保護肝臟及增進身體免疫調節功能的樟芝萃取物膠囊用途的製作方法

2023-05-13 05:18:51

專利名稱：：保護肝臟及增進身體免疫調節功能的樟芝萃取物膠囊用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種保護肝臟及增進身體免疫調節功能的樟芝萃取物膠囊用途。
背景技術：
：現有的樟芝人工萃取物，因所含多醣體及三萜類的成份不一樣，對於護肝功能及對身體免疫功能的作用，可以發揮多大的效用，沒有確實的實驗以為證明，此乃樟芝萃取物有待改進的缺點。
發明內容本發明所要解決的主要技術問題在於，克服現有技術存在的上述缺陷，而提供一種保護肝臟及增進身體免疫調節功能的樟芝萃取物膠囊用途，本發明在非特異性免疫功能試驗中，具有促進腹腔吞噬細胞活性、調節抗腫瘤細胞激素分泌及促進血清抗體生成的免疫調節功能的作用。本發明解決其技術問題所採用的技術方案是(—)護肝試驗本試驗以四氯化依體重100g投0.2ml為標準餵藥量，每周投予2次，共八周，試驗組於開始試驗前1天，每日經口投予本樟芝一次，直到實驗終了，Wistar雄性大鼠由樂斯科生物科技股份有限公司提供，飼育溫度22士2t:，照明時間12小時(07:00開燈，19:00熄燈)，飼料為福壽牌老鼠飼料，自由攝食，飲水為經逆滲透純水機處理的飲用水，亦自由供飲，試驗動物經過2周的馴化檢疫，最後篩選健康且體重正常增重的動物，做試驗使用。肝如果受傷害，肝細胞內的GOT及GPT會漏出來，使血清中的GOT和GPT活性上升，其中GPT為肝的專一性指標，這是肝的靜態指針，肝受傷發炎，也會啟動肝的再生，使肝重量增加，肝含水增加，肝纖維化會影響脾臟的血流量使脾臟腫大，這些均可用來測定肝是否受傷害或纖維化。而肝合成蛋白質的功能則可借測定肝合成的血漿中白蛋白或者肝中可流性蛋白質的含量而得知肝的能力如何。本試驗以四氯化碳誘發慢性肝炎，以服用樟芝實驗，並以Silymarin藥物對照服用效果，經過八周的實驗，由表一看出，GPT有顯著的降低，由1396U/L降至784U/L，由表三看出，肝蛋白質由149mg/gtissue升至183mg/gtissue,顯示本發明的保肝效果顯著。[OOW](二)特異性免疫試驗由於免疫功能在正常或是某些疾病都扮演一個重要的關是，因此需正確地評估試劑的免疫功能調節，就需要建立動物模式或是人體的臨床試驗來加以評估。特異性免疫功能評估試驗，是餵食BALB/c小鼠測試物質及注射卵蛋白(ovalbumin,OVA)後，分別測定免疫細胞增生能力及血清抗體濃度等。因此在評估免疫細胞的功能時，應該分別由質與量兩方面來加以分析。量方面主要是測定各種免疫細胞的數目，目前利用螢光流體計數儀可以很容易地將免疫細胞正確地計算出。由特異性免疫反應相關指標，來評估試劑可得完整而具體的免疫調節功能。本發明在經過連續十周口服餵食試驗物質予BALB/c小鼠後，分別測定免疫細胞增生能力及血清抗體生成。經由試驗結果顯示如下免疫細胞增生能力方面(表四)正對照組脾臟細胞以LPS剌激，其免疫細胞增生能力顯著高於對照組。試驗物質低、中、高劑量和正對照組脾臟細胞以OVA剌激，其免疫細胞增生能力顯著高於對照組。血清抗體生成方面(表五)試驗前、第一次致敏前及第二次致敏前，各劑量組及正對照組的OVA專一性免疫球蛋白G，和對照組無差異性存在；各劑量組及正對照組的OVA專一性免疫球蛋白M，和對照組無差異性存在；各劑量組及正對照組的OVA專一性免疫球蛋白E，和對照組無差異性存在。犧牲時，高劑量與正對照組的OVA專一性免疫球蛋白G，顯著高於對照組；正對照組的OVA專一性免疫球蛋白M，顯著高於對照組；各劑量組及正對照組的OVA專一性免疫球蛋白E，和對照組無差異性存在。依據前述結果顯示，本發明在特異性免疫功能試驗中，具有促進免疫細胞增生能力及血清特異性抗體生成的免疫調節功能的作用。(三)非特異性免疫試驗此試驗目的為藉由非特異性免疫反應指標，以評估試驗物質的非特異性免疫調節功能。由於免疫功能在正常或是某些疾病都扮演一個重要的關是，因此若要正確地評估試驗物質的免疫功能調節，就需要建立動物模式或是人體的臨床試驗來加以評估。非特異性免疫功能評估試驗，是在餵食試驗物質後分別測定免疫細胞增生能力、自然殺手細胞活性、腹腔吞噬細胞活性、細胞表面標記、細胞激素分泌能力及血清抗體濃度等。因此在評估免疫細胞的功能時，應該分別由質與量兩方面來加以分析。量方面主要是測定各種免疫細胞的數目，目前利用螢光流體計數儀可以很容易地將免疫細胞正確地計算出。質的方面，由非特異性免疫反應相關指標，來評估試驗物質的完整而具體的免疫調節功能。此試驗為測試本發明在非特異性免疫調節功能上是否有其功效。在經過連續六周口服餵食試驗物質予BALB/c小鼠後，分別測定腹腔吞噬細胞活性、細胞激素分泌能力及血清抗體生成等。經由試驗結果顯示如下腹腔吞噬細胞活性方面(表六)在M0I等於5的比例下，試驗物質中、高劑量和正對照組的腹腔吞噬細胞活性顯著高於對照組。細胞激素分泌功能方面(表七)試驗物質低、中、高劑量和正對照組脾臟細胞以LPS剌激，其TNF-d的分泌顯著高於對照組。試驗物質中劑量和正對照組脾臟細胞以ConA剌激，其IFN-Y的分泌顯著高於對照組。血清抗體生成方面(表八)犧牲時，低、中、高劑量及正對照組的免疫球蛋白G，顯著高於對照組。依據前述結果顯示，本發明在非特異性免疫功能試驗中，具有促進腹腔吞噬細胞活性、調節抗腫瘤細胞激素分泌及促進血清抗體生成的免疫調節功能的作用。(四)安全性測試1.沙門氏菌回復突變試驗2.體外哺乳類細胞染色體結構異常試驗3.嚙齒類外圍血液微核試驗4.90天亞慢性大鼠口服投予試驗5.大鼠致畸胎毒性試驗下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明。圖1是本發明護肝試驗的方塊流程圖圖2是本發明特異性及非特異性免疫試驗的方塊流程圖具體實施例方式本發明的較佳實施例如下所述(—)護肝試驗試驗組別與投予劑量1.劑量計算本發明建議劑量為每天4顆，每顆500mg。成人每天用量為500mgX4=2000mg/day。大鼠口服劑量依據實驗動物與人體表面積比等效劑量換算比率計算。大鼠200公克與70公斤人的表面積比值為0.018，因此大鼠每天的劑量為2000mgX0.018=0.036g/200gbodyweight,即180mg/kg。本試驗使用的劑量為每天投予180、540、1080mg/kg，分別為人體劑量的1、3、6倍。控制組大鼠給予同體積的0.5%carboxymethylcellulose(CMC)。對照藥物silymarin(sigma)使用劑量為200mg/kg。2.試驗物質配製臨用時，將膠囊解開，倒出粉末，以0.5%CMC分別配成濃度為1S、54及108mg/ml的懸浮液，經口投予、投予體積為每100公克大鼠體重投與1毫升。對照藥物silymarin懸浮於0.5%CMC，配製濃度為20mg/ml。3.試驗設計試驗物質於第一次四氯化碳溶液投予前一天開始投予，而後每日投予直至大鼠犧牲前一天止，投予時間為每日下午1:00-1:40。每周兩次經口投予四氯化碳溶液，於第一次及第三次投予時，大鼠先絕食一晚，其它投予時不絕食。四氯化碳投予時間為早上8:00-8:40。於四氯化碳投予後滿一、三、六周時，大鼠在乙醚麻醉下由尾動脈抽血，供血漿生化值檢定。第八周採血時，大鼠也同時犧牲，迅速取下肝臟及脾臟，以冰冷生理食鹽水洗淨後，吸乾水分，稱重。最大葉肝臟分成兩部分，相同的部位分別(1)浸於10%中性福馬林溶液，供病理切片使用，(2)稱重後在1000C完全烘乾供膠原蛋白含量測定。其餘肝臟分裝4袋，儲存於-800C備用。每周稱體重一次，做為當周投予試驗物質的體重依據。四氯化碳溶於橄欖油配製成20%的溶液，每次投予量為0.2ml/100gbodyweight。4.實驗結果(1)對血清G0T、GPT及albumin值的影響(表一)大鼠投予四氯化碳的後，第一、三、六及八周的血漿GOT、GPT值均顯著高於控制組。於第一至第八周，樟芝(540、1080mg/kg)處理的大鼠，其血漿GPT及GOT值低於四氯化碳組。Silymarin處理的大鼠對第一至第八周的血漿GOT、GPT值皆沒有影響。大鼠投予四氯化碳的後，第六、八周的血漿albumin、值較正常控制組低。樟芝處理的大鼠對第六周血漿albumin值沒有影響，樟芝(1080mg/kg)處理的大鼠可以增加第八周血漿albumin值。Silymarin處理的大鼠對第六、八周的血漿albumin值沒有改善作用。表一第八周樟芝對CC14誘發大鼠慢性肝炎G0T、GPT及Albumin值的影響tableseeoriginaldocumentpage7Allvaluesaremeans士S.D.(n=10).###P<0.001comparedwithcontrolgroup.*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001comparedwithCC14+CMCgroup.[OO46](2)對肝臟、脾臟重量及肝臟含水量的影響(表二)大鼠投予四氯化碳的後，最後的肝臟及脾臟重量較控制組高。樟芝和silymarin處理組的肝臟的重量與四氯化碳組比較沒有差異。樟芝(1080mg/kg)處理組其脾臟重量明顯低於四氯化碳組。四氯化碳組的肝臟含水量百分比明顯高於正常控制組，樟芝(1080mg/kg)處理組的肝臟含水百分率較四氯化碳組低。Silymarin的處理對大鼠肝臟、脾臟重量及肝臟的含水量皆沒有影響。表二樟芝對CC14誘發大鼠慢性肝炎肝臟、脾臟重量及肝臟含水量的影響tableseeoriginaldocumentpage8tableseeoriginaldocumentpage9Allvaluesaremeans士S.D.(n=10)..###P<0.001comparedwithcontrolgroup.*P<0.05comparedwithCC14+CMCgroup.5.結論由以上綜合結果，本發明經動物實驗結果明確顯示有下列功效1.可降低血槳GPT和GOT值。2.可增加血漿白蛋白。3.可減輕脾臟腫大。4.可降低肝臟含水量。5.可增加肝臟蛋白質含量。(二)特異性免疫試驗自財團法人國家實驗研究院國家實驗動物中心購入4-5周齡BALB/c雌性小鼠。小鼠是適合用來做免疫功能評估的實驗動物。本品是小鼠已有豐富的基礎參考資料與數據，可應用於本試驗結果的分析與評估。試驗設計如下1.飼育管理a.飼育室第C室b.飼育環境tableseeoriginaldocumentpage10c.環境監效溫度、溼度每日d.飼育龐與頭數tableseeoriginaldocumentpage10e.飼料tableseeoriginaldocumentpage10tableseeoriginaldocumentpage10種類淡水鎮自來水須先經由附有紫外線裝置的R.0.純水機(PR02000TM，I.W.TechnologiesInc.)處理後，將其裝填於動物飲用水瓶，再經由隧道式高溫高壓滅菌鍋(YTM-A，永大明儀器股份有限公司)消毒滅菌以供動物飲用。飲用水汙染檢查本公司安全性毒性試驗使用的無菌水，每月一次進行菌落計數定期監測。g.動物室入室與器材搬入實驗人員先將手及腳用70%酒精噴霧消毒，再以藥皂及無菌水洗臉。然後換穿經高溫高壓滅菌過的實驗用衣類(包括工作服、帽、口罩、手套、襪子)後進入飼育室。飼育器材洗淨並乾燥後，經高溫高壓滅菌後搬入動物室。實驗器具類需經高溫高壓滅菌後，方得搬入動物室。不宜高溫高壓滅菌的器具及試驗物質，則以70%酒精噴霧消毒後，經附有紫外燈的passbox;方得搬入動物室。2.投予量設定a.對照組10ml/kg(注射用蒸餾水)b.低劑量0.26g/kg(相對人體口服建議1倍劑量)c.中劑量0.78g/kg(相對人體口服建議3倍劑量)d.高劑量1.30g/kg(相對人體口服建議6倍劑量)e.正對照組0.30g/kg(市售雙鶴極品靈芝)3.試驗組別11tableseeoriginaldocumentpage12試驗動物80隻雌鼠入室後，先暫做臨時編號並量測體重。經過約1周的馴化、檢疫，在此期間每日進行臨床症狀的觀察，最後經由獸醫師判斷，篩選出健康且體重正常增加的動物，方提供做試驗，最後各組實際動物總數為50隻。4.試驗物質、對照物質的投予a.試驗物質配製方法、投藥途徑、投藥次數將試驗物質配製成不同濃度的餵食劑量，物質投予以試驗開始當日口服投予試驗物質一次，共投予10周，並於第6周時同時腹腔注射OVA及CompleteFreundsAdjuvant(CFA)，第8周時同時腹腔注射OVA及IncompleteFreundsAdjuvant(IFA)。b.投藥劑量的計算投藥量的算出乃根據當周體重為準，依小鼠各別體重給予相等口服體積10ml/kg。5.動物分組及個體與組別的識別a.動物分組購入後於動物房先給予適應期逢機稱重後，以S型方式將體重相近編為一組，以統計分析確認各組間體重無顯著性差異。b.個體識別耳號(打耳洞法)。c.試驗組的識別各試驗組飼育籠都附上標示卡標示籠號、品是、性別、周齡及動物編號。6.動物觀察及檢查項目a.臨床症狀觀察試驗期間每日進行臨床觀察，並記錄動物是否有臨床症狀，其它異常中毒症狀或死亡。例假日亦照常進行臨床症狀觀察。發現日及所有異常症狀與程度記錄在個別動物資料表。瀕死動物，施以安樂死，並做剖檢。死亡動物亦得進行剖檢，並找出可能致死原因。b.體重測定供試驗動物於投藥日投藥開始前、投藥期間每周一次、動物犧牲日，量測動物體重。c.飼料攝取量投藥期間動物飼料攝取量每周量測一次。量測方法為體重秤重當日加入定量飼料，一周後結算飼料消耗量與剩餘量g/mice/cage)。7.卵蛋白(ovalbumin，OVA)的給予以OVA對小鼠進行腹腔注射。小鼠在餵食前，先採血以作實驗基準值。餵食6周時，第一次注射OVA以致敏小鼠，每隻小鼠注射6.25gOVA和CFA入腹腔內，以得到OVA特異性抗體的產生，2周後第二次腹腔注射12.5gOVA和IFA為追加致敏。分別於試驗前、OVA致敏前、第二次致敏前與試驗動物犧牲時採血以追蹤血清中OVA特異性IgG、IgM及IgE濃度，其濃度計算以TMB呈色後的吸光值(Absorbencies，A)計算的，單位為ELISAUnit(EU)，計算公式如下所示ELISAunits,EU=(Asample-Ablank)/(Apositive-Ablank)8.測試方式免疫細胞增生能力測試在餵食試驗物質連續10周並在餵食期間給予兩次OVA後，取出試驗動物的脾臟細胞，以剌激物(ConcanavalinA，ConA;Lipopolysaccharide，LPS或Ovalbumin,OVA)剌激後，再以CellTiter96AQueousOneSolutionReagent測定，比較各劑量組與對照組有無差異性存在。OVA誘發特異性抗體生成於試驗前、OVA致敏前、第二次致敏前與試驗動物犧牲時採血，利用ELISA以追蹤血清中OVA特異性IgG、IgM及IgE濃度，比較各劑量組與對照組有無差異性存在。9.實施結果(1)免疫細胞增生能力(表四)小鼠經犧牲後取出脾臟細胞，加入細胞裂殖原(ConcanavalinA，ConA;Lipopolysaccharide，LPS或Ovalbumin,OVA)培養後以CellTiter96AQueousOneSolutionReagent測定免疫細胞增生能力。正對照組脾臟細胞以LPS剌激，其免疫細胞增生能力顯著高於對照組(P<0.05);試驗物質各劑量和正對照組脾臟細胞以OVA剌激，其免疫細胞增生能力顯著高於對照組(P〈0.05，如下表)顯示試驗物質具有促進免疫細胞增生能力的功能。表四免疫細胞增生能力組動物只脾臟細胞別數ConALPSOVAA101.75±0.181.74±0.251.69±0.15B101.83±0.121.87±0.191.92±0.12*C101.81±0.301.73±0.322.00±0.31*D101.85±0.241.84±0.322.00±0.25*E101.96±0.262.06±0.29*2.08士0.30*13本項測試乃利用CellTiter96⑧AQueousOneSolutionReagent來測定免疫細胞增生能力*表示與對照組相較，在統計上有顯著差異(P<0.05)ConA:ConcanavalinALPS:LipopolysaccharideOVA-OvalbuminA:對照組B:低劑量組C:中劑量組D:高劑量組E:正對照組(2)0VA誘發特異性抗體生成(表五)在餵食試驗物質期間，採集試驗前、OVA致敏前、第二次致敏前與試驗動物犧牲時血液，以ELISA檢測血清內對OVA專一性的免疫球蛋白濃度。試驗前、第一次OVA致敏前及第二次致敏前的血清內免疫球蛋白濃度，各劑量組及正對照組在統計上與對照組無顯著差異。犧牲時，血清內免疫球蛋白濃度結果顯示，試驗物質高劑量及正對照組的0VA專一性免疫球蛋白G(Anti-0VAIgG)在統計上與對照組有顯著差異(P<0.05，如下表)，此外，正對照組的0VA專一性免疫球蛋白M(Anti-0VAIgM)在統計上與對照組也有顯著差異(P<0.05，如下表)，而試驗物質各劑量及正對照組的OVA專一性免疫球蛋白E(Anti-0VAIgE)在統計上與對照組則無顯著差異(P<0.05，如下表)。顯示本試驗物質具有促進OVA專一性抗體IgG生成的功能。表五血清抗體生成tableseeoriginaldocumentpage15本項測試乃利用ELISA來測定血清中抗體生成的情形*表示與對照組相較，在統計上有顯著差異(P<0.05)A:對照組B:低劑量組C:中劑量組D:高劑量組E:正對照組10.結論依據前述結果顯示，本發明在特異性免疫功能試驗中，具有促進免疫細胞增生能力及血清特異性抗體生成的免疫調節功能的作用。(三)非特異性免疫試驗自財團法人國家實驗研究院國家實驗動物中心購入4-5周齡BALB/c雌性小鼠。小鼠是適合用來做免疫功能評估的實驗動物。本品是小鼠已有豐富的基礎參考資料與數據，可應用於本試驗結果的分析與評估。1.試驗設計同本發明「特異性免疫實驗」第1至6項。2.測試方式(1)腹腔吞噬細胞活性在餵食試驗物質連續六周後，取出試驗動物的腹腔吞噬細胞，以螢光標定的E.coli(FITC-E.coli)令其吞噬，再以流式細胞儀分析其活性，比較各劑量組與對照組有無差異性存在。(2)細胞激素分泌功能在餵食試驗物質連續六周後，取出試驗動物的脾臟細胞，加入剌激物(ConA或LPS)培養48-72小時，以酵素連結免疫分析法(EnzymeLinkedI匪nosorbentAssays,ELISA)測得細胞激素分泌量，比較各劑量組與對照組有無差異性存在。[One](3)血清抗體生成餵食試驗物質期間，採集試驗物質投予前、投予後第三周及犧牲時動物血液，以ELISA測定血清內各免疫球蛋白的濃度，比較各劑量組與對照組有無差民間性存在3.實驗結果(1)腹腔吞噬細胞活性(表六)小鼠經犧牲後採集腹腔吞噬細胞，加入FITC-E.coli令其吞噬，再以流式細胞儀進行吞噬細胞活性分析。在Multiplicityofinfection(MOI)等於5時，試驗物質中、高劑量和正對照組的腹腔吞噬細胞活性顯著高於對照組(P<0.05)。顯示本試驗物質具有促進腹腔吞噬細胞的活性的功能表六腹腔吞噬細胞活性組動物只MOI=1MOI=5MOI=25別數A1016.35±4.9933.17±8.9871.68±7.23B1020.20±5.8937.88±5.8275.39±6.74C1020.54±5.6943.59±11.03*78.29±5.29D1023.12±10.6644.67±11.53*77.55±7.52E1023.01±7.4045.78±8.63*75.73±9.05本項測試乃利用流式細胞儀來測定吞噬細胞吞噬能力*表示與對照組相較，在統計上有顯著差異(P<0.05)MOI-multiplicityofinfectionA:對照組B:低劑量組C:中劑量組D:高劑量組E:正對照組(2)細胞激素分泌功能(表七)小鼠經犧牲後取出脾臟細胞，在未加入裂殖原及加入細胞裂殖原(ConA或LPS)的剌激下，分別作用培養48-72小時後，利用ELISA測試免疫細胞分泌細胞激素的16情形。在ConA或LPS的剌激下，脾臟細胞其介白質素IL-2(Interleukin-2)分泌，試驗物質各劑量及正對照組在統計上與對照組無顯著差異。在LPS的剌激下，腫瘤壞死因子(Tumornecrosisfactor-alpha,TNF-d)的分泌，試驗物質各劑量及正對照組在統計上與對照組有顯著差異(P<0.05)。在ConA的剌激下，幹擾素(Interferon-gamma，IFN-y)的分泌，試驗物質中劑量及正對照組在統計上與對照組有顯著差異(P<0.05)。顯示本試驗物質具有調節抗腫瘤細胞激素分泌的功能。表七脾臟細胞激素分泌功能tableseeoriginaldocumentpage17tableseeoriginaldocumentpage18tableseeoriginaldocumentpage19本項測試乃利用ELISA來測定脾臟細胞激素分泌的情形*表示與對照組相較，在統計上有顯著差異(P<0.05)A:對照組B:低劑量組C:中劑量組D:高劑量組E:正對照組(3)血清抗體生成(表八)在餵食試驗物質期間，採集試驗物質投予前、投予後第三周與犧牲時動物血液，以ELISA檢測血清內免疫球蛋白濃度。投予前，血清內免疫球蛋白濃度結果顯示，各劑量組在統計上與對照組無顯著差異。投予中，血清內免疫球蛋白濃度結果顯示，各劑量組在統計上與對照組無顯著差異。犧牲時，血清內免疫球蛋白濃度結果顯示，試驗物質低、中、高劑量及正對照組的免疫球蛋白G(Imm皿oglobulinG，IgG)在統計上與對照組有顯著差異(P<0.05)，而IgM各劑量組在統計上與對照組無顯著差異。顯示本試驗物質具有促進血清抗體IgG生成的功能。表八血清抗體生成tableseeoriginaldocumentpage19tableseeoriginaldocumentpage20本項測試乃利用ELISA來測定血清中抗體生成的情形*表示與對照組相較，在統計上有顯著差異(P<0.05)A:對照組B:低劑量組C:中劑量組D:高劑量組E:正對照組4.結論依據前述結果顯示，本發明在非特異性免疫功能試驗中，具有促進腹腔吞噬細胞活性、細胞激素分泌及血清抗體生成的免疫調節功能的作用。(四)安全性測試:1.沙門氏菌回復突變試驗沙門氏菌回復突變試驗(Amestest)的目的，是為了解試驗物質在未經或經過大鼠肝臟代謝是統活化後微生物是統是否會發生基因突變，藉此試驗可以進行試驗物質的基因毒性評估。本試驗乃遵循0ECDguidelineft471的規範所進行。此結果表示本發明在本試驗設計條件下無論是否經過代謝活化過程，皆不會顯著引發沙門氏菌回復突變。2.體外哺乳類細胞染色體結構異常試驗本試驗的目的，在於試驗物質經由大鼠肝臟活化酵素是統代謝前及代謝後，對中國倉鼠卵巢細胞(Chinesehamsterovarycells)引發直接或間接染色體結構變異的種類、數量及細胞毒性，藉以評估試驗物質在體外哺乳類細胞的基因毒性。本試驗乃遵循0ECD#473的規範所進行。依此結果顯示本發明在本試驗濃度下，於體外哺乳類細胞染色體結構異常試驗結果為陰性反應。3.嚙齒類外圍血液微核試驗本試驗的目的，以本發明為試驗物質，測試其對嚙齒類動物體內(invivo)外圍血液微核發生的比例，直接或間接引發紅血球染色體或有絲分裂器基因變異及造成傷害程度，藉以評估本發明在動物體內的基因毒性。本試驗乃遵循OECDguidelineft474的規範進行。根據1000mg/kgB.W.、2000mg/kgB.W.及4000mg/kgB.W.各劑量結果顯示，本發明對於動物體內外圍血液微核發生為陰性反應。4.90天亞慢性大鼠口服投予試驗本試驗為遵循OECDguideline#408規範進行試驗，其目的是在測試本發明經90天重複給藥後，對大鼠可能產生的毒性影響，了解毒性變化的產生，同時測定無毒性顯示的劑量。結果顯示，本發明經90天重複給予後對SD雌雄大鼠在臨床病理及病理組織學上皆未發現與試驗物質有關聯的病變。因此3000mg/kg可當成「不造成任何不良副作用」(NoObservedAdverseEffectLevel,NOAEL)的劑量。5.大鼠致畸胎毒性試驗本試驗的目的，是在檢測試驗物質對懷孕母鼠引發的毒性反應以及在動物胎兒的器官形成期導致胎兒死亡、發育遲滯或畸形的可能性。本試驗以本發明的最高劑量3000mg/kg對懷孕母鼠重複投予，未發現到一般毒性反應，並且也未影響到胎兒器官的形成或發育。因此3000mg/kg可為「不造成任何不良副作用」No-Observed-Adverse-Effect-Level,NOAEL)的劑量。權利要求一種保護肝臟及增進身體免疫調節功能的樟芝萃取物膠囊用途，其特徵在於，一、以四氯化碳，誘發大鼠慢性肝炎，每周兩次、共八周，經由GPT、GOT的測定，肝臟、脾臟及肝含水量測定、肝臟蛋白質及hydroxyproline含量的測定，實證，本發明可以減輕四氯化碳所誘發的大鼠慢性肝炎。二、以測試物質餵食BALB/c小鼠、及注射卵蛋白後，得到本發明具有促進免疫細胞增生能力、及血清特異性抗體生成的免疫調節功能的作用。三、藉由BALB/c小鼠，連續六周，口服試驗，得到本發明具有促進腹腔吞噬細胞活性、調節抗腫瘤細胞激素分泌、及促進血清抗體生成的免疫調節功能的作用。四、針對本發明實證下列五項安全性測試(委託綠色四季生物科技股份有限公司做實驗)4-1.沙門氏菌回復突變試驗測試濃度為5mg/plate、2.5mg/plate、1.25mg/plate、0.625mg/plate、0.3125mg/plate，於此劑量下進行回復突變試驗的平板測試。在本試驗設計條件下無論是否經過代謝活化過程，皆不會顯著引發沙門氏菌回復突變。4-2.體外哺乳類細胞染色體結構異常試驗本試驗根據染色體結構異常試驗劑量決定原則，訂定5mg/ml。此濃度作為本試驗的最高處理劑量，其它劑量依次為2.5、1.25、0.625及0.3125mg/ml。本試驗共觀察200個分裂中期的細胞。結果顯示正對照組的染色體變異細胞數明顯高於負對照組(p＜0.01)，且負對照組染色體異常數為3％以下，表示此次試驗為有效試驗。4-3.嚙齒類外圍血液微核試驗本試驗測試其對嚙齒類動物體內(invivo)外圍血液微核發生的比例，藉以評估其直接或間接引發紅血球染色體或有絲分裂器基因變異及造成傷害程度。在微核發生率方面，每1000個網狀紅血球中，含微核數目，各劑量組與負對照組間，無論在48或72小時，均無顯著差異。而正對照組的網狀紅血球發生率的平均值下降，且網狀紅血球中微核發生率的平均值增加，故本實驗的結果合於有效性的認定。4-4.90天亞慢性大鼠口服投予試驗本試驗在下列八項通過試驗(1)臨床症狀觀察(2)死亡率(3)體重變化(4)飼料攝取量(5)肉眼觀察病變(6)臨床病理分析(7)臟器重量比較(8)組織病理判讀4-5.大鼠致畸胎毒性試驗本試驗在以下八項通過毒性試驗(1)臨床觀察(2)體重變化(3)飼料攝取(4)平均黃體數、著床數、胎兒數、著床前及著床後的胎兒死亡率(5)胎兒性別比、重量及身長(6)胎兒外觀異常檢查(7)胎兒內臟以及骨骼異常檢查(8)胎兒骨骼骨化程度。全文摘要本發明分別以大鼠及小鼠，服用特殊製程取得的，使用固態培養得到的樟芝膠囊，做護肝、及免疫調節功能的測試，護肝試驗以四氯化碳，誘發大鼠慢性肝炎，每周兩次、共八周，經由GPT、GOT的測定，肝臟、脾臟及肝含水量測定、肝臟蛋白質及hydroxyproline含量的測定，本發明可以減輕四氯化碳所誘發的大鼠慢性肝炎。特異性免疫試驗以測試物質餵食BALB/c小鼠、及注射卵蛋白後，本發明促進免疫細胞增生能力、及血清特異性抗體生成的免疫調節功能的作用。非特異性免疫試驗藉由BALB/c小鼠，連續六周，口服試驗，本發明促進腹腔吞噬細胞活性、調節抗腫瘤細胞激素分泌、及促進血清抗體生成的免疫調節功能的作用。文檔編號G01N33/50GK101785793SQ20091000112公開日2010年7月28日申請日期2009年1月23日優先權日2009年1月23日發明者王金燦申請人:偉誠生物科技有限公司