄膜的聚合膜，用該聚合膜覆蓋試樣的工序；以及，將收容於真空下的試樣室的用該聚合膜覆蓋的試樣的電子顯微鏡圖像顯示於顯示裝置的工序。
[0029]利用該電子顯微鏡的試樣的觀察方法中的一個優選方案中，通過在電子顯微鏡的試樣室內照射試樣觀察用電子束從而使聚合反應進行，在試樣表面形成作為薄膜的聚合膜。利用該電子顯微鏡的試樣的觀察方法中的其它優選方案中，在利用電子顯微鏡的試樣觀察前，預先通過向試樣照射與電子顯微鏡的試樣觀察用電子束不同的電子束或等離子體從而使聚合反應進行，在試樣的表面形成作為薄膜的聚合膜。
[0030]利用該電子顯微鏡的試樣的觀察方法中的其它優選方案中，蒸發抑制用組合物含有兩親性化合物以及選自金屬化合物和糖中的至少I種。
[0031]利用該電子顯微鏡的試樣的觀察方法中的其它優選方案中，在不伴隨含水試樣的破壞的情況下，將含水試樣的溼潤的狀態的電子顯微鏡圖像顯示於上述顯示裝置。
[0032]利用該電子顯微鏡的試樣的觀察方法中的其它優選方案中，包括以下工序:在生存著的生物試樣的體表應用蒸發抑制用組合物形成薄膜，用薄膜覆蓋該試樣的工序；以及，將置於真空下的試樣室的用該薄膜覆蓋的生物試樣的存活狀態下的活動的電子顯微鏡圖像顯示於顯示裝置。這種情況下，優選方案中，通過上述薄膜，抑制與從生物試樣體內的蒸發相伴隨的溫度降低從而賦予生物試樣以活動能力，且保持生物試樣本身的形態。優選的其它方案中，通過上述薄膜，在真空下也能保持為使生物試樣能夠活動的體內溫度。
[0033]利用該電子顯微鏡的試樣的觀察方法中的其它優選方案中，使用掃描電子顯微鏡，在不引起試樣的電荷積累的情況下在顯示裝置上顯示試樣的電子顯微鏡圖像。
[0034]本發明的真空下的蒸發抑制用組合物中，在含有在真空下具有蒸發性的物質的試樣表面形成薄膜覆蓋該試樣，其是為了賦予上述具有蒸發性的物質以抑制在真空下其蒸發的阻隔能力而使用的在真空下的蒸發抑制用組合物，含有選自兩親性化合物、油脂類及離子液體中的至少I種。
[0035]該蒸發抑制用組合物的優選方案中，在生存著的生物試樣的體表上形成薄膜覆蓋該生物試樣，為了賦予生物試樣體內的具有蒸發性的物質以抑制在真空下其蒸發的阻隔能力而使用。
[0036]該蒸發抑制用組合物中的其它優選方案中，通過向應用了蒸發抑制用組合物的試樣照射電子束或等離子體，在試樣表面形成作為薄膜的聚合膜，用該聚合膜覆蓋試樣。
[0037]該蒸發抑制用組合物中的其它優選方案中，含有兩親性化合物以及選自金屬化合物和糖中的至少I種。
[0038]本發明的掃描電子顯微鏡是上述利用電子顯微鏡的試樣的觀察方法中所使用的掃描電子顯微鏡，其設置有能夠導入配置於鏡體內的試樣室的試樣的預排氣室、和對試樣室及預排氣室進行脫氣的排氣裝置。
[0039]該掃描電子顯微鏡的優選方案中，預排氣室設置有手套箱。
[0040]該掃描電子顯微鏡中的其它優選方案中，試樣室或預排氣室設置有等離子體照射裝置或電子束照射裝置。
[0041]該掃描電子顯微鏡中的其它優選方案中，試樣室或預排氣室設置有能夠作用於試樣的三維操縱裝置。
[0042]本發明的掃描電子顯微鏡為上述利用電子顯微鏡的試樣的觀察方法中所使用的掃描電子顯微鏡，其中，在試樣室內設置有能夠三維地調節二次電子的檢測器與試樣的相對位置的檢測位置調節機構。
[0043]本發明的掃描電子顯微鏡為上述利用電子顯微鏡的試樣的觀察方法中使用的掃描電子顯微鏡，其中，在試樣室內設置有能夠獲得試樣的顏色信息的高速彩色照相機。
[0044]本發明的掃描電子顯微鏡為上述利用電子顯微鏡的試樣的觀察方法中使用的掃描電子顯微鏡，其中，設置有能夠調節試樣室內的試樣臺的溫度的溫度調節裝置。
[0045]本發明的掃描電子顯微鏡為上述利用電子顯微鏡的試樣的觀察方法中使用的掃描電子顯微鏡，其中，在試樣室內設置有從電傳感器(表面電阻測定、活體電氣響應等)、光傳感器(活體用光刺雷射測定、分光傳感器、光量子數測定等〉、氣體傳感器(信息素等來源於活體的高分子測定、氧氣濃度 ? 氮氣濃度測定等〉、水傳感器(水蒸氣、表面水分量測定等)和溫度傳感器中選出的至少1種傳感器。
[0046]本發明的透射電子顯微鏡為上述利用電子顯微鏡的試樣的觀察方法中使用的透射電子顯微鏡，其中，設置有能夠導入配置於鏡體內的試樣室的試樣的預排氣室、和對試樣室及預排氣室進行脫氣的排氣裝置。
[0047]該掃描電子顯微鏡的優選方案中，預排氣室設置有手套箱。
[0048]本發明的透射電子顯微鏡為上述利用電子顯微鏡的試樣的觀察方法中使用的透射電子顯微鏡，配置試樣的柵網的兩面分別具有向上述蒸發抑制用組合物照射電子束或等離子體而形成的聚合膜。
[0049]發明的效果
[0050]根據本發明，能夠在不使試樣變形的情況下進行高倍率觀察且不會破壞試樣本身的狀態。
[0051]此外，能夠使用電子顯微鏡在存活的狀態下觀察活生物試樣，能夠觀察活動狀態的超細微構造。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0052]〔圖1]表示實施例1的321影像拍攝的狀態的照片。
[0053]〔圖2]表示實施例2的321影像拍攝的狀態的照片。
[0054]〔圖3]表示實施例3的321影像拍攝的狀態的照片。
[0055]〔圖4]表示實施例4的321影像拍攝的狀態的照片。
[0056]〔圖5]表示實施例5的I'剛影像拍攝的狀態的照片。
[0057]〔圖6]表示實施例6的321影像拍攝的狀態的照片。
[0058]〔圖7]表示實施例7的I'剛影像拍攝的狀態的照片。
[0059]〔圖8]表示實施例8的321影像拍攝的狀態的照片。
[0060]〔圖9]表示實施例9的I'剛影像拍攝的狀態的照片。
[0061]〔圖10]表示實施例10的321影像拍攝的狀態的照片。
[0062][圖11]實施例11的聚合膜的照片。
[0063]〔圖12]表示實施例11的試樣表面的聚合膜和321影像拍攝的狀態的照片。
[0064]〔圖13]表示實施例12的試樣表面的聚合膜和321影像拍攝的狀態的照片。
[0065]〔圖14]表示實施例13的試樣表面的聚合膜和321影像拍攝的狀態的照片。
[0066]〔圖15]表示實施例14的試樣表面的聚合膜和321影像拍攝的狀態的照片。
[0067]〔圖16]表示實施例15的試樣表面的聚合膜和321影像拍攝的狀態的照片。
[0068]〔圖17]表示實施例16的試樣表面的聚合膜和321影像拍攝的狀態的照片。[0069][圖18]表示實施例17的試樣表面的聚合膜和SEM影像拍攝的狀態的照片。
[0070][圖19]表示實施例18的試樣表面的聚合膜和SEM影像拍攝的狀態的照片。
[0071][圖20]表示實施例19的試樣表面的聚合膜和SEM影像拍攝的狀態的照片。
[0072][圖21]表示實施例20的試樣表面的聚合膜和SEM影像拍攝的狀態的照片。
[0073][圖22]表不本發明的掃描電子顯微鏡的一個實施方式的主要部分的不意圖。
[0074][圖23]表示本發明的掃描電子顯微鏡的其它實施方式的主要部分的示意圖。
[0075][圖24]表示本發明的掃描電子顯微鏡的其它實施方式的主要部分的示意圖。
[0076][圖25]表示本發明的掃描電子顯微鏡的其它實施方式的主要部分的示意圖。
[0077][圖26]表示本發明的掃描電子顯微鏡的其它實施方式的主要部分的示意圖。
[0078][圖27]表示本發明的掃描電子顯微鏡的其它實施方式的主要部分的示意圖。
[0079][圖28]表示本發明的掃描電子顯微鏡的其它實施方式的主要部分的示意圖。
[0080][圖29]表示本發明的掃描電子顯微鏡的其它實施方式的主要部分的示意圖。
[0081][圖30]表示本發明的透射電子顯微鏡的一實施方式的主要部分的示意圖。
[0082][圖31]表示圖30的主要部分的立體圖。
【具體實施方式】
[0083]以下詳細說明本發明。
[0084]需要說明的是，本發明中的「真空」是指例如KT1Pa以下，更是指10_2?10_4Pa，尤其是指10_4?IO-8Pa的範圍。
[0085]為了將生物試樣在存活的狀態下放入電子顯微鏡的鏡體內，在存活的狀態下進行電子顯微鏡觀察，而使用本發明的蒸發抑制用組合物在生物試樣表面形成屏蔽。
[0086]該屏蔽具有即使在真空下也能保持生物體內的水不乾燥的液體狀態的功能(水屏蔽性)、抑制活體內的氧等氣體物質的脫氣的功能(氣體屏蔽性)，在這些水/氣體阻隔性能的基礎上，為了得到電子顯微鏡圖像，還兼具抑制電子束照射造成的電氣方面以及熱方面的變形變質的功能(導電性/耐熱性)。
[0087]想要用現在的光學裝置、電子射線裝置觀察生物試樣或非生物試樣時，通常在高真空下進行，在該條件下與在大氣壓下的試樣的狀態大不相同。試樣中的水、氣體分子不能保持在大氣壓下的狀態，有時會對試樣帶來嚴重損害。要求原樣保持在本身的形態，更高精密地觀察。即，若為生物試樣，則能夠不損害存活的狀態的條件下實況地動態觀察，即使是非生物試樣，也能夠在沒有含水試樣的乾燥等損傷的條件下觀察。
[0088]本發明人等發現兩親性化合物、油脂類和離子液體在真空下保持水和空氣(氣體)(具有水/氣體屏蔽功能)。通過對生物試樣施加該溶液，可以形成均勻的保護膜，體現在大氣壓和真空下的水/氣體阻隔能力。
[0089]尤其是將該溶液用於利用電子顯微鏡的生物試樣的觀察時，生物試樣在電子顯微鏡的鏡體內不會幹燥，不會伴隨變形、變質，能夠保持存活的狀態，能夠得到活動情況的SEM圖像。即使調整為高倍率，也不會發生基於電子束的變形、變性，能夠觀察活動情況，可以進行不帶電的良好的SEM觀察。
[0090]不管是否在真空下，只要生物試樣能夠保持存活狀態，活體內的水就沒有凍結。即，由觀測結果可知伴隨減壓的溫度降低得到抑制，該結果通過兩親性化合物單獨、兩親性化合物與金屬化合物或糖的並用、油脂類單獨、或離子液體單獨的真空下的溫度測定的實驗得到確認。
[0091]由該結果明確得知，兩親性化合物、兩親性化合物與金屬化合物或糖的並用、油脂類、或離子液體或油脂類形成賦予了水/氣體阻隔性能的保護膜。本
【發明者】將該水/氣體阻隔性能稱為表面屏蔽效果（Surface Shielding Effect, SS效果）。
[0092]兩親性化合物、兩親性化合物和金屬化合物或糖的並用、油脂類、或離子液體賦予表面屏蔽效果，發現了通過在這些阻隔性能同時，賦予導電性，抑制基於電子射線的熱損傷，從而作為多功能的阻隔性能膜發揮作用。
[0093]根據本發明，能夠在存活的狀態下電子顯微鏡觀察生物/活體試樣。不僅限於提供用於生物/活體試樣的電子顯微鏡觀察的溶液，還提供關於廣泛賦予表面屏蔽效果（SS效果）的SS溶液的組成。
[0094]根據本發明，賦予表面屏蔽效果（SS效果）的SS溶液含有兩親性化合物，或含有主要成分的兩親性化合物和金屬化合物或糖，或含有油脂類，或含有離子液體，但可以將以下項目舉出的胺基酸及其衍生物、維生素類及其衍生物、無機鹽類、金屬氧化物、脂肪酸及其衍生物、導電性高分子、納米粘土等按任意的比例添加用於各種用途。
[0095]根據本發明的一個方案，SS溶液以兩親性化合物為主要成分（基材）。兩親性化合物例如可以使用表面活性劑。表面活性劑以陰離子性表面活性劑、陽離子性表面活性劑、非離子性表面活性劑、兩性離子表面活性劑、天然來源的表面活性劑等的方式按分子結構大體區分。在工業、食品、醫療品等廣泛領域中使用，但基本上無論使用任一表面活性劑都能體現一定的阻隔性能。
[0096]上述表面活性劑中，作為陰離子性表面活性劑分為例如羧酸型、硫酸酯型、磺酸型、磷酸酯型。其中，具體可以舉出例如十二烷基硫酸鈉、月桂酸鈉、α-磺基脂肪酸甲酯鈉、十二烷基苯磺酸鈉、十二烷基乙氧基化物硫酸鈉等，其中，優選使用十二烷基苯磺酸鈉。
[0097]上述表面活性劑中，作為陽離子性表面活性劑，分為例如季銨鹽型、烷胺型、雜環胺型。具體可以舉出例如硬脂醯三甲基氯化銨、二硬脂醯二甲基氯化銨、二癸基二甲基氯化銨、十六烷基三吡啶氯化物、十二烷基二甲基苯甲基銨氯化物等。
[0098]上述表面活性劑中，作為非離子表面活性劑可以舉出例如聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯硬化蓖麻油、聚氧乙烯單脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐單脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、聚丙三醇脂肪酸酯、烷基聚苷、N-甲基烷基葡糖醯胺等。其中，優選十二烷基醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、月桂醯基二乙醇醯胺，以及以TritonTMX(TritonTMX-100等）、pluronic? (pluronic(E)F-123> F-68 等）、吐溫（Tween20、40、60、65、80、85 等）、Brij(E)(Brij(K)35、58、98 等）、Span (Span20、40、60、80、83、85)的名稱市售的化合物。
[0099]上述表面活性劑中，作為兩性表面活性劑，有例如十二烷基二甲基氨基乙酸甜菜鹼、十二烷基氨基甲基二甲基磺基丙基甜菜鹼、3_(四癸基二甲基銨）丙烷-I-磺酸酯等，但優選使用3-[ (3-膽醯胺丙基）二甲基銨]-I-丙燒磺酸酯（(3- ( (3-Cholamidopropyl)dimethylammonio)-l-propanesulfonate), CHAPS)、3_[ (3-膽酸胺丙基)二 甲基銨]-2-輕基-I-丙燒橫酸酯（（3-〔 (3-Cholamidopropyl) dimethylammonio)-2-hydroxy-l-propanesulfonate), CHAPS0)等。
[0100]上述表面活性劑中，作為天然來源的表面活性劑，優選例如卵磷脂、皂甙，被稱為卵磷脂的化合物中，具體優選磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯肌醇、磷脂醯絲氨酸、磷脂酸、磷脂醯甘油等。另外，作為皂甙優選皂樹皂甙。
[0101]上述表面活性劑中，作為來源於微生物的兩親性化合物(生物表面活性劑)，優選使用鼠李糖脂(rhamnolipid)、槐糖脂(sophorolipid)、甘露糖赤蘚糖醇脂(mannosy lerythri to I lipid)等。
[0102]除上述表面活性劑中例示的以外，作為一般公知的物質使用的表面活性劑中，尤其作為用於化狀品類的表面活性劑，可以舉出例如杏仁油PEG-6、醯基(C12，14)天冬氨酸Na、醯基(C12、14)天冬氨酸TEA、ARACHIDETH-20、硬脂醯醇、烷基(Cll、13、15)硫酸鈉、烷基(Cll，13，15)硫酸 TEA、烷基(Cll，13，15)磷酸鉀、烷基(C12，13)硫酸 DEA、烷基(C12，13)硫酸鈉、烷基(C12，13)硫酸TEA、烷基(C12，14，16)硫酸銨、烷基(C12-14)氧羥基丙基精氨酸鹽酸鹽、烷基(C12-14) 二氨基乙基甘氨酸鹽酸鹽、烷基(C12-14)硫酸TEA、烷基(C12-15)硫酸TEA、烷基(C14-18)磺酸鈉、烷基(C16，18)三甲基氯化銨、烷基(C28)三甲基氯化銨、異硬脂醯胺DEA、異硬脂醯醇、異硬脂醯甘油酯、異硬脂醯十二烷基二甲基氯化銨、異硬脂酸PEG-2、異硬脂酸PEG-3、異硬脂酸PEG-4、異硬脂酸PEG-6、異硬脂酸PEG-8、異硬脂酸PEG-10、異硬脂酸PEG-12、異硬脂酸PEG-15甘油酯、異硬脂酸PEG-20、異硬脂酸PEG-20甘油酯、異硬脂酸 PEG-20氫化蓖麻油、異硬脂酸PEG-20山梨糖醇酐酯、異硬脂酸PEG-30、異硬脂酸PEG-30甘油酯、異硬脂酸PEG-40、異硬脂酸PEG-50氫化蓖麻油、異硬脂酸PEG-58氫化蓖麻油、異硬脂酸PEG-60甘油酯、異硬脂酸PG、異硬脂酸山梨糖醇酐酯、異硬脂酸山梨醇聚醚-3、異硬脂酸聚甘油酯_2、異硬脂酸聚甘油酯-3、異硬脂酸聚甘油酯-4、異硬脂酸聚甘油酯_5、異硬脂酸聚甘油酯_6、異硬脂酸聚甘油酯-10、異硬脂醇聚醚-2、異硬脂醇聚醚-10、異硬脂醇聚醚-15、異硬脂醇聚醚-22、異硬脂醯水解膠原、異硬脂醯水解膠原AMPD、異硬脂醯乳酸鈉、異鯨蠟醇聚醚-10、異鯨蠟醇聚醚-20、異棕櫚酸辛酯、異棕櫚酸聚甘油酯_2、異丁酸乙酸蔗糖、十一碳烯醯基水解膠原鉀、亞乙基二胺四羥基異丙基二油酸、環氧酯-1、環氧酯_2、環氧酯_3、環氧酯-4、環氧酯_5、芥酸甘油酯、辛烷酸PEG-4、壬基酚聚醚-14、辛基十二醇聚醚_2、辛基十二醇聚醚_5、辛基十二醇聚醚-10、辛基十二醇聚醚_30、羊烯基玻拍酸糊精TEA、羊基酌.聚醚_1、羊基酌 聚醚-2乙燒橫酸鈉、羊基酌 聚醚-10、辛基酚聚醚-25、辛基酚聚醚-70、橄欖油PEG-6、低聚琥珀酸PEG-3-PPG-20、油醯胺DEA、油胺氧化物、油醇甜菜鹼、油醇硫酸鈉、油醇硫酸TEA、油酸PEG-2、油酸PEG-10、油酸PEG-10甘油酯、油酸PEG-15甘油酯、油酸PEG-20甘油酯、油酸PEG-30甘油酯、油酸PEG-36、油酸PEG-40山梨醇酯、油酸PEG-75、油酸PEG-150、油酸PG、油酸蔗糖酯、油酸羥基{ 二(羥乙基)氨基}丙酯、油醯胺DEA、油酸聚甘油酯-2、油酸聚甘油酯_5、油酸聚甘油酯-10、油醯基水解膠原、油醯基肌氨酸、油醯基甲基牛磺酸鈉、油醇聚醚-2、油醇聚醚-3磷酸DEA、油醇聚醚-7磷酸鈉、油醇聚醚-8磷酸鈉、油醇聚醚-10、油醇聚醚-10磷酸、油醇聚醚-10磷酸DEA、油醇聚醚-20、油醇聚醚-20磷酸、油醇聚醚-30、油醇聚醚-50、烯烴(C14-16)磺酸鈉、陽離子化水解小麥蛋白-1、陽離子化水解小麥蛋白-3、陽離子化水解貝殼硬蛋白-2、陽離子化水解大豆蛋白-1、陽離子化水解大豆蛋白-2、陽離子化水解大豆蛋白-3、陽離子化右旋糖酐_2、癸醯胺DEA、牛脂脂肪酸甘油酯、杏仁油PEG-6、枸櫞酸二硬脂酯、枸櫞酸脂肪酸甘油酯、季銨鹽-14、季銨鹽-18、季銨鹽-18水輝石、季銨鹽18膨潤土、季銨鹽-22、季銨鹽-33、粟米油PEG-6、粟米油PEG-8、椰油醯胺、椰油醯胺DEA、椰油醯胺MEA、椰油醯胺丙基甜菜鹼、椰油胺氧化物、椰油醯兩性基乙酸鈉、椰油醯兩性基二乙酸二鈉、聚氧乙烯三癸基硫酸鈉、椰油醯兩性基二丙酸二鈉、椰油醯兩性基丙酸鈉、椰油醯丙氨酸TEA、椰油醯精氨酸乙基PCA、椰油醯羥乙磺酸鈉、椰油醯水解酪蛋白鉀、椰油醯水解角蛋白鉀、椰油醯水解酵母鉀、椰油醯水解酵母蛋白鉀、椰油醯水解小麥蛋白鉀、椰油醯水解膠原、椰油醯水解膠原鉀、椰油醯水解膠原鈉、椰油醯水解膠原TEA、椰油醯水解土豆蛋白鉀、椰油醯水解大豆蛋白鉀、椰油醯水解玉米蛋白鉀、椰油醯水解馬鈴薯蛋白鉀、椰油醯甘氨酸鉀、椰油醯甘氨酸TEA、椰油醯穀氨酸、椰油醯穀氨酸鉀、椰油醯穀氨酸鈉、椰油醯穀氨酸TEA、椰油醯肌氨酸、椰油醯肌氨酸鈉、椰油醯肌氨酸TEA、椰油醯牛磺酸鈉、椰油醯甲基丙氨酸、椰油醯甲基丙氨酸鈉、椰油醯甲基牛磺酸鉀、椰油醯甲基牛磺酸鎂、椰油醯甲基牛磺酸鈉、椰油基甘油酯硫酸鈉、椰油基二甲基銨羥丙基水解角蛋白、椰油基二甲基銨羥丙基水解膠原蛋白、椰油基二甲基銨羥丙基水解絲、椰油基甜菜鹼、琥珀酸PEG-50氫化蓖麻油、琥珀酸脂肪酸甘油酯、膽甾醇聚醚-10、膽留醇聚醚-15、異鯨蠟醇聚醚-3-乙酸酯、鯨蠟醇聚醚-3-乙酸酯、乙酸異丁酯、乙酸乙酯、乙酸甘油酯、乙酸脂肪酸甘油酯、乙酸硬脂酸蔗糖酯、十三烷醇聚醚-3-乙酸酯、十三烷醇聚醚-15-乙酸酯、乙酸丁酯、乙酸單硬脂酸甘油酯、羊毛脂醇聚醚-9乙酸酯、二乙醯酒石酸脂肪酸甘油酯、二烷基（C12-15) 二甲基氯化銨、二烷基（C12-18) 二甲基氯化銨、二異硬脂酸PEG-8、二異硬脂酸PG、二異硬脂酸聚甘油酯-2、二油酸PEG-4、二油酸PEG-10、二油酸PEG-32、二油酸PEG-75、二油酸PEG-120甲基葡萄糖、二油酸PEG-150、二油酸PG、二油酸甘醇酯、二油酸聚甘油酯_6、二牛脂烷基二甲基銨硫酸纖維素、二椰油基二甲基氯化銨、二乙酸硬脂酸甘油酯、二硬脂醯二甲基氯化銨、二硬脂酸PEG-2、二硬脂酸PEG-12、二硬脂酸PEG-20甲基葡萄糖、二硬脂酸PEG-120、二硬脂酸PEG-250、二硬脂酸PEG-三羥甲基丙烷、二硬脂酸PG、二硬脂酸PPG-20甲基葡萄糖、二硬脂酸甘醇、二硬脂酸甘油酯、二硬脂酸蔗糖、二硬脂酸山梨糖醇酐酯、二硬脂酸聚甘油酯_6、二硬脂酸聚甘油酯-10、二鯨蠟二甲基氯化銨、二鯨蠟硬脂醇磷酸雙酯MEA鹽、二羥乙基硬脂醯甜菜鹼、二棕櫚酸PEG-3、二羥乙基月桂胺氧化物、（二羥基甲基甲矽烷基丙氧基）羥丙基水解酪蛋白、（二羥基甲基甲矽烷基丙氧基）羥丙基水解膠原、（二羥基甲基甲矽烷基丙氧基）羥丙基水解絲、二氫膽甾醇聚醚-15、脂肪酸（C8-22)聚甘油酯-10、二甲基矽氧烷共聚醇、二甲基矽氧烷共聚醇乙基、二甲基矽氧烷共聚醇丁酯、二甲基硬脂胺、二月桂酸PEG-4、二月桂酸PEG-12、二月桂酸PEG-32、二月桂酸蔗糖酯、二月桂醇聚醚-4磷酸、二月桂醇聚醚-10磷酸、二月桂醯基穀氨酸鎂、水酸化卵磷脂、氫化椰油基甘油酯、氫化大豆脂肪酸甘油酯、氫化牛脂醯胺DEA、氫化牛脂穀氨酸二鈉、氫化牛脂穀氨酸TEA、氫化羊毛脂、氫化羊毛脂醇、氫化溶血卵磷脂、氫化卵磷脂、硬脂醯胺、硬脂醯胺DEA、硬脂醯胺MEA、硬脂醯胺乙基二乙胺、硬脂醯胺丙基二甲胺、硬脂胺氧化物、司拉氯銨、司拉氯銨水輝石、硬脂醯二甲基甜菜鹼鈉、硬脂醯三甲基銨糖精、硬脂醯三甲基溴化銨、硬脂醯甜菜鹼、硬脂醯硫酸鈉、硬脂酸PEG-2、硬脂酸PEG-6山梨醇酯、硬脂酸PEG-10、硬脂酸PEG-10甘油酯、硬脂酸PEG-14、硬脂酸PEG-20甘油酯、硬脂酸PEG-23、硬脂酸PEG-25、硬脂酸PEG-40、硬脂酸PEG-100、硬脂酸PEG-120甘油酯、硬脂酸PEG-150、硬脂酸PEG-200甘油酯、硬脂酸PG、硬脂酸TEA、硬脂酸甘醇酯、硬脂酸甘油酯、硬脂酸蔗糖酯、硬脂酸硬脂醇聚醚-4、硬脂酸硬脂醯二羥基異丁醯胺、硬脂酸山梨糖醇酐酯、硬脂酸聚氧乙烯鯨蠟醚、硬脂酸聚甘油酯_2、硬脂酸聚甘油酯-10、硬脂酸/蘋果酸甘油酯、月桂基二甲基銨羥基二丙基水解角蛋白、月桂基二甲基銨羥基二丙基水解膠原、月桂基二甲基銨羥基二丙基水解絲、月桂基三甲基氯化銨、硬脂醇聚醚-2磷酸、硬脂醇聚醚-3、硬脂醇聚醚-10、硬脂醇聚醚-16、硬脂醇聚醚-50、硬脂醇聚醚-80、硬脂醇聚醚-100、硬脂醯水解膠原鉀、硬脂醯水解膠原鈉、硬脂醯穀氨酸、硬脂醯穀氨酸二鈉、硬脂醯穀氨酸鉀、硬脂醯穀氨酸鈉、硬脂醯穀氨酸二辛基十二烷基、司吡氯銨、硬脂醯乳酸鈣、硬脂醯乳酸鈉、硬脂醯甲基牛磺酸鈉、磺基琥珀酸(C12-14)鏈烷醇聚醚二鈉、磺基琥珀酸PEG-2油醯胺二鈉、磺基琥珀酸PEG-4椰油醯異丙醇醯胺二鈉、磺基琥珀酸PEG-5月桂醯胺二鈉、磺基琥珀酸二辛基鈉、磺基琥珀酸谷留醇聚醚-14-二鈉、磺基琥珀酸十二烷基二鈉、磺基琥珀酸月桂醇聚醚二鈉、倍半異硬脂酸山梨糖醇酐酯、倍半油酸甘油酯、倍半油酸山梨糖醇酐酯、倍半油酸二甘油酯、倍半硬脂酸PEG-20甲基葡萄糖、倍半硬脂酸山梨糖醇酐酯、倍半硬脂酸甲基葡萄糖、鯨蠟二甲基矽氧烷共聚醇、鯨蠟氯化吡啶、鯨蠟硫酸鈉、鯨蠟磷酸DEA、鯨蠟磷酸鉀、鯨蠟硬脂醇、鯨蠟硬脂基葡糖苷.鯨蠟硬脂醇、鯨蠟硬脂基硫酸鈉、鯨蠟硬脂醇聚醚-10、鯨蠟硬脂醇聚醚-15、鯨蠟硬脂醇聚醚-22、鯨蠟硬脂醇聚醚-34、鯨蠟硬脂醇聚醚-55、鯨蠟硬脂醇聚醚-60、鯨蠟硬脂醇聚醚-60肉豆蘧基甘醇、鯨蠟硬脂醇聚醚-100、鯨蠟醇聚醚-8磷酸、鯨蠟醇聚醚-10、鯨蠟醇聚醚-10磷酸、鯨蠟醇聚醚-12、鯨蠟醇聚醚-24、鯨蠟醇聚醚-45、西曲氯銨、西曲銨糖精鹽、西曲溴銨、鯨蠟油醇聚醚-10、鯨蠟油醇聚醚-20、鯨蠟油醇聚醚-25、牛脂醯胺MEA、十異硬脂酸聚甘油酯-10、十油酸聚甘油酯-10、十硬脂酸聚甘油酯-10、癸基葡糖苷、四辛烷酸二甘油山梨糖醇酐、四油酸山梨醇聚醚-30、四油酸山梨醇聚醚-40、四油酸山梨醇聚醚-60、四硬脂酸山梨醇聚醚-60、十二烷基苯磺酸TEA、三PEG-8烷基(C12-15)磷酸、三(異硬脂酸PEG-3)三羥甲基丙烷、三異硬脂酸PEG-10甘油酯、三異硬脂酸PEG-15氫化蓖麻油、三異硬脂酸PEG-20氫化蓖麻油、三異硬脂酸PEG-30甘油酯、三異硬脂酸PEG-30氫化蓖麻油、三異硬脂酸PEG-50甘油酯、三異硬脂酸PEG-50氫化蓖麻油、三異硬脂酸PEG-160山梨糖醇酐、三異硬脂酸聚甘油酯_2、三油酸山梨糖醇酐酯、三油酸聚甘油酯-10、三硬脂酸PEG-3山梨醇酯、三硬脂酸PEG-140甘油酯、三硬脂酸PEG-160山梨糖醇酐酯、三硬脂酸蔗糖酯、三硬脂酸山梨糖醇酐酯、三硬脂酸聚甘油酯-10十三烷醇聚醚-三乙酸鈉、十三烷醇聚醚-六乙酸鈉、十三烷醇聚醚_9、十三烷醇聚醚-10、十三烷醇聚醚-11、十三烷醇聚醚-20、十三烷醇聚醚-21、三羥基硬脂精、三廿二烷酸蔗糖酯、三(十二烷胺)、三月桂醇聚醚-四磷酸、三月桂醇聚醚-四磷酸鈉、乳酸脂肪酸甘油酯、壬基壬基酚聚醚-10、壬基壬基酚聚醚-100、壬基酚聚醚-3、壬基酚聚醚-4硫酸鈉、壬基酚聚醚-6磷酸、壬基酚聚醚-6磷酸鈉、壬基酚聚醚-10、壬基酚聚醚-10磷酸、壬基酚聚醚-23、壬基酚聚醚-50、壬基酚聚醚-120、全氟烷基PEG磷酸、全氟烷基磷酸DEA、棕櫚仁脂肪酸醯胺DEA、棕櫚仁脂肪酸醯胺乙基羥乙基氨基丙酸鈉、棕櫚仁脂肪酸醯胺丙基甜菜鹼、棕櫚脂肪酸穀氨酸鈉、棕櫚醯胺MEA、棕櫚酸PEG-6、棕櫚酸PEG-18、棕櫚酸PEG-20、棕櫚酸蔗糖酯、棕櫚酸山梨糖醇酐酯、棕櫚醯天冬氨酸二 TEA、棕櫚醯甲基牛磺酸鈉、花生油PEG-6、羥基硬脂酸甘油酯、羥丙基三甲基銨水解酪蛋白、羥丙基三甲基銨水解角蛋白、羥丙基三甲基銨水解小麥蛋白、羥丙基三甲基銨水解膠原、羥丙基三甲基銨水解絲、羥基羊毛脂、丙酸PPG-2肉豆蘧酯、七硬脂酸聚甘油酯-10、十七烷基羥乙基羧酸甲酯甲基咪唑鎗鹽、山嵛醯胺丙基PG 二甲基氯化銨、山嵛胺氧化物、山嵛醇聚醚-10、山嵛醇聚醚-30、二十二烷酸甘油酯、二十二烷三甲基氯化銨、苯扎氯銨、五異硬脂酸聚甘油酯-10、五辛烷酸二甘油山梨糖醇酐、五油酸PEG-40山梨醇、五油酸聚甘油酯_6、五油酸聚甘油酯-10、五硬脂酸聚甘油酯-10、聚丙烯酸鉀、聚丙烯酸鈉、聚丙烯酸銨、聚氧乙烯烷基苯基醚磷酸TEA、聚氧乙烯醚磷酸鈉、聚氧乙烯辛基醚磷酸、聚氧乙烯鯨蠟硬脂醯二醚、聚氧乙烯植物留醇、聚氧乙烯丁基醚、聚氧乙烯椰油脂肪酸二乙醇醯胺、聚氧乙烯十二烷基醚磷酸TEA、聚氧丙烯羧基烷基(C14-18) 二葡糖苷、聚氧丙烯甘油酯醚磷酸、聚氧丙烯山梨醇、聚油酸蔗糖酯、聚甘油酯-2油醇、聚硬脂酸蔗糖酯、乙酸鯨蠟、乙酸羊毛脂醇酯、聚棕櫚脂肪酸蔗糖酯、聚月桂酸蔗糖酯、聚蓖麻醇酸聚甘油酯、聚亞油酸蔗糖泊洛沙姆181、泊洛沙姆(Poroxamer) 333、泊洛沙胺304、泊洛沙胺901、泊洛沙胺1104、泊洛沙胺1302、泊洛沙胺1508、麥芽糖醇羥基烷基(C12，14)、肉豆蘧醯胺DEA、肉豆蘧胺氧化物、肉豆蘧基苄基二甲基氯化銨、肉豆蘧基PG羥乙基癸醯胺、肉豆蘧基甜菜鹼、肉豆蘧基硫酸鈉、肉豆蘧酸PEG-8、肉豆蘧酸PEG-20、肉豆蘧酸甘油酯、肉豆蘧酸蔗糖酯、肉豆蘧酸聚甘油酯-10、肉豆蘧酸肉豆蘧醇聚醚_3、肉豆蘧醯水解膠原、肉豆蘧醯水解膠原鉀、肉豆蘧醯穀氨酸、肉豆蘧醯穀氨酸鉀、肉豆蘧醯穀氨酸鈉、肉豆蘧醯肌氨酸鈉、肉豆蘧醯甲基丙氨酸鈉、肉豆蘧醯甲基牛磺酸鈉、肉豆蘧醇聚醚_3、肉豆蘧醇聚醚-3硫酸鈉、單乙酸單硬脂酸甘油酯、椰油脂肪酸TEA、椰油脂肪酸甘油酯、椰油脂肪酸蔗糖酯、椰油脂肪酸山梨糖醇酐酯、椰油脂肪酸賴氨酸、月桂醯胺DEA、月桂醯胺MEA、月桂醯胺丙基甜菜鹼、月桂氨基二乙酸鈉、月桂氨基丙酸、月桂氨基丙酸鈉、月桂胺氧化物、月桂亞氨基二丙酸納、十二烷基DEA、十二烷基異喧琳鐵糖精、十二烷基異喧琳鐵漠化物、十二烷基匍糖昔、十二烷基二氨基乙基甘氨酸鈉、十二烷基二甲基銨羥丙基水解角蛋白、十二烷基二甲基銨羥丙基水解膠原、十二烷基二甲基銨羥丙基水解絲、十二烷基磺基乙酸鈉、十二烷基羥基乙酸酸胺硫酸納、十二烷基羥基橫基甜菜喊、十二烷基氣化吡啶鐵、十二烷基甜菜喊、十二燒基硫酸DEA、十二烷基硫酸鍾、十二烷基硫酸MEA、十二烷基硫酸續、十二烷基硫酸納、十二烷基硫酸TEA、十二烷基硫酸按、十二烷基憐酸、十二烷基憐酸二納、十二烷基憐酸納、月桂酸PEG-2、月桂酸PEG-4DEA、月桂酸PEG-6、月桂酸PEG-8、月桂酸PEG-8甘油酯、月桂酸PEG-9、月桂酸PEG-1O、月桂酸PEG-12甘油酯、月桂酸PEG-23甘油酯、月桂酸PEG-32、月桂酸PEG-75、月桂酸PEG-150、月桂酸PEG山梨醇、月桂酸PG、月桂酸TEA、月桂酸甘油酯、月桂酸蔗糖、月桂酸聚氧乙烯氫化蓖麻油、月桂酸聚甘油酯_6、月桂酸聚甘油酯-10、月桂酸麥芽糖醇、月桂基三甲基氯化銨、月桂基三甲基銨溴化物、月桂醇聚醚-2-硫酸銨、月桂醇聚醚-3乙酸、月桂醇聚醚-3硫酸TEA、月桂醇聚醚-3硫酸銨、月桂醇聚醚-3磷酸、月桂醇聚醚-4磷酸、月桂醇聚醚-4磷酸鈉、月桂醇聚醚-4.5乙酸鉀、月桂醇聚醚-5乙酸、月桂醇聚醚-5硫酸鈉、月桂醇聚醚-6乙酸、月桂醇聚醚-6乙酸鈉、月桂醇聚醚-7磷酸、月桂醇聚醚-9、月桂醇聚醚-10、月桂醇聚醚-10乙酸、月桂醇聚醚-10乙酸鉀、月桂醇聚醚-16乙酸鈉、月桂醇聚醚-17乙酸鈉、月桂醇聚醚-40、月桂醇聚醚硫酸TEA、月桂醯兩性基PG乙酸磷酸鈉、月桂醯兩性基乙酸鈉、月桂醯基天冬氨酸、月桂醯基水解膠原鉀、月桂醯基水解膠原鈉、月桂醯基水解絲鈉、月桂醯基穀氨酸、月桂醯基穀氨酸鉀、月桂醯基穀氨酸鈉、月桂醯基谷醯胺TEA、月桂醯基穀氨酸二辛基十二烷基、月桂醯基穀氨酸二辛基十二醇聚醚_2、月桂醯基穀氨酸二辛基十二烷基、月桂醯基穀氨酸二膽留酯、月桂醯基穀氨酸二硬脂醇聚醚-2、月桂醯基穀氨酸二硬脂醇聚醚_5、月桂醯基肌氨酸、月桂醯基肌氨酸鈉、月桂醯基肌氨酸TEA、月桂醯基蘇氨酸鉀、月桂醯基乳酸鈉、月桂醯基甲基丙氨酸、月桂醯基甲基丙氨酸鈉、月桂醯基甲基丙氨酸TEA、月桂醯基甲基牛磺酸鈉、羊毛脂醇聚醚-10、羊毛脂醇聚醚-25、羊毛脂醇聚醚-40、羊毛脂醇聚醚-75、羊毛脂脂肪酸PEG-4、羊毛脂脂肪酸PEG-12、羊毛脂脂肪酸醯胺DEA、羊毛脂脂肪酸異丙基、羊毛脂脂肪酸辛基十二烷基、羊毛脂脂肪酸甘油酯、膽甾醇羊毛脂脂肪酸酯、拉匹氯銨、蓖麻醇酸醯胺丙基甜菜鹼、蓖麻醇酸甘油酯、蓖麻醇酸蔗糖酯、蓖麻醇酸聚氧丙烯山梨醇、蓖麻醇酸聚甘油酯_6、亞油酸羊毛脂酯、亞油醯胺DEA、硫酸化蓖麻油、蘋果酸月桂醯胺、松脂水解膠原、松脂水解膠原AMPD等。
[0103]上述表面活性劑之外，還可以使用氟系的表面活性劑。具體可以舉出例如十七氟_1_辛燒磺酸銨、十五氟辛燒酸銨、十七氟辛燒磺酸、十七氟-I-辛燒磺酸鋰、十五氟辛燒酸、十五氟辛烷酸水合物、十七氟-I-辛烷磺酸鉀等。
[0104]上述表面活性劑之外，可以使用例如N-長鏈醯基穀氨酸鹽、N-長鏈醯基天冬氨酸鹽、N-長鏈醯基甘氨酸鹽、N-長鏈醯基丙氨酸鹽、N-長鏈醯基蘇氨酸鹽、N-長鏈醯基肌氨酸鹽等N-長鏈醯基中性胺基酸鹽等N-長鏈醯基胺基酸鹽，N-長鏈脂肪酸醯基-N-甲基牛磺酸鹽、烷基硫酸鹽及其氧化烯烴加成物、脂肪酸醯胺醚硫酸鹽、脂肪酸的金屬鹽、磺基琥珀酸系表面活性劑、烷基磷酸鹽及其氧化烯烴加成物、高級烷基硫酸酯鹽、烷基醚硫酸酯鹽、烷基羥基醚羧酸鹽、烷基醚羧酸等陰離子表面活性劑，丙三醇醚及其氧化烯烴加成物等醚型表面活性劑，丙三醇酯及其氧化烯烴加成物等酯型表面活性劑，山梨糖醇酐酯及其氧化烯烴加成物等醚酯型表面活性劑，脂肪酸單乙醇醯胺、脂肪酸二乙醇醯胺等脂肪酸烷醇醯胺、聚氧化烯脂肪酸酯、聚氧化烯多元醇脂肪酸酯、聚氧化烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧化烯氫化蓖麻油、單硬脂酸丙三醇、丙三醇酯、脂肪酸聚丙三醇酯、醯基胺基酸聚丙三醇酯、山梨糖醇酐酯、蔗糖脂肪酸酯等酯型表面活性劑，烷基葡糖苷類、硬化蓖麻油焦穀氨酸二酯及其氧化乙烯加成物、脂肪酸烷醇醯胺等含氮氣型的非離子性表面活性劑等非離子性表面活性劑，烷基氯化銨、二烷基氯化銨、氯化烷基三甲基銨（C16-C22)、二烷基二甲基銨甲基硫酸鹽等脂肪族胺鹽、其季銨鹽、苯二甲烴鹽等芳香族季銨鹽、脂肪酸醯基精氨酸酯、N-長鏈醯基精氨酸乙基吡咯烷酮羧酸鹽、醯胺胺類、硬脂醯胺丙基二甲胺穀氨酸鹽、硬脂醯胺丙基二甲胺乳酸鹽、硬脂醯胺丙基二甲胺吡咯烷酮羧酸鹽、山嵛醯胺丙基二甲胺穀氨酸鹽、山嵛醯胺丙基二甲胺乳酸鹽、山嵛醯胺丙基二甲胺吡咯烷酮羧酸鹽等陽離子兩親性化合物以及烷基甜菜鹼、烷基醯胺甜菜鹼、磺基甜菜鹼、咪唑鎗鹽甜菜鹼、氨基丙酸酯、羧基甜菜鹼等甜菜鹼型兩親性化合物、N-長鏈醯基精氨酸、N-(3-烷基（12，14)氧代-2-羥丙基）精氨酸鹽酸鹽、氨基羧酸型表面活性劑，咪唑鎗鹽型表面活性劑等兩性表面活性劑等。
[0105]根據本發明的一個方案，SS溶液含有兩親性化合物和金屬化合物。作為金屬化合物，只要是含有金屬離子的化合物則可以廣泛使用。
[0106]上述金屬化合物可以是由陽離子和陰離子構成的鹽（單鹽），也可以是由二種以上構成的鹽（復鹽）。
[0107]上述金屬化合物可以為氧化物、氫氧化物、齒化物、硫酸鹽、硝酸鹽、碳酸鹽、乙酸鹽等化合物。具體可以舉出例如氯化鈉、氯化鎂、氯化鈣、碳酸氫鈉、氯化鉀、氯化鍶、氯化鋰、氯化鉿、氯化鐵、氯化鋁、氯化鋅、氯化銅、氯化鈷、氯化硫酸鎂、碳酸鎂等。
[0108]上述金屬化合物可以是金屬氧化物。金屬醇鹽為MOR表不的化合物，由金屬（M)和醇鹽（R0_)(R為烴）構成。作為金屬（M)，具體可以舉出娃、鈦、招、硼、錯、硼、銀、鶴、磷、鍺、銦、鉿、鑰等，通過各種醇得到金屬醇鹽。這些金屬醇鹽可以直接使用，也可以使用將這些金屬醇鹽在酸或鹼存在下進行溶膠凝膠反應而得的反應物。作為金屬醇鹽，不使用單一成分，可以將二種類以上的物質混合。[0109]上述金屬化合物可以是金屬絡合物。
[0110]根據本發明的其它方案，SS溶液含有兩親性化合物和糖。對於糖.兩親性化合物的組合而言，賦予SS效果是本發明人等的新見解。作為糖，配合單糖類、二糖類、低聚糖、多糖類和其衍生物。作為單糖類，具體可以舉出葡萄糖、果糖等。作為二糖類，可以舉出蔗糖等，除此之外，作為多糖類，可以舉出肝素、硫酸軟骨素、支鏈澱粉、果膠、瓜爾豆膠、黃原膠、卡拉膠、丙烯甘醇、羧基甲基纖維素等，特別優選支鏈澱粉這樣的多糖類。除此之外，還可以使用焦糖、蜂蜜、黃蠟。
[0111]另外，根據本發明的其它方案，SS溶液含有油脂類。
[0112]作為油脂類，可以舉出例如矽油等。矽油作為用以保持生物試樣的組織或細胞的水環境的水分保持劑發揮作用，由此達成存活的生物試樣的動態觀察。即，即使在真空下組織、細胞的水不流失、可以作為具有阻隔性能的材料。
[0113]作為矽油，可以使用例如在25°C的粘度為I?IOOOOOmPa *s的矽油。例如可以使用和光純藥工業「636-04001 」、信越矽酮「KF-54 」、「KF-96 」等。
[0114]使用矽油的本發明的蒸發抑制用組合物(SS溶液)中，相對於組合物總量優選含有10重量％以上的矽油，作為除此以外的成分，可以配合以下例示的成分。
[0115]另外，根據本發明的其它方案，SS溶液含有離子液體。
[0116]作為離子液體，可以舉出例如咪唑鎗鹽類、吡啶鹽類、哌啶鎗鹽類、吡咯鎗鹽類、季銨鹽類、鱗鹽類、鋶鹽類、吡唑鎗鹽類等。
[0117]作為咪唑鎗鹽類，可以舉出例如1-烷基-3-烷基咪唑鎗、1，3-二甲基咪唑鎗、1-乙基-3-甲基咪唑鎗、1-丁基-3-甲基咪唑鎗、1-己基-3-甲基咪唑鎗、3-甲基-1-辛基咪唑鎗、1-十二烷基-3-甲基咪唑鎗、1-十二烷基-3-甲基咪唑鎗、1-甲基-3-四癸基咪唑鎗、1-十六烷基-3-咪唑鎗、1-十八烷基-3-甲基咪唑鎗、1-烯丙基-3-甲基咪唑鎗、1-稀丙基_3_甲基味卩坐鐵、1-稀丙基_3_乙基味卩坐鐵、1-稀丙基_3- 丁基味卩坐鐵、1，3- _.烯丙基咪唑鎗、1-苯甲基-3-甲基咪唑鎗、1-(2-羥乙基)-3-甲基咪唑鎗等。
[0118]作為1-烷基-2，3-二烷基咪唑鎗鹽，可以舉出例如1-乙基-2，3-二甲基咪唑鎗、
1,2,3,-三乙基咪唑鎗、1，2- 二甲基-3-丙基咪唑鎗、1- 丁基_2，3- 二甲基咪唑鎗、1-己基-2，3- 二甲基咪唑鎗、I，3- 二癸基2-甲基咪唑鎗等。
[0119]作為吡啶鹽類，可以舉出例如1-甲基吡啶、1-乙基吡啶、1-丁基吡啶、1-己基吡啶、1-乙基-3-甲基吡啶、1-甲基-4-甲基吡啶、1-丙基-4-甲基吡啶、1-丙基-3-甲基吡啶、1-丁基-2-甲基吡啶、1-丁基-3-甲基吡啶、1-乙基-3-羥基甲基、1-(3-羥丙基)吡唆等。
[0120]作為哌啶鎗鹽類，可以舉出例如1-甲基-1-丙基哌啶鎗、1-丁基-1-甲基哌啶鎗、1-(甲氧基乙基)-1-甲基哌啶鎗等。
[0121]作為吡咯鎗鹽類，可以舉出例如1，1_ 二甲基吡咯、1-乙基-1-甲基吡咯、1-甲基-1-丙基吡咯、1-丁基-1-甲基吡咯、1-(甲氧基乙基)-1-甲基吡咯等。
[0122]作為季銨鹽類，可以舉出例如四甲基銨、四丁基銨、丁基三甲基銨、乙基-二甲基_丙基銨、二丁基甲基銨、甲基二羊基銨、2-輕乙基銨等，除此之外，例如膽喊、N, N- 二乙基-N-甲基-N-(2-甲氧基乙基)銨、三甲胺氧化物等。
[0123]作為鱗鹽類，可以舉出例如四丁基鱗、三丁基十六烷基鱗、三乙基戊基鱗、三乙基(2-)-0，0』]硼酸鹽、癸酸鹽、雙(2,4, 4-三
農磺酸鹽、二乙基膦酸鹽、苯甲酸鹽、硫代琥
坐寸。
0116111.800.，2005，127，2398-2399 所不方:處所述胺基酸可以是單體，也可以是二肽、電以1: 1的比例形成離子對，但對於本發
0
七合物，或含有兩親性化合物和金屬化合物9成分的基礎上，可以以任意的比例添加以維生素類及其衍生物、脂肪酸及其衍生物、
卜，可以配合胺基酸及其衍生物。作為氨基變、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、蛋？氨酸、色氨酸、天冬氨酸、穀氨酸、賴氨酸、鍵合的物質、其高分子等。這些可以是單獨:些的衍生物。硫酸原黃素水合物、吡哆醛鹽酸鹽、5-磷酸吡哆醛一水合物、吡哆醇3，4-棕櫚酸鹽、異抗壞血酸鈉一水合物、二硫化硫胺水合物、二硫化硫胺硝酸鹽等。作為維生素相關物質，可以舉出氯化膽鹼、溴化膽鹼、枸櫞酸二氫膽鹼、重酒石酸膽鹼輔酶Q10、輔酶Qo、蛋氨酸甲基磺醯氯、肌醇類等。
[0132]作為高分子材料，可以舉出例如聚乙烯醇、特氟隆(註冊商標)、聚偏氟乙烯、四乙氧基娃燒、四甲氧基娃燒、異丙醇欽、丁醇錯等。
[0133]作為賦予上述SS效果的溶液的組成成分，可以將上述的離子液體添加到其它必需成分中而配合。
[0134]作為賦予上述SS效果的溶液的組成分，除了兩親性化合物、金屬化合物、糖等上述例示的成分以外，還可以配合下述成分。
[0135]配位化合物:冠醚、環糊精、間苯二酚環狀四聚體、杯芳烴、樹狀高分子等。
[0136]脂肪酸和其衍生物:亞油酸、油酸、棕櫚酸、亞麻酸等。
[0137]糖和脂肪酸的衍生物:玻璃酸、神經醯胺、兩親性化合物、膠原蛋白、胺基酸、精油、凡士林等。
[0138]凝膠化劑:聚(卩比唳-1，4-二亞氨基羰基-1,4-亞苯基亞甲基氯化物(Poly(pyridinium-1, 4-diyliminocarbonyl-l, 4-phenylene methylene chloride)等。
[0139]色素:除葉綠素、類胡蘿蔔素(番茄紅素)、藻膽素、黑色素等之外，有紅辣椒色素、孔雀石綠等。
[0140]導電性聚合物:聚乙炔、聚苯胺、聚噻吩等，以及全氟樹脂(naphion)等。
[0141]納米粘土:以Nanoclay NanomerwLaponite的名稱而商品化的物質和蒙脫石等。
[0142]在質譜分析用試劑中主要用於MALDI法的基底材料:3_氨基_4_羥基苯甲酸、芥子酸、七葉亭、4-羥基偶氮苯-2』 -羧酸、3-羥基-2-11吡啶羧酸、煙酸、2』，4』，6』 -三羥基苯乙酮、α-氰基-4-羥基桂皮酸、2，5-二羥基苯甲酸等。
[0143]本發明的蒸發抑制用組合物可以是固體狀態、液狀，但為了在真空下保持試樣組織的水環境，優選液狀且粘性高的狀態的組合物。另外，固體狀態的組合物在使用時可以變為液狀態使用。
[0144]對於本發明的蒸發抑制用組合物而言，例如，如將上述各成分溶於水、有機溶劑等，在試樣上直接覆蓋等，則可以在試樣的表面形成極薄的膜。
[0145]本發明的蒸發抑制用組合物中，兩親性化合物與金屬化合物及糖的配合比例沒有特別限定，但作為優選的情況，可列舉例如下述組成。
[0146](I)兩親性化合物(十二烷基苯磺酸鈉)/金屬化合物(亞乙基二胺鎳絡合物)=0.005 / 0.001 ?0.05 / 0.01
[0147](2)兩親性化合物(十二烷基硫酸鈉)/金屬化合物(亞乙基二胺鎳絡合物)=0.005 / 0.0001 ?0.05 / 0.001
[0148](3)兩親性化合物(十二烷基苯磺酸鈉)/金屬化合物(四胺鈷絡合物)=0.005 /0.001 ?0.05 / 0.01
[0149](4)兩親性化合物(吐溫20) /糖(海藻糖)=3 / I?20 / 2
[0150](5)兩親性化合物(吐溫20) /糖(支鏈澱粉)=3 / 0.2?20 / 2
[0151](6)兩親性化合物(吐溫20 /糖(菊糖)=3 / 0.1?20 / 7[0152]本發明的蒸發抑制用組合物可通過塗布、附著、包覆、被覆等應用於試樣表面。例如，對於塗布的情況而言，在塗布後，將多餘的液體用無塵布之類柔軟的布狀的紙、濾紙等吸除。用於TEM觀察的試樣通過介質的塗布、附著、包覆、被覆、包埋等進行處理。
[0153]由此在試樣表面形成的薄膜的膜厚可以控制在例如5nm?IOOOnm的範圍內。
[0154]需要說明的是，上述「生物試樣」包括原核生物和真核生物。
[0155]原核生物包括細菌、古菌。
[0156]細菌包括酸桿菌門、產水菌門、放線菌門、依魯司（Elusimicrobia)門、卡爾第(Caldiserica)門、衣原體門、綠菌門、綠屈撓菌門、產金菌門、熱脫硫桿菌門、熱微菌門、藍藻門、芽單胞菌門、互養菌門、螺旋菌門、網絡球桿菌門、異常球菌-棲熱菌門、軟壁菌門、脫鐵桿菌門、熱袍菌門、硝化螺旋菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、纖維桿菌門、梭桿菌門、浮黴菌門、變形菌門、疣微菌門、黏膠球形菌門。
[0157]古菌包括泉古菌門（界）、廣古菌門（界）、初古菌門（界）、納古菌門、奇古菌門。
[0158]真核生物包括原生生物界、植物界、菌界、動物界。
[0159]原生生物界包括藻類（綠藻、褐藻、紅藻、硅藻類、裸藻門、隱藻門、渦鞭毛藻門）、原生動物（絨毛蟲門、根足亞類（變形蟲、有孔蟲、太陽蟲、放射蟲）、孢子蟲門（頂復門、微孢子蟲、粘液孢子蟲）、鞭毛蟲（錐體蟲類、襟鞭毛蟲、超鞭毛蟲、多鞭毛蟲））、以及變形菌門、細胞性粘菌、盤根足蟲綱、二毛菌門。
[0160]植物界包括綠藻門、苔蘚植物門、車軸藻門、維管束植物界（古生松葉蘭門、石松門、木賊門、瓶爾小草門、蕨類植物門、裸子植物（松柏門）、蘇鐵門、銀杏門、麻黃屬門、被子植物門（紫玉蘭門（雙子葉植物綱（紫玉蘭綱）、單子葉植物綱（百合綱）））。
[0161]菌界包括壺菌門（壺菌）、接合菌門（毛黴、根黴）、子囊菌門（酵母、粉色麵包黴）、擔子菌門（蕈）、半知菌、地衣植物門。
[0162]動物界包括多孔動物門、扁盤動物門（絲盤蟲）、刺胞動物門（水母、海葵、珊瑚）、櫛水母動物門（櫛水母）、中生動物門（菱形蟲）、扁形動物門（渦蟲綱、渦蟲）、紐形動物門（紐蟲）、顎胃動物門、腹毛動物門、輪形動物門（輪蟲）、動吻動物門、棘頭動物門、內肛動物門、線蟲動物門（蛔蟲、秀麗隱杆線蟲）、線形蟲動物門（針金蟲）、外肛動物門、帚蟲動物門、腕足動物門、軟體動物門（貝、烏賊、章魚）、鰓曳動物門、星蟲動物門（星蟲）、縊蟲動物門、環節動物門（蚯蚓、沙蠶）、緩步動物門（熊蟲）、五口動物門、有爪動物門（鉤蟲）、節肢動動物門（螫肢亞門（海蜘蛛綱、鱟科（鱟）、肢口綱（蜘蛛、蠍子））、甲殼亞門（蝦、蟹）、多足亞門（百足綱（唇足綱、蜈蚣）、綜合綱（結合綱、小蜈蚣、少足綱（少腳綱、少足蟲）、馬陸綱（倍足綱、馬陸））、六足亞門（內顎綱、外顎綱（昆蟲綱）））、須腕動物門、棘皮動物門（海膽、海星、蛇尾、海參、海百合）、毛顎動物門（肥胖箭蟲）、半索動物門（擬寶珠蟲）、脊索動物門（尾索動物亞門（海鞘）、頭索動物亞門（文昌魚）、脊椎動物亞門（無頜上綱（盲鰻綱、頭甲魚綱（八目鰻））、有頜上綱（軟骨魚綱（鯊魚、鱘魚、黑線銀鮫）、肉鰭亞綱（腔棘魚、肺魚）、輻鰭魚綱、兩棲綱、爬行綱、哺乳綱、鳥綱）））。
[0163]根據本發明的利用電子顯微鏡觀察試樣的方法，可以如下地觀察試樣：使用以上說明的蒸發抑制用組合物，在試樣的表面應用蒸發抑制用組合物形成薄膜，用薄膜覆蓋該試樣，將收容在真空下的試樣室內的用該薄膜覆蓋的試樣的電子顯微鏡圖像顯示於顯示裝置。[0164]特別是，可以通過如下方法來觀察試樣:在將該蒸發抑制用組合物應用於試樣表面之後，向應用了蒸發抑制用組合物的試樣照射電子射線或等離子體，在試樣的表面形成作為薄膜的聚合膜(聚合物的膜)，從而用該聚合膜覆蓋試樣，將收容在真空下的試樣室內的用該聚合膜覆蓋的試樣的電子顯微鏡圖像顯示於顯示裝置。
[0165]可以通過在電子顯微鏡的試樣室內向試樣照射試樣觀察用電子射線，使聚合反應進行，從而在試樣的表面形成該聚合膜。
[0166]或者，可以通過在利用電子顯微鏡觀察試樣之前，預先向試樣照射區別於電子顯微鏡的試樣觀察用電子射線的電子射線或等離子體，使聚合反應進行，從而在試樣的表面形成該聚合膜。
[0167]照射條件可根據所使用的蒸發抑制用組合物等適當選擇，沒有特別限制，作為其一例，可通過不進行傳統的前處理、而是在試樣室內對用蒸發抑制用組合物覆蓋的生物試樣照射SEM的電子束(例如5.0kV左右)60分鐘，來實現高真空(例如10_4-10_7pa)下保持存活的生物試樣的SEM觀察、例如常規的利用FE-SEM的觀察。
[0168]另外，作為另一例，可通過不進行傳統的前處理、而是預先對用蒸發抑制用組合物覆蓋的生物試樣進行3分鐘等離子體照射，來實現高真空下保持存活的生物試樣的SEM觀察或TEM觀察。
[0169]通過這樣的電子射線、等離子體照射，試樣的表面被薄的聚合膜覆蓋。在形成於生物試樣表面的情況下，該聚合膜的厚度可以在例如5nm~1000nm的範圍。
[0170]利用等離子體照射而進行的聚合可使用例如傳統的離子濺射裝置等，在壓力10-3~105Pa、-20~+80°C、1~IOkV DC的條件下進行。或者，可以採用在以往的等離子體聚合中使用的那樣的諸如反應管之類的裝置、方法進行。
[0171]本發明中，為了利用電子顯微鏡進行觀察，對於用於SEM觀察的試樣，可通過進行蒸發抑制用組合物的塗布、附著、包覆、被覆等進行處理。例如，就塗布的情況而言，在塗布後，將多餘的液體用像無塵布那樣柔軟的布狀的紙、濾紙等吸除。對於用於TEM觀察的試樣，可通過進行蒸發抑制用組合物的塗布、附著、包覆、被覆、包埋等進行處理。
[0172]根據本發明，能夠在不使試樣變形的情況下進行觀察且不會破壞試樣本身的狀態。另外，能夠利用電子顯微鏡對存活的生物試樣在保持其存活的狀態下進行觀察，且可以觀察到活動情況。根據本發明，用於賦予SS效果的組合物不僅可以抑制電子顯微鏡的試樣的損失,還能夠抑制真空中試樣的損失。
[0173]本發明的蒸發抑制用組合物作為用於利用電子顯微鏡觀察試樣的良好的可視化劑發揮作用。即，對於作為生物/活體試樣的物質，無需實施傳統的脫水、化學固定、電子染色，可以在保持存活的狀態下將存活試樣放入電子顯微鏡的鏡體內，且在進行觀察時，也能夠抑制減壓下的乾燥、冰晶、溫度變化引起的損傷，並且能夠獲得阻隔試樣中的水/氣體的表面屏蔽效果(SS效果)。
[0174]另外，可防止電子射線照射引起的帶電等，可以在真空下通過電子射線照射而獲得良好的二次電子像。能夠在保持存活試樣存活的狀態下實現高倍率的電子顯微鏡觀察。
[0175]即，本發明的蒸發抑制用組合物由於作為用於利用電子顯微鏡觀察試樣的良好的可視化劑發揮作用，因此，適宜用於利用掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡進行的試樣觀察。[0176]本發明提供在利用電子顯微鏡觀察試樣的方法中，用於在不使試樣變形的情況下觀察試樣本身的形狀的方法和組合物(試劑材料)，特別是，對於生物/活體試樣，提供用於對保持存活的狀態進行觀察的方法和組合物(試劑材料)。
[0177]在生物試樣的表面，利用化學物質形成保護膜。該膜可防止生物試樣中所含的水、空氣(氣態物質)在真空下發生脫離。膜的形成可以在大氣壓條件下進行，也可以在真空下進行，所形成的膜在真空下將變得更為強固。膜的形成可以是一片膜，也可以是多層。
[0178]為了將外界與內界隔開，有利用無機物質(陶瓷)進行覆蓋等的方法。該方法中，表面硬，因而可能導致試樣活動受到阻礙，或者，對於存活試樣的情況而言，還可能會因呼吸受阻而死亡。與此相對，在本發明中，通過利用袋子等均一地包覆整個試樣的方法，可使這些問題得以解決。
[0179]本發明的蒸發抑制用組合物提供在大氣壓下及真空下對於生物體內的水、氣體等具有蒸發性的物質的阻隔能力。利用該能力，可以防止在真空下生物內物質的蒸發。並且，不會引起伴隨蒸發的溫度降低，可賦予活動能力，且可保持生物試樣本身的形態，在減壓下也能夠保持用以使生物能夠活動的體內溫度。
[0180]利用本發明的蒸發抑制用組合物覆蓋試樣的情況下，如果是生物試樣，則能夠實現保持存活的包覆，在包覆之後生物也能夠生存。通過利用由本發明的蒸發抑制用組合物形成的薄膜覆蓋存活生物的體表，可以用掃描電子顯微鏡觀察生物試樣的存活狀態，並且能夠觀察到生物微細表面等的結構。
[0181]另外，根據本發明的蒸發抑制用組合物，通過覆蓋存活生物的體表，能夠利用掃描電子顯微鏡直接觀察生物試樣的存活狀態，而不會發生帶電(電荷積累)。
[0182]另外，在利用電子顯微鏡進行觀察時，無需進行迄今為止必不可少的、在進行生物/活體試樣的試樣製作時必要的化學固定一導電染色一脫水一乾燥一包覆、或化學固定—脫水一包埋一超薄切片一電子染色一包覆等工序，即可實現高倍率的觀察。
[0183]不僅限定於生物試樣，本發明的蒸發抑制用組合物可以在不造成試樣破壞的情況下對含水試樣的溼潤狀態直接進行真空下的電子顯微鏡觀察。
[0184]本發明的蒸發抑制用組合物在利用電子顯微鏡的測定中也可以抑制試樣的變形、變質，因而不會在測定前後對試樣造成明顯的損傷。除了在真空下具有水/氣體阻隔性能、可抑制試樣內溫度的顯著降低，並且即使在真空下照射電子射線也顯示出水/氣體阻隔性能、對試樣內溫度的顯著降低的抑制以外，還能夠實現對電子射線照射引起的帶電的防止、對熱損傷的抑制。試樣為生物試樣的情況下，能夠在保持存活的情況下對存活狀態的試樣進行觀察，且即使從鏡體中取出也不會發現試樣有任何變化。
[0185]本發明中，利用掃描電子顯微鏡及透射電子顯微鏡進行的試樣觀察可以通過迄今為止已知構成的裝置進行。
[0186]掃描電子顯微鏡通常由鏡筒部(鏡體)和操作部構成。在鏡筒部，利用電子槍產生電子射線、利用電子透鏡匯聚電子射線、利用電子探測器進行整形、利用偏轉線圈使電子探測器在試樣表面的觀察區域進行掃描等。載置試樣的試樣室具備:試樣臺、和檢測由試樣放出的信號的檢測器。由於必須要將該鏡筒部保持於潔淨的真空中，因此可設置與目的相對應的真空排氣機構。
[0187]操作部進行對電子射線的產生、電子透鏡的透鏡作用、非點補正、電子探測器在試樣面上的掃描範圍（倍率）及掃描速度等的控制，並將檢測到的信號以映像形式顯示在CRT上。
[0188]另外，對於靜止的掃描電子顯微鏡圖像，通常利用噪音低的低功率掃描圖像進行觀察、拍攝，但在存活的生物試樣的掃描利用電子顯微鏡的觀察中，以TV模式下的觀察、SP動畫的映像為主。因此，也可考慮在掃描電子顯微鏡中引入噪音低（S / N小）的TV模式圖像顯示/錄像電路，以高畫質的TV模式進行掃描電子顯微鏡圖像的顯示和錄像。
[0189]本發明中，利用掃描電子顯微鏡及透射電子顯微鏡的試樣觀察也可以利用迄今為止已知構成的裝置進行，但如下所述的新型構成的裝置更適用於本發明的方法。
[0190]圖22是示意性地示出了本發明的掃描電子顯微鏡的一實施方式的主要部分的圖。該掃描電子顯微鏡（SEM) I具備能夠將配置於鏡體內的試樣室的試樣4導入的預排氣室2、和對試樣室及預排氣室2進行脫氣的排氣裝置7。
[0191]利用SEMl進行試樣觀察時，將試樣設置於試樣室中進行觀察，但為了保持高真空，可以在試樣室與外部之間設置預排氣室2作為試樣交換室，利用試樣交換棒3進行試樣4的導入導出。
[0192]該預排氣室2與真空泵等排氣裝置7連通，它們之間的排氣通路中設置有針型閥等調節閥6，在相對於調節閥6的排氣上遊側設置有皮拉尼真空計等真空計5。這樣，形成為安裝了能夠利用排氣裝置7對試樣室及預排氣室2進行緩慢脫氣的機構，從而能夠保持恆定的真空度，並能夠在各個真空度下完成其它操作的構成。
[0193]利用SEMl觀察活體試樣的情況下，必須將活體試樣從大氣壓中導入真空中。但不僅是活體試樣、連微細結構體也會因排氣時的壓力變化、風壓而受到影響。因此，需要設置可以使從大氣壓開始進行的真空排氣更為穩定的機構。
[0194]基於此，該實施方式中，為了能夠對迴轉泵區域的達到極限真空度為止的真空排氣速度進行控制，在SEMl中設置了由真空計5和調節閥6組合而成的機構。對於這樣的階段性地進行排氣的裝置（能夠在不同真空度下使用）而言，優選使預排氣室2和試樣室較大，並設置高功能的真空泵、以使其能夠對大房間有效地抽真空，且以能夠瞬時進行真空度控制的方式設置。
[0195]圖23是示意性地示出了本發明的掃描電子顯微鏡的其它實施方式的主要部分的圖。（a)為SEM主體和電源的主視圖、(b)是其側視圖、（C)為卸下手套箱的狀態的側視圖、(d)為安裝有手套箱的狀態的側視圖、（e)為示出了手套箱中安裝有不活潑氣體儲氣瓶的狀態的立體圖。
[0196]該實施方式中，預排氣室2中具備手套箱12。通過在預排氣室2中設置手套箱，可以進行真空下的操作。
[0197]如（c)及（d)所示，在安裝有電源9的SEMl的鏡體8的下部的試樣室10中橫靠地設置有手套箱12，並使手套箱12內的罩體14內收容有試樣架11。
[0198]手套箱12具有安裝有橡膠手套等的操作用入口 15、和能夠看見內部的窗部14，可以在真空下進行處理試樣的操作。並且，其可以利用試樣架11將覆蓋試樣的薄膜從作為試樣導入部的手套箱12內導入到SEMl內的試樣室中，而不會暴露於大氣壓下。例如，可以在與SEMl連結的手套箱12內進行等離子體聚合膜的成膜。
[0199]另外，手套箱12不僅可以在真空下進行樣品的處理，而且還可以如（e)所示地設置能夠向手套箱12內導入氬氣、氮氣等不活潑氣體的不活潑氣體儲氣瓶16，利用不活潑氣體將手套箱12內置換之後加以使用。這適用於等離子體處理等。例如，在預排氣室2內利用聚合反應在試樣表面形成聚合膜時，可以填充氮氣、氬氣等特定的氣體來控制反應。
[0200]圖24是示意性地示出了本發明的掃描電子顯微鏡的另一實施方式的主要部分的示意圖。該實施方式中，在預排氣室2具備等離子體照射裝置或電子射線照射裝置18。
[0201]需要說明的是，該等離子體照射裝置或電子射線照射裝置18也可以設置於SEMl的試樣室。
[0202]另外，預排氣室2具備透明的鐘罩17。可以隔著該透明的鐘罩17照射來自等離子體照射裝置或電子束照射裝置18的等離子體及電子束。
[0203]例如，作為等離子體照射裝置，除了可以使用在以往的離子蝕刻中被使用的那樣的固定了照射部分的類型的裝置以外，還可以附加能夠手動地把持及收納照射部分的那樣的手持型照射裝置並分別地加以使用。此外，如果使得等離子體的照射直徑可以在數rim?數十cm的範圍內調整、從而根據試樣4的尺寸改變照射面積/強度，則可以得到不僅能夠控制電流量、而且能夠變更照射直徑本身的尺寸的裝置。
[0204]為了能夠利用電子射線、等離子體的照射使試樣整面發生均勻的聚合，也可以使配置了試樣4的試樣臺具有進行三維旋轉的功能。或者，為了使聚合能夠達到試樣背面，可以採取使電子射線或等離子體能夠通過試樣臺的設計。另外，可以設置拍攝預排氣室2內的操作的CCD照相機，從而對預排氣狀態的試樣4的狀態及等離子體照射的狀態進行監視。
[0205]正如上述所舉的例子等那樣，通過在預排氣室2中設置能夠以各種條件照射等離子體、電子射線的裝置，能夠自動或手動地控制等離子體照射裝置或電子束照射裝置18的照射時間及電流量等。
[0206]圖25是示意性地示出了本發明的掃描電子顯微鏡的另一實施方式的主要部分的圖。該實施方式中，在試樣室內部19具備能夠作用於試樣4的三維操縱裝置21。
[0207]需要說明的是，該三維操縱裝置21也可以設置於預排氣室2。
[0208]該三維操縱裝置21用於對成為對象的保持存活的生物等試樣的動作加以控制(包括觀看拍攝時的模糊減輕)。
[0209]該三維操縱裝置21還可以用於微細活體解剖、刺激、活體信號導出等。
[0210]例如，作為用於移動試樣、進行試樣的微細解剖、或移動用以施加物理或化學刺激的部件的移動機構，可以在試樣室內部19設置三維操縱裝置21。為了利用SEMl對試劑與活體試樣的接觸、浸透等反應進行動態觀察，需要能夠一邊射出電子射線從而觀察二次電子像等一邊開始反應實驗的裝置。因此，可以將作為移動機構的三維操縱裝置21用作一邊利用SEMl進行觀察一邊進行試樣4的微細解剖、物理或化學刺激等的裝置。圖26是示意性地示出了本發明的掃描電子顯微鏡的另一實施方式的主要部分的圖。該實施方式中，在試樣室內部19具備能夠對二次電子檢測器22和試樣4的相對位置進行三維調節的檢測位置調節機構。
[0211]從而，可使二次電子檢測器22能夠在SEMl內移動，根據需要而接近試樣4或以特別的角度與試樣4接觸。由此，能夠實現檢測二次電子的增強。
[0212]該檢測位置調節機構適宜設置高速拍攝裝置。S卩，由於是能夠提高掃描速度、可實現慢速播放的TV模式，因此能夠進行對檢測器的區域控制、以及對到達檢測器的工作距離的控制等，可以無浪費地匯聚二次電子。取前後的差分來將動作特徵化的軟體等也可以作為插補技術加以應用。
[0213]圖27是示意性地示出了本發明的掃描電子顯微鏡的另一實施方式的主要部分的圖。該實施方式中，在試樣室內部19具備能夠獲取試樣4的顏色信息的高速彩色照相機23。
[0214]根據本發明，能夠對保持存活的試樣4進行觀察，因此可以原封不動地保持試樣4的顏色。這樣，由於在試樣室內部19設置高速彩色照相機23，對於顏色等信息也能夠進行記錄，因此可以利用所記錄的實際顏色，作為模擬色應用於SEM觀察到的圖像。
[0215]圖28是示意性地示出了本發明的掃描電子顯微鏡的另一實施方式的主要部分的圖。該實施方式中，具備能夠對試樣室內部19的試樣臺20的溫度加以調節的溫度調節裝置24。
[0216]例如，可以從鏡體外設置能夠將試樣臺20的溫度控制在_20°C?100°C之間的不受磁場影響的操作臺。具體而言，作為例如將試樣臺20的溫度保持恆定（例如37°C)的裝置，可設置拍爾帖（Peltier)兀件等。
[0217]利用該溫度調節裝置24，可以對配置於試樣臺20的生物試樣等試樣4的溫度進行調節。
[0218]圖29是示意性地示出了本發明的掃描電子顯微鏡的另一實施方式的主要部分的圖。該實施方式中，在試樣室內部19具備各種傳感器25。
[0219]作為傳感器25，可列舉例如電傳感器、光傳感器、氣體傳感器、水傳感器、溫度傳感器等。另外，可以設置能夠利用微弱光進行測定的高靈敏度傳感器（帶有暗視場照相機）。
[0220]利用該傳感器25，可以獲得配置於試樣臺20的生物試樣等試樣4的信息，進行對物理或化學刺激等的響應、對聚合反應等的監視及測定等。
[0221]圖30是示意性地示出了本發明的透射電子顯微鏡的一實施方式的主要部分的圖、圖31是示意性地示出了圖30的主要部分的立體圖。該實施方式中，在配置試樣的柵網33的兩面上各自具有對上述蒸發抑制用組合物照射電子射線或等離子體而形成的聚合膜32。
[0222]如圖30所示，三明治狀的TEM用試樣架在C型環30、O型環31的下方配置有由上下的聚合膜32夾持的柵網33。也可以利用例如真空脂和O型環對聚合膜32進行密封。
[0223]如圖31所示，對於試樣的細胞34，在柵網33上疊合利用等離子體形成的聚合膜32，並在該聚合膜32上載置細胞34，然後塗布上述蒸發抑制用組合物，進行等離子體照射而形成聚合膜32。例如，透射電子顯微鏡與圖22的SEM的情況同樣，具備能夠導入配置於鏡體內的試樣室的試樣的預排氣室、和對試樣室及預排氣室進行脫氣的排氣裝置。另外，與圖24的SEM的情況同樣，可以在試樣室或預排氣室中具備等離子體照射裝置或電子射線照射裝置。這樣，在為了實現在TEM的預排氣室內進行等離子體或電子射線聚合而加以改良時，可以塗布上述蒸發抑制用組合物並進行等離子體照射而形成聚合膜32。通過在數nm?數十cm的範圍內調節等離子體的照射直徑，可以根據試樣的尺寸而改變照射面積。另外，通過利用這樣的方法將標的細胞及培養液密封於試樣架內，在高真空中也能夠在保持存活的情況下進行動態解析。還能夠對結合了金膠體的試樣進行觀察。此外，通過對STEM(掃描透射電子顯微鏡，Scanning transmission electron Microscope)加以改良，使照射至加入到TEM內的存活試樣的電子射線量減少，可以實現長時間的觀察。
[0224]實施例
[0225]以下，結合實施例對本發明進行更為詳細的說明，但本發明完全不受這些實施例的限定。
[0226]在下述實施例中，典型的SEM觀察利用場致發射型掃描電子顯微鏡(FESEM、S-4800 (日立))、在5.0kV的加速電壓下進行。為了記錄生物試樣的動態活動，SEM的圖像數據直接轉送至錄像/錄音機(H1-band digital formatted video recorder,Pioneer, DVR-DT95)。
[0227]典型的TEM觀察在120kV的加速電壓下利用JEM-1220 (JEOL)進行。
[0228]典型的等離子體聚合利用拆卸掉金屬靶後的離子濺射裝置(JFC-1100，JE0L)進行，在約1.0Pa的真空水平下、於室溫以1.0kV DC(8.0mA)進行3分鐘等離子體照射。
[0229]
[0230]將作為兩親性化合物的十二烷基苯磺酸鈉製成0.1 %水溶液，並將作為金屬化合物的亞乙基二胺鎳絡合物製成0.01wt%，使用它們製備了蒸發抑制用組合物。
[0231]將存活的金花蟲在蒸發抑制用組合物中浸潰I分鐘後取出，擦去多餘部分，並利用薄膜覆蓋其體表。
[0232]然後，放入SEM試樣室進行了拍攝(圖1)。在電子束照射開始後仍然可以觀察到金花蟲活動的情況。
[0233]並且，在進行SEM觀察後，將金花蟲從試樣室取出後其仍然生存。
[0234]
[0235]將作為兩親性化合物的十二烷基苯磺酸鈉製成0.1 %水溶液，並將作為金屬化合物的亞乙基二胺鎳絡合物製成0.01wt%，使用它們製備了蒸發抑制用組合物。
[0236]將存活的跳蟲在蒸發抑制用組合物中浸潰I分鐘後取出，擦去多餘部分，並利用薄膜覆蓋其體表。
[0237]然後，放入SEM試樣室進行了拍攝(圖2)。在電子束照射開始後仍然可以觀察到跳蟲活動的情況。
[0238]並且，在進行SEM觀察後，將跳蟲從試樣室取出後其仍然生存。
[0239]
[0240]將作為兩親性化合物的吐溫20製成10%水溶液，並將作為糖的海藻糖製成1%(w / V)、將普魯蘭多糖製成0.1% (w / V)，使用它們製備了蒸發抑制用組合物。
[0241]將存活的羽搖蚊幼蟲在蒸發抑制用組合物中浸潰I分鐘後取出，擦去多餘部分，並利用薄膜覆蓋其體表。
[0242]然後，放入SEM試樣室進行了拍攝(圖3)。在電子束照射開始後仍然可以觀察到羽搖蚊的幼蟲活動的情況。
[0243]並且，在進行SEM觀察後，將羽搖蚊幼蟲從試樣室取出後其仍然生存，且變態為成蟲。
[0244]
[0245]將作為兩親性化合物的吐溫20製成10%水溶液，並將作為糖的海藻糖製成1%(w / V)、將普魯蘭多糖製成0.1% (w / V)，使用它們製備了蒸發抑制用組合物。[0246]將存活的孑孓（白紋伊蚊）幼蟲在蒸發抑制用組合物中浸潰I分鐘後取出，擦去多餘部分，並利用薄膜覆蓋其體表。
[0247]然後，放入SEM試樣室進行了拍攝（圖4)。在電子束照射開始後仍然可以觀察到孑孓幼蟲活動的情況。
[0248]並且，在進行SEM觀察後，將孑孓幼蟲從試樣室取出後其仍然生存，且變態為成蟲。
[0249]
[0250]將作為兩親性化合物的吐溫20製成10%水溶液，並將作為糖的海藻糖製成1%(w / V)、將普魯蘭多糖製成0.1% (w / V)，使用它們製備了蒸發抑制用組合物。
[0251]將存活的孑孓幼蟲在蒸發抑制用組合物中浸潰I分鐘後取出，擦去多餘部分，並利用薄膜覆蓋其體表。
[0252]然後，放入TEM試樣室進行了拍攝（圖5)。在電子束照射開始後仍然可以觀察到孑孓幼蟲活動的情況。
[0253]
[0254]將作為兩親性化合物的十二烷基苯磺酸鈉製成O. I %水溶液，並將作為金屬化合物的亞乙基二胺鎳絡合物製成O. 01wt%，使用它們製備了蒸發抑制用組合物。
[0255]用明膠膠囊包入螞蟻，並用抗靜電用碳帶固定，用明膠將孔封閉。這樣，將螞蟻放入明膠膠囊後保持內部的大氣，同時僅使觀察部位的腳伸出至膠囊外，在該腳部分塗布蒸發抑制用組合物，進行了存活狀態下的SEM觀察。拍攝到了腳部分的活動（圖6)。
[0256]另外，在進行SEM觀察後，將螞蟻從試樣室取出後其仍然生存。
[0257]
[0258]將作為兩親性化合物的十二烷基苯磺酸鈉製成O. I %水溶液，並將作為金屬化合物的亞乙基二胺鎳絡合物製成O. 01wt%，使用它們製備了蒸發抑制用組合物。
[0259]將存活的青鏘的鱗在蒸發抑制用組合物中浸潰I分鐘，然後，放入TEM試樣室進行了拍攝（圖7)。在電子束照射開始後仍然可以觀察到內部的微細結構發生變化的情況。
[0260]
[0261]將作為兩親性化合物的吐溫20製成10%水溶液，並將作為糖的海藻糖製成1%(w / V)、將普魯蘭多糖製成0.1% (w / V)，使用它們製備了蒸發抑制用組合物。
[0262]將花鏘連同飼養水一起封入微管，僅使尾鰭伸出至管外，用牙蠟將孔封閉。這樣，將花鏘放入微管後保持內部的大氣及水系，同時僅使觀察部位的尾鰭伸出至管外，在該腳部分塗布蒸發抑制用組合物，進行了存活狀態下的SEM觀察。在電子束照射開始後仍然可以拍攝到尾鰭的活動（圖8)。
[0263]另外，在進行SEM觀察後，將花鏘從試樣室取出後其仍然生存。
[0264]
[0265]將作為兩親性化合物的吐溫20製成10%水溶液，並將作為糖的海藻糖製成1%(w / V)、將普魯蘭多糖製成0.1% (w / V)，使用它們製備了蒸發抑制用組合物。
[0266]將水螅外胚層性上皮細胞在蒸發抑制用組合物中浸潰I分鐘，然後，放入TEM試樣室，在電子束照射開始後仍然可以在存活狀態下拍攝視頻（圖9)。圖中，左圖為光學顯微鏡圖像、右圖為TEM的視頻影像。未進行傳統的前處理而是進行上述處理之後，直接在高真空下進行了 3分鐘電子射線照射(120kV)。
[0267]
[0268]作為蒸發抑制用組合物，使用了油脂類。
[0269]將存活的渦蟲在蒸發抑制用組合物(矽油)中浸潰I分鐘後取出，擦去多餘部分，並利用薄膜覆蓋其體表。
[0270]然後，放入SEM試樣室進行了拍攝(圖10)。在電子束照射開始後仍然可以觀察到渦蟲活動的情況。
[0271]並且，在進行SEM觀察後，將渦蟲從試樣室取出後其仍然生存。
[0272]〈實施例11>
[0273]作為兩親性化合物，使用了吐溫20。為了製作自立的薄膜，將50% (V / v)的吐溫20溶解於100%乙醇中，並使用旋塗機(3000rpm、5s) (SC8001、Aiden)在玻璃上攤開，進行了等離子體聚合。在乙醇中使聚合後的薄膜與玻璃板分離。
[0274]圖11 (a)為通過進行等離子體照射而製成的自立性的聚合膜(吐溫20)的光學顯微鏡圖像、(b)為吐溫20的化學式、(c)為膜表面的AFM圖像、⑷為膜剖面的TEM圖像。
(d)中，箭頭之間為吐溫20的聚合膜。在照射側的表面(箭頭之間的部分)形成了薄層。
[0275]接著，將作為兩親性化合物的吐溫20製成1%水溶液，並使用其製備了蒸發抑制用組合物。
[0276]將存活的孑孓幼蟲在蒸發抑制用組合物中浸潰I分鐘後取出，擦去多餘部分，並利用薄膜覆蓋其體表。
[0277]然後，放入SEM試樣室進行了拍攝(圖12)。在電子束照射開始後仍然可以觀察到孑孓幼蟲活動的情況。
[0278]圖12為SEM傳統圖像、和由利用等離子體照射膜(吐溫20)包覆的試樣得到的新的SEM圖像。(a)為孑孓的光學顯微鏡圖像、(b)?⑷為SEM傳統圖像、(f)?(η)為等離子體照射個體(未塗布吐溫2的個體:(f-1);塗布了吐溫20的個體:(k-n))、(e，j, ο)為試樣剖面的TEM圖像。
[0279]對存活的孑孓(a, timeO)在SEM內的高真空下照射了 30分鐘電子射線(b_d,time30)。箭頭代表靜電帶電的區域。
[0280]f-1中，向用I %吐溫20覆蓋的存活的孑孓進行3分鐘等離子體照射(f，timeO)，然後用SEM進行了 30分鐘觀察(g-1)。
[0281]k-n中，利用傳統SEM對存活的孑孓進行了電子射線照射(k為光學顯微鏡圖像)，然後進行了觀察(1-n)。
[0282]將b，g，l的各自中的四方內放大(c，h，m)、進一步放大(d，i，n)。
[0283](e, j, ο)為試樣剖面的TEM圖像，箭頭之間的層是通過等離子體處理而形成的聚合膜。
[0284]
[0285]作為兩親性化合物，使用了Triton?X-100。將 I % (v / V)的 TritonTMX_100溶解於蒸餾水，並使用旋塗機在玻璃上攤開，進行了等離子體聚合，進行與實施例11相同的操作，得到了自立性的薄膜。圖13(a)是通過等離子體照射製成的自立性的聚合膜(Triton?X-100)的光學顯微鏡圖像、圖13(b)是Triton? X-100的化學式。[0286]接著，將作為兩親性化合物的Triton? X-100製成I %水溶液，並使用其製備了蒸發抑制用組合物。
[0287]將存活的孑孓幼蟲在蒸發抑制用組合物中浸潰I分鐘後取出，擦去多餘部分，並利用薄膜覆蓋其體表。
[0288]然後，放入SEM試樣室進行了拍攝（圖13)。c表示Omin時的狀態、d表示30min時的狀態，將d的四方內放大（e)、進一步放大（f)。在電子束照射開始後仍然可以觀察到孑孓幼蟲活動的情況。
[0289]
[0290]作為兩親性化合物，使用了pluronic?F-127。將 I % (v / V)的 pluronic?F-127溶解於蒸餾水，並使用旋塗機在玻璃上攤開，進行了等離子體聚合，進行與實施例11相同的操作，得到了自立性的薄膜。圖14(a)是通過等離子體照射製成的自立性的聚合膜(Triton?X-100)的光學顯微鏡圖像、圖14(b)是pluronic?F_127的化學式。
[0291]接著，將作為兩親性化合物的pluronic?F-127製成I %水溶液，並使用其製備了蒸發抑制用組合物。
[0292]將存活的孑孓幼蟲在蒸發抑制用組合物中浸潰I分鐘後取出，擦去多餘部分，並利用薄膜覆蓋其體表。
[0293]然後，放入SEM試樣室進行了拍攝（圖14)。c表示Omin時的狀態、d表示30min時的狀態，將d的四方內放大（e)、進一步放大（f)。在電子束照射開始後仍然可以觀察到孑孓幼蟲活動的情況。
[0294]
[0295]作為兩親性化合物，使用了 Bri j?35。將1% (v / V)的Bri j?35溶解於蒸餾水，並使用旋塗機在玻璃上攤開，進行了等離子體聚合，進行與實施例11相同的操作，得到了自立性的薄膜。圖15(a)是通過等離子體照射製成的自立性的聚合膜（Brij?35)的光學顯微鏡圖像、圖15(b)是Brij?35的化學式。
[0296]接著，將作為兩親性化合物的Bri j?35製成I %水溶液，並使用其製備了蒸發抑制用組合物。
[0297]將存活的孑孓幼蟲在蒸發抑制用組合物中浸潰I分鐘後取出，擦去多餘部分，並利用薄膜覆蓋其體表。
[0298]然後，放入SEM試樣室進行了拍攝（圖15)。c表示Omin時的狀態、d表示30min時的狀態，將d的四方內放大（e)、進一步放大（f)。在電子束照射開始後仍然可以觀察到孑孓幼蟲活動的情況。
[0299]
[0300]作為兩親性化合物，使用了 CHAPS。將1% (V / V)的CHAPS溶解於蒸餾水，並使用旋塗機在玻璃上攤開，進行了等離子體聚合，進行與實施例11相同的操作，得到了自立性的薄膜。圖16(a)是通過等離子體照射製成的自立性的聚合膜（CHAPS)的光學顯微鏡圖像、圖16(b)是CHAPS的化學式。
[0301]接著，將作為兩親性化合物的CHAPS製成I %水溶液，並使用其製備了蒸發抑制用組合物。
[0302]將存活的孑孓幼蟲在蒸發抑制用組合物中浸潰I分鐘後取出，擦去多餘部分，並利用薄膜覆蓋其體表。
[0303]然後，放入SEM試樣室進行了拍攝(圖16)。c表示Omin時的狀態、d表示30min時的狀態，將d的四方內放大(e)、進一步放大(f)。在電子束照射開始後仍然可以觀察到孑孓幼蟲活動的情況。
[0304]
[0305]作為兩親性化合物，使用了 MEGA8。將I % (V / V)的MEGA8溶解於蒸餾水，並使用旋塗機在玻璃上攤開，進行了等離子體聚合，進行與實施例11相同的操作，得到了自立性的薄膜。圖17(a)是通過等離子體照射製成的自立性的聚合膜(MEGA8)的光學顯微鏡圖像、圖17(b)是MEGA8的化學式。
[0306]接著，將作為兩親性化合物的MEGA8製成I %水溶液，並使用其製備了蒸發抑制用組合物。
[0307]將存活的孑孓幼蟲在蒸發抑制用組合物中浸潰I分鐘後取出，擦去多餘部分，並利用薄膜覆蓋其體表。
[0308]然後，放入SEM試樣室進行了拍攝(圖17)。c表示Omin時的狀態、d表示30min時的狀態，將d的四方內放大(e)、進一步放大(f)。在電子束照射開始後仍然可以觀察到孑孓幼蟲活動的情況。
[0309]
[0310]作為兩親性化合物，使用了膽酸鈉。將1% (V / V)的膽酸鈉溶解於蒸餾水，並使用旋塗機在玻璃上攤開，進行了等離子體聚合，進行與實施例11相同的操作，得到了自立性的薄膜。圖18(a)是通過等離子體照射製成的自立性的聚合膜(膽酸鈉)的光學顯微鏡圖像、圖18(b)是膽酸鈉的化學式。
[0311]接著，將作為兩親性化合物的膽酸鈉製成I %水溶液，並使用其製備了蒸發抑制用組合物。
[0312]將存活的孑孓幼蟲在蒸發抑制用組合物中浸潰I分鐘後取出，擦去多餘部分，並利用薄膜覆蓋其體表。
[0313]然後，放入SEM試樣室進行了拍攝(圖18)。c表示Omin時的狀態、d表示30min時的狀態，將d的四方內放大(e)、進一步放大(f)。在電子束照射開始後仍然可以觀察到孑孓幼蟲活動的情況。
[0314]〈實施例18>
[0315]作為兩親性化合物，使用了正十二烷基-D-麥芽糖苷。將I % (v / ν)的正十二烷基-β -D-麥芽糖苷溶解於蒸餾水，並使用旋塗機在玻璃上攤開，進行了等離子體聚合，進行與實施例11相同的操作，得到了自立性的薄膜。圖19(a)是通過等離子體照射製成的自立性的聚合膜(正十二烷基-β-D-麥芽糖苷)的光學顯微鏡圖像、圖19(b)是正十二烷基-β-D-麥芽糖苷的化學式。
[0316]接著，將作為兩親性化合物的正十二烷基-D-麥芽糖苷製成I %水溶液，並使用其製備了蒸發抑制用組合物。
[0317]將存活的孑孓幼蟲在蒸發抑制用組合物中浸潰I分鐘後取出，擦去多餘部分，並利用薄膜覆蓋其體表。
[0318]然後，放入SEM試樣室進行了拍攝(圖19)。c表示Omin時的狀態、d表示30min時的狀態，將d的四方內放大（e)、進一步放大（f)。在電子束照射開始後仍然可以觀察到孑孓幼蟲活動的情況。
[0319]〈實施例19>
[0320]作為兩親性化合物，使用了正辛基-D-葡糖苷。將1% (V / V)的正辛基-β -D-葡糖苷溶解於蒸餾水，並使用旋塗機在玻璃上攤開，進行了等離子體聚合，進行與實施例11相同的操作，得到了自立性的薄膜。圖20(a)是通過等離子體照射製成的自立性的聚合膜（正辛基-D-葡糖苷）的光學顯微鏡圖像、圖20(b)是正辛基-β-D-葡糖苷的化學式。
[0321]接著，將作為兩親性化合物的正辛基-D-葡糖苷製成I %水溶液，並使用其製備了蒸發抑制用組合物。
[0322]將存活的孑孓幼蟲在蒸發抑制用組合物中浸潰I分鐘後取出，擦去多餘部分，並利用薄膜覆蓋其體表。
[0323]然後，放入SEM試樣室進行了拍攝（圖20)。c表示Omin時的狀態、d表示30min時的狀態，將d的四方內放大（e)、進一步放大（f)。在電子束照射開始後仍然可以觀察到孑孓幼蟲活動的情況。
[0324]
[0325]作為離子液體，使用了 1，3-二烯丙基咪唑鎗溴鹽。將1% (V / V)的1，3_ 二烯丙基咪唑鎗溴鹽溶解於蒸餾水，並使用旋塗機在玻璃上攤開，進行了等離子體聚合，進行與實施例11相同的操作，得到了自立性的薄膜。圖20(a)是通過等離子體照射製成的自立性的聚合膜（1，3-二烯丙基咪唑鎗溴鹽）的光學顯微鏡圖像、圖20(b)是1，3-二烯丙基咪唑鎗溴鹽的化學式。
[0326]接著，將作為離子液體的1，3_ 二烯丙基咪唑鎗溴鹽製成I %水溶液，並使用其製備了蒸發抑制用組合物。
[0327]將存活的孑孓幼蟲在蒸發抑制用組合物中浸潰I分鐘後取出，擦去多餘部分，並利用薄膜覆蓋其體表。
[0328]然後，放入SEM試樣室進行了拍攝（圖21)。c表示Omin時的狀態、d表示30min時的狀態，將d的四方內放大（e)、進一步放大（f)。在電子束照射開始後仍然可以觀察到孑孓幼蟲活動的情況。
[0329]符號說明
[0330]I掃描電子顯微鏡（SEM)
[0331]2預排氣室
[0332]3試樣交換棒
[0333]4 試樣
[0334]5真空計
[0335]6調節閥
[0336]7真空泵
[0337]8 鏡體
[0338]9 電源
[0339]10試樣室[0340]11試樣架
[0341]12手套箱
[0342]13手套箱內的罩體
[0343]14窗部
[0344]15操作用入口
[0345]16不活潑氣體儲氣瓶
[0346]17鐘罩
[0347]18等離子體照射裝置或電子射線照射裝置
[0348]19試樣室內部
[0349]20試樣臺
[0350]21三維操縱裝置
[0351]22二次電子檢測器
[0352]23高速彩色照相機
[0353]24溫度調節裝置
[0354]25傳感器
[0355]30C 型環
[0356]31O 型環
[0357]32聚合膜
[0358]33柵網
[0359]34細胞
【權利要求】
1.一種利用電子顯微鏡觀察試樣的方法，其包括以下工序: 在試樣表面應用蒸發抑制用組合物形成薄膜，從而利用薄膜覆蓋所述試樣的工序，所述蒸發抑制用組合物含有選自兩親性化合物、油脂類及離子液體中的至少1種；和 將收容於真空下的試樣室的用所述薄膜覆蓋的試樣的電子顯微鏡圖像顯示於顯示裝置的工序。
2.一種利用電子顯微鏡觀察試樣的方法，其包括以下工序: 在試樣表面應用蒸發抑制用組合物的工序，所述蒸發抑制用組合物含有選自兩親性化合物、油脂類及離子液體中的至少1種； 向應用了蒸發抑制用組合物的試樣照射電子射線或等離子體，從而在試樣表面形成作為薄膜的聚合膜，利用所述聚合膜覆蓋試樣的工序；以及 將收容於真空下的試樣室的用所述聚合膜覆蓋的試樣的電子顯微鏡圖像顯示於顯示裝置的工序。
3.如權利要求2所述的利用電子顯微鏡觀察試樣的方法，其中，通過在電子顯微鏡的試樣室內向試樣照射試樣觀察用電子射線，從而使聚合反應進行，在試樣表面形成作為薄膜的聚合膜。
4.如權利要求2所述的利用電子顯微鏡觀察試樣的方法，其中，通過在利用電子顯微鏡觀察試樣之前，預先向 試樣照射與電子顯微鏡的試樣觀察用電子射線相區別的電子射線或等離子體，從而使聚合反應進行，在試樣表面形成作為薄膜的聚合膜。
5.如權利要求1~4中任一項所述的利用電子顯微鏡觀察試樣的方法，其中，蒸發抑制用組合物含有兩親性化合物以及選自金屬化合物及糖中的至少1種。
6.如權利要求1~5中任一項所述的利用電子顯微鏡觀察試樣的方法，其中，在不伴隨含水試樣的破壞的情況下，將含水試樣的保持溼潤的狀態的電子顯微鏡圖像顯示於所述顯示裝置。
7.如權利要求1~6中任一項所述的利用電子顯微鏡觀察試樣的方法，其包括以下工序: 在生存著的生物試樣的體表應用蒸發抑制用組合物形成薄膜，從而利用薄膜覆蓋所述試樣的工序；和 將置於真空下的試樣室的用所述薄膜覆蓋的生物試樣在保持存活狀態下的活動的電子顯微鏡圖像顯示於顯示裝置。
8.如權利要求7所述的利用電子顯微鏡觀察試樣的方法，其中，利用所述薄膜抑制與從生物試樣體內的蒸發相伴隨的溫度降低，賦予生物試樣以活動能力，且保持生物試樣本身的形態。
9.如權利要求7或8所述的利用電子顯微鏡觀察試樣的方法，其中，利用所述薄膜，在真空下仍保持用以使生物試樣能夠活動的體內溫度。
10.如權利要求1~9中任一項所述的利用電子顯微鏡觀察試樣的方法，其中，使用掃描電子顯微鏡，在不引起試樣發生電荷積累的情況下，將試樣的電子顯微鏡圖像顯示於顯示裝置。
11.一種真空下的蒸發抑制用組合物，其用於在含有真空下具有蒸發性的物質的試樣表面形成薄膜而覆蓋所述試樣，從而賦予所述具有蒸發性的物質以抑制其在真空下蒸發的阻隔能力，其中，所述蒸發抑制用組合物含有選自兩親性化合物、油脂類及離子液體中的至少1種。
12.如權利要求11所述的真空下的蒸發抑制用組合物，其用於在生存著的生物試樣的體表形成薄膜而覆蓋所述生物試樣，從而賦予生物試樣體內的具有蒸發性的物質以抑制其在真空下蒸發的阻隔能力。
13.如權利要求11或12所述的真空下的蒸發抑制用組合物，其通過向應用了蒸發抑制用組合物的試樣照射電子射線或等離子體，在試樣表面形成作為薄膜的聚合膜，利用所述聚合膜覆蓋試樣。
14.如權利要求11~13中任一項所述的蒸發抑制用組合物，其含有兩親性化合物以及選自金屬化合物及糖中的至少1種。
15.—種掃描電子顯微鏡，其是用於權利要求1~10中任一項所述的利用電子顯微鏡觀察試樣的方法的掃描電子顯微鏡，其具備能夠將配置於鏡體內的試樣室的試樣導入的預排氣室，以及對試樣室及預排氣室進行脫氣的排氣裝置。
16.如權利要求15所述的掃描電子顯微鏡，其中，預排氣室具備手套箱。
17.如權利要求15所述的掃描電子顯微鏡，其中，試樣室或預排氣室中具備等離子體照射裝置或電子射線照射裝置。
18.如權利要求15所述的掃描電子顯微鏡，其中，試樣室或預排氣室中具備能夠作用於試樣的三維操縱裝置。
19.一種掃描電子顯微鏡，其是用於權利要求1~10中任一項所述的利用電子顯微鏡觀察試樣的方法的掃描電子顯微鏡，其在試樣室內具備能夠三維地調節二次電子的檢測器與試樣的相對位置的檢測位置調節機構。
20.—種掃描電子顯微鏡，其是用於權利要求1~10中任一項所述的利用電子顯微鏡觀察試樣的方法的掃描電子顯微鏡，其在試樣室內具備能夠獲取試樣的顏色信息的高速彩色照相機。
21.—種掃描電子顯微鏡，其是用於權利要求1~10中任一項所述的利用電子顯微鏡觀察試樣的方法的掃描電子顯微鏡，其具備能夠調節試樣室內的試樣臺的溫度的溫度調節 |101|裝直。
22.—種掃描電子顯微鏡，其是用於權利要求1~10中任一項所述的利用電子顯微鏡觀察試樣的方法的掃描電子顯微鏡，其在試樣室內具備選自電傳感器、光傳感器、氣體傳感器、水傳感器及溫度傳感器中的至少1種傳感器。
23.一種透射電子顯微鏡，其是用於權利要求1~10中任一項所述的利用電子顯微鏡觀察試樣的方法的透射電子顯微鏡，其具備能夠將配置於鏡體內的試樣室的試樣導入的預排氣室，以及對試樣室及預排氣室進行脫氣的排氣裝置。
24.如權利要求23所述的透射電子顯微鏡，其中，預排氣室具備手套箱。
25.如權利要求23所述的透射電子顯微鏡，其中，試樣室或預排氣室中具備等離子體照射裝置或電子射線照射裝置。
26.—種透射電子顯微鏡，其是用於權利要求1~10中任一項所述的利用電子顯微鏡觀察試樣的方法的透射電子顯微鏡，在配置試樣的柵網的兩面分別具有向所述蒸發抑制用組合物照射電子射線或等離子體而形成的聚合膜。
【文檔編號】G01N1/28GK103843106SQ201280044046
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年9月7日 優先權日:2011年9月9日
【發明者】針山孝彥, 高久康春, 鈴木浩司, 村中祥悟, 太田勳, 下村政嗣, 石井大佑 申請人:獨立行政法人科學技術振興機構