以玉米胚珠為受體的轉基因方法
2023-10-16 21:49:54
以玉米胚珠為受體的轉基因方法
【專利摘要】本發明涉及一種以玉米胚珠為受體的轉基因方法，屬於植物基因工程【技術領域】，應用農桿菌侵染介導的遺傳轉化原理，以授粉後的玉米胚珠為受體，在靠近珠孔的位置刺穿胚珠壁後，將含有目標基因的農桿菌侵染液滴入胚珠，經過共培養、幼胚誘導、分化再生、生根、分子鑑定等步驟，最終獲得轉基因玉米植株。其不但可以有效解決傳統玉米轉基因方法存在的基因型有限、組織培養操作繁瑣、轉化周期長等技術難題，而且具有轉基因植株可育性提高、目標基因高效表達及穩定遺傳等優點，對玉米基因工程的理論研究和遺傳育種實踐均具有重大意義。
【專利說明】以玉米胚珠為受體的轉基因方法
【技術領域】
[0001]本發明具體涉及一種以玉米胚珠為受體的轉基因方法，屬於植物基因工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002]玉米是我國主要的糧食作物之一。一直以來，玉米產量的增長很大程度上依賴於玉米育種水平的不斷提高，但是傳統育種技術已不能滿足當前玉米生產對優良品種的需求。隨著生物技術的不斷發展，利用轉基因方法將優良性狀基因導入玉米，大大縮短育種時間，對玉米品種的遺傳改良具有重要意義(玉米科學，2011/19(5)//64飛7)。目前，以幼胚為受體的傳統玉米轉基因技術體系存在兩個技術難題:第一，玉米遺傳轉化僅限於H99、A188等少數幾個能夠誘導產生胚性愈傷組織的基因型，並且這幾個適於轉化的自交系農藝性狀較差，優良性狀基因應用於實際生產需經多代雜交及回交，這嚴重減緩了玉米轉基因育種進程(Plant Cell Tiss Organ Cul，2007/91//201~214);第二，胚性愈傷組織的激素誘導、除草劑篩選等繁瑣的組培步驟會導致高水平的體細胞變異，造成轉基因的低水平表達和不穩定遺傳(Mol Breed/2004/13//20r208)o為了解決上述技術難題，近年來開展了以受精卵細胞作為受體系統的轉基因研究。研究結果發現，植物受精卵細胞處於未形成細胞壁的類似「原生質體」狀態，此時DNA複製、分離和重組較為活躍，以此為受體開展遺傳轉化，不但易於外源基因整合，而且轉基因植株能夠隨受精卵發育直接再生，進而縮短轉基因植株獲得、避免基因型限制的問題(GM Crops，2010/1//276^287 )。
[0003]在玉米轉基因方面，以受精卵細胞作為受體開展遺傳轉化進展較大的是花粉管通道法和子房注射法，但由於牽涉到機制稍顯複雜的植物雙受精過程，轉化處理條件不易優化，這使得這兩種轉化方法在外源基因導入及整合方面具有一定程度的盲目性，並且可重複性不高(Plant Physiol，2`000/124//1540~1547)。解剖學研究表明受精卵細胞位於玉米胚珠頂部的珠孔端(In Vitro Cell Dev Biol Plant，2003/39//437~442)，以此為依據，將授粉後的離體玉米胚珠作為轉化受體，並直接在珠孔位置進行農桿菌侵染，外源基因就可以準確進入胚珠並整合到受精卵基因組，因此更具有實用性和可操作性。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在於提供一種以玉米胚珠為受體的轉基因方法，其解決了傳統玉米轉基因方法存在的基因型有限、組織培養操作繁瑣、轉化周期長等技術難題，而且具有轉基因植株可育性提高、目標基因高效表達及穩定遺傳等優點，對玉米基因工程的理論研究和遺傳育種實踐均具有重大意義。
[0005]為實現上述目的，本發明採用以下技術方案:以玉米胚珠為受體的轉基因方法，其特徵在於具體步驟如下:
I)農桿菌侵染液的製備:挑取含目標基因的農桿菌單菌落接種於YEP液體培養基中，在28°C，180rpm振蕩培養過夜，4000rpm，4°C離心IOmin後收集菌體，重懸於pH 5.2的侵染培養基中，調節菌液濃度至0D_ = 0.3-0.4後存於4°C備用；
2)玉米胚珠受體的分離:玉米雌穗抽絲前套袋，在花絲已抽出5-lOcm時自花授粉，於花絲授粉後24h取下雌穗，首先用70%酒精擦拭苞葉，並小心剝開內部苞葉，然後把雌穗在
1.5%次氯酸鈉中浸泡15min，無菌水至少洗3次；在超淨工作檯上用解剖刀將雌穗在麥芽糖溶液(90 gl)中取下中部胚珠，用直徑為0.4mm的注射針在胚珠壁靠近珠孔的位置刺穿胚珠壁；
3)農桿菌侵染轉化與培養:將10μ1農桿菌侵染液置於胚珠表面,侵染5min後，吸除表面多餘菌液；將農桿菌侵染轉化後的胚珠轉入PH 5.8的共培養培養基，每個培養皿約接種25個胚珠，23°C暗培養3天；共培養階段結束後，將胚珠轉移到pH 5.8的誘導培養基中，25°C光照培養1-2周，光/暗周期為16/8h，直至小苗出現主莖；將小苗轉移到pH 5.8的生根培養基，經25°C光照培養2-4周，光/暗周期為16/8h，當小苗長至IOcm時，移栽至帶土的花盆中；
4)轉基因植株的分子鑑定:採用PCR或Southern雜交檢測轉基因植株，將陽性植株在溫室中培養至成熟。
[0006]所述的侵染培養基的組分如下:1/2 N6大量，1/2 B5微量，MS維生素，0.001 g/I水解酪蛋白，0.7 g/Ι脯氨酸，0.15 g/Ι肌醇，68.4 g/Ι蔗糖，36 g/Ι葡萄糖，0.5 g/12-N-嗎啉-乙基磺酸，0.001 g/Ι玉米素，0.01962 g/Ι乙醯丁香酮，0.1%植物表面活性劑Silwet-L77。
[0007]所述的共培養培養基的組分如下:1/2 N6大量，1/2 B5微量，MS維生素，0.001g/Ι水解酪蛋白，0.7 g/Ι脯氨酸，0.15 g/Ι肌醇，150 g/Ι蔗糖，0.5 g/1 2_N_嗎啉-乙基磺酸，0.001 g/Ι玉米素，0.03924 g/Ι乙醯丁香酮，3g/l植物凝膠。
`[0008]所述的誘導培養基的組分如下:N6大量，B5微量，MS維生素，I g/Ι水解酪蛋白，0.7 g/Ι 脯氨酸，0.15 g/Ι 肌醇，150 g/Ι 蔗糖，0.5 g/1 2_N_ 嗎啉-乙基磺酸，0.001 g/I玉米素，0.25 g/Ι羧苄青黴素，0.0015 g/Ι雙丙氨膦，3 g/Ι植物凝膠。
[0009]所述的再生培養基的組分如下:N6大量，B5微量，MS維生素，0.25 g/Ι水解酪蛋白，0.7 g/Ι脯氨酸，0.15 g/Ι肌醇，60 g/Ι蔗糖，0.5 g/1 2_N_嗎啉-乙基磺酸，0.001g/Ι玉米素，0.003 g/Ι雙丙氨膦，3 g/Ι植物凝膠。
[0010]所述的生根培養基的原料組成如下:N6大量，B5微量，MS維生素，0.25 g/Ι水解酪蛋白，30 g/Ι蔗糖，0.5 g/1 2-N-嗎啉-乙基磺酸，0.003 g/Ι雙丙氨膦，3g/l植物凝膠。
[0011]本發明的積極效果是1、以授粉後胚珠作為受體的玉米轉基因方法不受基因型限制、適用性較廣，解決了以幼胚為受體的玉米轉基因方法僅限於少數幾個基因型的技術難題，顯著縮短玉米轉基因周期，加快玉米轉基因育種進程；
2、轉化受體玉米胚珠能夠直接形成幼胚並再生分化出高質量轉基因植株，有效避開了以幼胚為受體玉米轉基因操作的組織培養周期較長、體細胞變異水平較高等問題，具有轉基因植株可育性提聞、目標基因聞效表達及穩定遺傳等優點；
3、由於玉米的珠孔位於胚珠頂端，而卵細胞恰恰位於珠孔端，因此直接在珠孔位置進行農桿菌侵染轉化，能夠顯著增加外源基因導入並整合至受精卵基因組的概率，降低花粉管通道法、子房注射法等玉米轉基因方法在外源基因導入及整合方面的盲目性；4、操作步驟簡便高效易於掌握，省時省力可重複性高，無需昂貴儀器設備，適於大規模、產業化玉米轉基因育種。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1玉米子房(a)與胚珠(b)剖面圖箭頭所指為胚珠壁靠近珠孔的刺穿位置。
[0013]圖2農桿菌侵染玉米胚珠3 (a)、9 (b)、15 (c)、21 (d)天后幼胚的發育與轉基因過程。
[0014]圖3農桿菌侵染玉米胚珠後獲得的幼胚再生分化為轉基因植株。
[0015]圖4轉基因植株的PCR分子鑑定結果M:marker ;+:pTF102質粒(陽性對照)；-:未轉化植株(陰性對照)；1-16:轉基因植株(To-19,36,43,97,106,111,151,200,226,229,231，248，259，261，265，267)，其中 2、3、8、9、11、15 為轉基因陰性植株，1、4、5、6、7、10、12、13、14、16為轉基因陽性植株。
[0016]圖5轉基因植株的Southern雜交分子鑑定結果 WT:未轉化植株(陰性對照)；
1-4:隨機選擇的4個轉基因株系。
【具體實施方式】
[0017]通過以下實施例進一步描述本發明，並不以任何方式限制本發明，在不背離本發明的技術解決方案的前提下，對本發明所作的本領域普通技術人員容易實現的任何改動或者改變都將落入本發明的權利要求範圍內。
[0018]實施例:利用以玉米胚珠`為受體的轉基因方法轉化自交系
(I)培養基的配製
本發明所用的培養基列在表1中。
[0019]表1以玉米胚珠為受體的轉基因方法涉及到的培養基
【權利要求】
1.以玉米胚珠為受體的轉基因方法，其特徵在於具體步驟如下: 1)農桿菌侵染液的製備:挑取含目標基因的農桿菌單菌落接種於YEP液體培養基中，在28°C，180rpm振蕩培養過夜，4000rpm，4°C離心IOmin後收集菌體，重懸於pH 5.2的侵染培養基中，調節菌液濃度至OD_ = 0.3-0.4後存於4°C備用； 2)玉米胚珠受體的分離:玉米雌穗抽絲前套袋，在花絲已抽出5-lOcm時自花授粉，於花絲授粉後24h取下雌穗，首先用70%酒精擦拭苞葉，並小心剝開內部苞葉，然後把雌穗在1.5%次氯酸鈉中浸泡15min，無菌水至少洗3次；在超淨工作檯上用解剖刀將雌穗在麥芽糖溶液(90 gl)中取下中部胚珠，用直徑為0.4mm的注射針在胚珠壁靠近珠孔的位置刺穿胚珠壁； 3)農桿菌侵染轉化與培養:將10μ1農桿菌侵染液置於胚珠表面,侵染5min後，吸除表面多餘菌液；將農桿菌侵染轉化後的胚珠轉入PH 5.8的共培養培養基，每個培養皿約接種25個胚珠，23°C暗培養3天；共培養階段結束後，將胚珠轉移到pH 5.8的誘導培養基中，25°C光照培養1-2周，光/暗周期為16/8h，直至小苗出現主莖；將小苗轉移到pH 5.8的生根培養基，經25°C光照培養2-4周，光/暗周期為16/8h，當小苗長至IOcm時，移栽至帶土的花盆中； 4)轉基因植株的分子鑑定:採用PCR或Southern雜交檢測轉基因植株，將陽性植株在溫室中培養至成熟。
2.根據權利要求1所述的以玉米胚珠為受體的轉基因方法，其特徵在於所述的侵染培養基的組分如下:1/2 N6大量，1/2 B5微量，MS維生素，0.001 g/Ι水解酪蛋白，0.7 g/1脯氨酸，0.15 g/Ι肌醇，68.4 g/Ι蔗糖，36 g/Ι葡萄糖，0.5 g/1 2_N_嗎啉-乙基磺酸，0.001 g/Ι玉米素，0.01962 g/Ι乙醯丁香酮，0.1%植物表面活性劑Silwet_L77。
3.根據權利要求1所述的以玉米胚珠為受體的轉基因方法，其特徵在於所述的共培養培養基的組分如下:1/2 N6大量，1/2 B5微量，MS維生素，0.001 g/Ι水解酪蛋白，0.7 g/I脯氨酸，0.15 g/Ι肌醇，150 g/Ι蔗糖，0.5 g/1 2_N_嗎啉-乙基磺酸，0.001 g/Ι玉米素，0.03924 g/Ι乙醯丁香酮，3g/l植物凝膠。
4.根據權利要求1所述的以玉米胚珠為受體的轉基因方法，其特徵在於所述的誘導培養基的組分如下:N6大量，B5微量，MS維生素，I g/Ι水解酪蛋白，0.7 g/Ι脯氨酸，0.15g/Ι肌醇，150 g/Ι蔗糖，0.5 g/1 2-N-嗎啉-乙基磺酸，0.001 g/Ι玉米素，0.25 g/Ι羧苄青黴素，0.0015 g/Ι雙丙氨膦，3 g/Ι植物凝膠。
5.根據權利要求1所述的以玉米胚珠為受體的轉基因方法，其特徵在於所述的再生培養基的組分如下:N6大量，B5微量，MS維生素，0.25 g/Ι水解酪蛋白，0.7 g/Ι脯氨酸，0.15 g/Ι 肌醇，60 g/Ι 蔗糖，0.5 g/1 2-N-嗎啉-乙基磺酸，0.001 g/Ι 玉米素，0.003g/Ι雙丙氨膦，3 g/Ι植物凝膠。
6.根據權利要求1所述的以玉米胚珠為受體的轉基因方法，其特徵在於所述的生根培養基的原料組成如下:N6大量，B5微量，MS維生素，0.25 g/Ι水解酪蛋白，30 g/Ι蔗糖，0.5 g/1 2-N-嗎啉-乙基磺酸，0.003 g/Ι雙丙氨膦，3g/l植物凝膠。
【文檔編號】A01H4/00GK103497970SQ201310395028
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月4日 優先權日:2013年9月4日
【發明者】陳亮, 賀紅霞, 叢媛媛, 郝東雲 申請人:吉林省農業科學院