一種用於溶菌酶發酵的培養基的製作方法

2023-05-12 14:14:31 2

專利名稱：：一種用於溶菌酶發酵的培養基的製作方法
技術領域：
：本發明屬於遺傳工程和蛋白質工程領域，具體涉及一種用於溶菌酶發酵的培養基。
背景技術：
：人溶菌酶是一種鹼性球蛋白，由英國著名科學家弗萊明發現的，是一種有效的抗菌劑，全稱為1,4-N-溶菌酶或者粘肽N-乙醯基胞壁醯水解酶。它能水解細菌細胞壁的肽聚糖中N-乙醯胞壁酸和N-乙醯葡萄糖胺之間的e-l，4糖苷鍵，破壞肽聚糖支架，在細菌內部滲透壓作用下導致細胞壁破裂，達到殺菌效果。在人體內，人溶菌酶分布相當廣泛，主要存在於體液、細胞和組織器官中。人溶菌酶在體內的廣泛分布說明它對人體的重要性。人溶菌酶具有多種獨特而重要的藥理作用，有些抗菌效應與酶本身催化作用無關。第一，抗菌消炎作用。肽聚糖是革蘭氏陽性菌細胞壁的一種重要成分。人溶菌酶可水解肽聚糖中N-乙醯胞壁酸和N-乙醯葡萄糖胺之間的(32-1，4糖苷鍵，在滲透壓作用下導致革蘭氏陽性菌細胞壁破裂，從而發生溶菌作用。在體內環境下，與分泌型免疫球蛋白A、補體協同作用，人溶菌酶還能水解某些革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌等。此外，真菌細胞壁中亦存在N2-乙醯葡萄糖胺和N2-乙醯葡萄糖胺形成的P2-1,4糖苷鍵，因此，人溶菌酶能夠抗此類真菌的感染。人溶菌酶亦能與體內誘發炎症的各種酸性生物活性物質結合，使其失活，並增強抗生素和其他藥物的療效，改善組織基質的粘多糖代謝，從而有利於修復被炎症損傷的組織。第二，抗病毒作用。人溶菌酶是一種鹼性蛋白質，在體內近於中性的pH環境下帶有大量正電荷，可與帶負電荷的病毒蛋白直接作用，與DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復鹽，使侵入體內的病毒失活。第三，增強免疫力作用。溶菌酶參與機體內多種免疫反應，在機體IH常防禦和非特異性免疫中具有重要作用。它可改善和增強巨噬細胞吞噬消化功能，降低細胞抑制劑導致的白細胞減少，結合細菌脂多糖，減輕內毒素作用，從而達到增強機體抵抗力的目的。第四，人溶菌酶能夠激活血小板，改善組織局部循環障礙，分解膿液，增強局部防衛，從而具有體現抗菌、消炎、止痛等作用。在臨床上，人溶菌酶對眼、耳、鼻、喉、口腔等的急、慢性炎症均有一定療效，特別是對急性炎症如急性咽炎、急性喉炎、急性中耳炎等效果明顯。與抗生素聯合使用，對於嚴重的急性炎症亦有一定療效。在治療皮膚病方面，人溶菌酶亦有廣泛用途，可用於治療扁平疣、傳染性軟疣、尋常性疣、尖銳溼疣、帶狀皰疹等多種皮膚病。對於帶狀皰疹，內服溶菌酶即可。此外，人溶菌酶可用於小兒或乳兒哮喘性支氣管炎、呼吸道內膜腫脹等，能夠使黏膜腫脹很快消除，使痰液變稀、呼吸通暢。人溶菌酶亦可預防和治療病毒性肝炎，尤其對輸血後肝炎及急性肝炎的效果較為顯著。在機體內溶菌酶還具有抗流感病毒的活性，其與膽酸鹽酸鹽的複合物能強烈抑制流感病毒和腺病毒的生長，並能防止皰疹性病毒感染。迄今，耐藥菌的發展相當嚴重，如耐青黴素的肺炎鏈球菌，對青黴素、紅黴素、磺胺等藥品等己不敏感。肺炎克雷伯氏菌對西力欣、復達欣等16種高檔抗生素的耐藥性高達51.85%100%。從細菌的耐藥性產生過程來看，丌發一種新的抗生素需要10年左右時間，而一代耐藥菌的產生僅需2年時間，因此，抗生素的研製速度遠不及耐藥菌的產生速度，急需開發一種針對不同耐藥菌的有效藥物用於臨床治療。人溶菌酶的殺菌機制不同於抗生素，對於各種耐藥菌同樣有效，因此可滿足這種緊迫需要。目前，在臨床上應用的溶菌酶主要是蛋清溶菌酶，由於其是一種異源蛋白，在人體內會產生免疫原性和毒副作用。而從人奶、胎盤或尿液中少量提取人溶菌酶，來源極其困難，無法進行工業化生產。並且從生物材料提取溶菌酶有其固有缺陷，一是受生物材料來源限制，二是生物材料由於取自不同生物體，保鮮程度不一，易受病毒和其他有害物質汙染，這會造成產品質量不穩定。且天然人溶菌酶價格昂貴，因此無法用於臨床。迄今，國內尚無人溶菌酶的規模生產。各實驗室使用的人溶菌酶大多為進口產品，隨著對人溶菌酶的臨床應用研究的深入，國內迫切需要質優價廉的人溶菌酶供應。
發明內容本發明目的是對溶菌酶的發酵培養基進行優化，使人溶菌酶的產量穩定於較高水平，從而達到規模生產要求。本發明提供了一種用於溶菌酶發酵的培養基，該培養基中甘油含量為5-40ml/L'蛋白腖含量為10-50g/L，pH值為7-8.5。較好的，甘油含量為5-20ml/L，例如，5ml/L，10ml/L，15ml/L，18ml/L，20ml/L等；蛋白腖含量為20-40g/L，例如，25g/L，27g/L,30g/L，35g/L，38g/L，40g/L,等；pH值為7，7.2，7.5，7.8，8.0,8.2，8.4等。本發明的培養基還可以加入酵母粉，酵母粉的含量為0-50g/L。例如，10g/L,15g/L，18g/L，20g/L，25g/L,30g/L'35g/L,40g/L'45g/L'等。本發明的培養基還可以加入葡萄糖，葡萄糖的含量為0-40g/L。例如，10g/L，15g/L，18g/L，20g/L，25g/L,30g/L，35g/L，40g/L等。本發明的培養基還可以加入磷酸鹽，磷酸鹽含量為0-0.1M/L。本發明的培養基中，磷酸鹽可以是磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩衝液，磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩衝液，磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩衝液，等。本發明中，未及的培養基條件均按常規處理。本發明採用工業上常用的蛋白腖、酵母粉等原料進行生產，生產成本低廉，適於大規模生產。與Invitrogen公司提供的培養基相比，生產1克人溶菌酶成本從6000餘元人民幣，降至2000餘元人民幣，從而提高了產品的競爭力；此外，與工業上常用的培養基相比，本發明採用的培養基大大簡化，生產效率明顯提高，成本降低，且營養平衡，產量增加，為基因工程菌的擴大生產奠定了基礎。圖1為生物量積累能力比較圖。其中，一令一為An培養基；一隱一為Bu培養基；一A—為Cu培養基；一X—為D,,培養基；一*一為Eu培養基。圖2為培養基濃度篩選比較圖。其中，一—為A^培養基；一國一為Bu培養基；一為C^培養基；一X—為D22培養基。具體實施例方式實施例1生物量積累能力選用5種培養基進行篩選Au，BMGY培養基；Bu，培養基成分(1L):酵母提取物10g，蛋白腖20g,甘油10ml，0.1M磷酸鉀緩衝液；Cu，培養基成分(1L):酵母提取物20g，蛋白腖40g，甘油10ml，0.1M磷酸鉀緩衝液；I,培養基成分(1L):酵母提取物30g，蛋白腖60g，甘油10ml，0.1M磷酸鉀緩衝液；Eu，培養基成分(1L):酵母提取物40g，蛋白腖80g，甘油10ml，0.1M磷酸鉀緩衝液。分裝500ml三角瓶，每瓶100ml，除培養基A21過濾除菌外，其餘培養基用2MNa0H溶液調節pH為5.5，121°C，20min滅菌。接種Lyz6-78等量種子培養液，培養條件同上。培養開始後，每隔12h取樣，共6次，計算菌體溼重，繪製菌體生長曲線。在接種後36h左右(即對數生長末期)，培養基An即BMGY與Ch菌體生物量達到相同水平，分別為0.058g/ml與0.057g/ml，均高於培養基BH在對數生長末期的菌體生物量0.046g/ml;與在培養基Dn與Eu中，對數生長期延長，菌體生物量在72h左右分別達到0.062g/ml與0.066g/ml。實施例2生物量積累階段培養條件優化選擇甘油，蛋白腖，PBS濃度3個因素，各設三個水平，進行U(33)正交實驗，重複兩次。分裝500ml三角瓶，每瓶100ml，用2MNaOH溶液調節pH為5.5，12rC，20min滅菌。接種菌體量、培養條件同上。培養開始後，每隔12h取樣，共6次，計算發酵液中菌體溼重及達到菌體溼重峰值的時間。結果詳見表1。tableseeoriginaldocumentpage7實施例3培養基濃度篩選培養基Aa成分(1L):即正交實驗初歩優化培養基，甘油5ml，蛋白腖20g;培養基B22成分(1L):甘油10ml,蛋白腖40g;培養基(:22成分(比)甘油15ml，蛋白腖60g;培養基022成分(1L):甘油20ml，蛋白腖80g。分裝500ml三角瓶，每瓶100ml。培養基處理方法、接種菌體量、培養條件均同上。培養開始後，每隔12h取樣，共6次，計算菌體溼重，繪製菌體生長曲線。將培養基濃度提高一倍後，在培養60h後(即對數生長末期)，培養基BM的菌體生物量達0.047g/ml，比培養基1,在培養36h後(即對數生長末期)的菌體生物量0.028g/ml提高70%左右。繼續提高酵母提取物含量，菌體生物量明顯降低，在培養基D22中，菌體幾不生長。此外，隨著培養基濃度的提高，菌體的對數生長期延長。培養基A22在接種後36h左右達到對數生長末期，培養基822在接種後60h左右達到對數生長末期，培養基"2在接種後72h仍未達到對數生長末期。實施例4培養基舉例tableseeoriginaldocumentpage8上述培養基培養2-3天，得到的菌體生物量均達到30g/L以上。權利要求1.一種用於溶菌酶發酵的培養基，其特徵在於，該培養基中甘油含量為5-40ml/L，蛋白腖含量為10-50g/L，pH值為7～8.5。2.如權利要求l所述的培養基，其特徵在於，該培養基還含有磷酸鹽，磷酸鹽含量為0-0.1M/L。3.如權利要求2所述的培養基，其特徵在於，該培養基中磷酸鹽是磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀或者磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀。4.如權利要求1所述的培養基，其特徵在於，該培養基還含有酵母粉，酵母粉的含量為0-50g/L。5.如權利要求1所述的培養基，其特徵在於，該培養基還含有葡萄糖，葡萄糖的含量為0-40g/L。全文摘要本發明屬於遺傳工程和蛋白質工程領域，具體涉及一種用於溶菌酶發酵的培養基。溶菌酶的用途相當廣泛。許多研究者都在不斷優化溶菌酶生產技術，以期在提高溶菌酶產量的同時降低生產成本。本發明採用工業上常用的蛋白腖、酵母粉等原料進行生產，生產成本低廉，適於大規模生產。與Invitrogen公司提供的培養基相比，生產1克溶菌酶成本從6000餘元人民幣，降至2000餘元人民幣，從而提高了產品的競爭力；此外，與工業上常用的培養基相比，本發明採用的培養基大大簡化，生產效率明顯提高，成本降低，且營養平衡，產量增加，為基因工程菌的擴大生產奠定了基礎。文檔編號C12N9/36GK101353625SQ20071004426公開日2009年1月28日申請日期2007年7月26日優先權日2007年7月26日發明者龍餘,唐麗莎,李宗林,鵬黃申請人:復旦大學