一種鯊魚血管生成抑制因子及其生產純化方法和應用的製作方法

2023-05-15 18:08:21

專利名稱：一種鯊魚血管生成抑制因子及其生產純化方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程技術領域，具體涉及一種鯊魚血管生成抑制因子及其生成純 化方法和應用。
背景技術：
鯊魚是極少患惡性腫瘤的海洋動物之一，其發病率為百萬分之一。美國科學家 Luer將高劑量的強致癌劑黃麴黴素B1注射到鯊魚體內，也不能誘發鯊魚患癌症。給鯊魚接 種癌細胞也不能誘發癌症。這提示鯊魚體內具有獨特的抗腫瘤機制(賀麗虹1，黃建華2， 沈頌東等，海洋科學/2005年/第29卷/第11期63-66)。多年來，世界各國的研究人員多數是對鯊魚軟骨組織進行了研究，從中分離提取 了多種具有腫瘤抑制作用，尤其是抑制腫瘤新生血管生長的多種物質，如Lee等(Lee A, Langer R. Shark cartilage contains inhibitors of tumorangiogenesis)首次從一條姥 鯊的鰭和脊椎軟骨中分離提取了一種強烈抑制實體瘤新生血管生成的活性蛋白質。這類從鯊魚軟骨中提取的具有血管生成抑制活性的蛋白質稱之為鯊魚血管生 成抑制因子(Shark Cartilage Angiogenesis Inhibiting Factor, SCAIF)。Sheu 等 (Sheu JR, FuCC, Tsai ML, et al. Effect of U-995, a patent shark cartilage-derived angiogenesis inhibitor, on anti-angiogenesis and antitumor activities[J]. Anticancer Res, 1998,18 (6A) :4435)。從藍鯊軟骨中分離純化了由兩條多肽組成的新血管 生成抑制因子U-995，可顯著抑制人臍靜脈內皮細胞的增殖與遷移，並會引起新血管的中斷 和破裂，阻止破壞由腫瘤壞死因子TNF-a誘導的雞胚絨毛尿囊膜血管生成，防止由膠原酶 誘導的膠原溶解。目前，從各種鯊魚軟骨中分離提取的物質純度不等，相對分子量大小不一，理化性 質和生物學活性不盡相同的蛋白質和多糖類物質。更有人直接將鯊魚軟骨粉作為口服藥 物，如1997年，加拿大批准鯊魚軟骨口服液AE2941/Neovastat進入III期臨床試驗，它是 至今進入III期臨床試驗為數不多的抗血管生成藥物之一。目前鯊魚血管抑制因子(SAIF)的相關專利主要集中在提取的鯊魚血管生成抑制 因子和鯊魚軟骨粗製劑的製備和應用。由於鯊魚的天然資源日漸枯竭，而鯊魚人工養殖技 術難題至今未能突破，造成了 SAIF無法大規模應用於臨床的困境，因此通過基因工程的手 段克隆獲得血管生成抑制因子無疑成為大規模生產SAIF的唯一途徑，這對於我國海洋藥 物產業的可持續發展與海洋生物資源保護也將產生積極的影響。

發明內容
本發明的目的在於根據現有鯊魚血管抑制因子的研究中存在的來源少、無法大規 模應用於臨床的問題，通過基因工程的手段得到一種鯊魚血管生成抑制因子的胺基酸序 列。本發明另一目的在於提供鯊魚血管生成抑制因子的cDNA序列。
3
本發明另一目的在於提供一種包含鯊魚血管生成抑制因子的cDNA序列的重組表 達載體。本發明另一目的在於提供一種表達鯊魚血管生成抑制因子的重組微生物。本發明另一目的在於提供上述鯊魚血管生成抑制因子的生產純化方法。本發明還有一個目的在於提供上述鯊魚血管生成抑制因子的應用。本發明上述目的通過以下技術方案予以實現本發明通過PCR克隆技術從條紋斑竹鯊軟骨中獲得鯊魚血管生成抑制因子 (SCAIF)的全長cDNA序列，該序列長692bp，序列如SEQ ID NO 2所示，其中包括552bp的 開放閱讀框(從第15個鹼基 第563個鹼基，包括一個終止密碼子)，編碼183個胺基酸， 胺基酸序列如SEQ ID NO 1所示。本發明將上述鯊魚血管生成抑制因子的基因序列與表達載體相連接，構建包含鯊 魚血管生產抑制因子cDNA的重組表達載體，然後轉化大腸桿菌感受態細胞，最終獲得能夠 表達鯊魚血管生成抑制因子的重組蛋白。本發明鯊魚血管生成抑制因子的生產方法具體包括如下步驟(1)從鯊魚軟骨組織中提取總RNA ；(2)根據現有已知的鯊魚血管生成抑制因子序列的保守區域設計引物，序列如SEQ ID NO :4 9所示；(3)通過PCR擴增得到鯊魚血管生成抑制因子的基因全長序列；(4)將所得基因序列克隆至表達載體中，得到重組表達載體；(5)將重組表達載體轉化感受態大腸桿菌細胞，挑取單克隆接種到培養基中並誘 導表達進行篩選。選取高表達的菌株BL21/pET3C-SAIF在22L發酵罐中進行發酵，發酵8h 後離心收取菌體。經超聲波破碎後，高速離心，收取沉澱即為含有鯊魚血管生成抑制因子重 組蛋白的包涵體。上述鯊魚血管生成抑制因子以包涵體形式存在，通過體外細胞學試驗檢測，該重 組蛋白具有抑制血管內皮細胞生長的作用，同時通過雞胚尿囊膜實驗證明該蛋白可以抑制 血管的生長，說明該重組蛋白具有抑制血管生長的作用。本發明還將鯊魚血管生成抑制因子重組蛋白進行了純化，即將包涵體變性、離 心、去除雜質，再加入到復性液中，經過攪拌、離心、除雜，Ni FAST FLOW親和層析柱純化，得 到純度> 90%的重組鯊魚血管生成抑制因子。由於上述鯊魚血管生成抑制因子具有抑制血管內皮細胞生長及抑制血管生長的 作用，因此可以用於製備抑制血管生成的藥物，尤其是用於製備抑制腫瘤血管生成或生長 的藥物。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果本發明提供一種新的的鯊魚血管生成抑制因子的全長cDNA序列及其編碼的氨基 酸序列，不但豐富了鯊魚血管生成抑制因子的基因庫而且本發明通過生物克隆以及蛋白表 達技術發現該cDNA序列的表達蛋白具有抑制血管內皮細胞生長以及抑制血管生長的作 用，可用於製備抑制血管生成的藥物，尤其是用於製備抑制腫瘤血管生成或生長的藥物。此 外，本發明通過基因工程的方法克隆獲得新的鯊魚血管生成抑制因子的方法，可用於大規 模生產鯊魚血管生成抑制因子，對我國海洋藥物產業的可持續發展與海洋生物資源保護具有積極的影響。


圖1為鯊魚血管生成抑制因子全長cDNA全序列的PCR電泳圖；其中，1為PCR擴 增產物，M為DNA Marker ；通過PCR獲得了鯊魚血管生成抑制因子SAIFcDNA，為692bp。圖2為重組載體pET3C-SAIF的PCR鑑定電泳圖；其中，M為DNA Marker ；1為PCR 產物(552bp)，該圖顯示經過PCR可以得到約為550bp的產物，與目的產物552bp相符。圖3為重組載體pET3C-SAIF的酶切鑑定電泳圖；其中，Ml為\ DNA/Hind III (TaKaRa)Marker, 1 為重組載體pET3C_SAIF，2 為重組載體pET3C_SAIF/BamH 1,3 為重組 載體pET3C-SAIF/Nde 1，4 為重組載體pET3C_SAIF/BamH I+Nde I，M2 為 lOObp DNA Ladder ； 酶切結果顯示，雙酶切後有一條大小約為550bp的條帶，與目的基因相符，說明目的基因已 插入到重組載體中；圖4為菌體BL21/pET3C-SAIF的誘導表達SDS-PAGE電泳圖；其中，M為蛋白 Marker，0為未誘導對照，1 3為陽性克隆誘導表達；與未誘導相比較，3個克隆經誘導後， 在22kDa處都有一條明顯的蛋白條帶，證明重組蛋白經誘導後獲得表達；圖5SAIF的Ni NTA親和層析純化圖，重組SAIF經Ni柱親和層析，收集洗脫峰進 行電泳；圖6為重組蛋白SAIF的純化電泳圖；其中，M為蛋白Marker，1為發酵菌體，2為包 涵體清洗，3為M柱純化後洗脫峰；電泳顯示，經過M柱親和層析，在洗脫峰中可以獲得純 度達到90%以上的重組SAIF。圖7為不同濃度重組蛋白SAIF對血管內皮細胞增殖抑制作用曲線圖；實驗顯示， 重組SAIF對血管內皮細胞增殖具有抑制作用，並呈濃度依賴關係；圖8鯊魚血管抑制因子SAIF抑制雞胚尿囊膜血管生長；其中，1 3為實驗組，4 6為對照組，與對照組相比較，實驗組的血管密度明顯降低，說明重組SAIF對雞胚尿囊膜血 管生長具有抑制作用。
具體實施例方式以下結合實施例來進一步解釋本發明，但實施例並不對本發明做任何形式的限定。實施例1鯊魚血管生成抑制因子全長cDNA序列及其編碼胺基酸序列的獲得本實施例通過基因克隆技術，從條紋斑竹鯊軟骨組織中製備得到鯊魚血管生成抑 制因子(SAIF)的全長cDNA序列及其編碼胺基酸序列，具體步驟如下所示1. RNA提取和cDNA第一鏈的合成從條紋斑竹鯊軟骨組織中提取總RNA提取與純化按照Promega公司的SVTotal RNA Isolation System試劑盒的說明書操作進行。cDNA第一鏈的合成使用TaKaRa RNA LA PCR TM Kit(AMV)試劑盒，以上述條紋斑 竹鯊軟骨組織RNA為模板，oligo (dT) 18為反轉錄引物，操作按試劑盒推薦方法進行。-20°C 保存備用。2.引物設計
根據現有已知的SAIF序列，通過分析判斷SAIF序列的保守區域，設計系列引物， 引物序列如SEQ ID NO :4 9所示。3. PCR 擴增PCR 擴增的反應條件為94°C預變性 3min，94°C 60s，40°C 60s，72°C 60s，共 30 個 循環，最後72°C延伸5min。PCR擴增體系為PCR Buffer4dNTP2rTaq0. 2質粒2F2R2ddH207. 8_20 U 1PCR擴增結果如圖1所示，從圖中可以看出，PCR擴增得到大約700bp的產物(箭 頭所指位置)。將PCR產物採用常規的切膠回收、純化、T載體連接、轉化感受態細胞、檢測陽性克 隆等本領域技術人員的常用技術，將所得陽性克隆送交測序。測序結果顯示PCR擴增得到一條長692bp的序列，通過對該序列進行分析以及 生物學親緣鑑定，發現其胺基酸序列與現有的SCAIF序列具有很高的同源性，其中與狗鯊 中克隆到的基因有85. 2%的同源性，與人和斑馬魚的相關基因的同源性分別為68. 9%和 62. 3%。該基因序列不同於任何一種已知的SAIF序列，由此證明本實施例得到一條新的鯊 魚血管生成抑制因子的全長序列，長度為692bp，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。對上述SEQ ID N0:1所示核苷酸序列進行分析，結果表明該序列編碼183個氨基 酸，其胺基酸序列如SEQ ID N0:1所示。實施例2重組載體的構建、鑑定、表達與純化1.重組載體的構建和鑑定1. 1根據cDNA中開放閱讀框的基因序列設計上下遊引物Fw和Rv P1，其核苷酸序列如SEQ ID NO 10所示；P2，其核苷酸序列如SEQ ID NO 11所示。在引物P1上有NdeI酶切位點，在引物P2上有BamHI酶切位點。1.2PCR 擴增PCR 擴增的反應條件為94°C預變性 3min，94°C 60s，40°C 60s，72°C 60s，共 30 個 循環，最後72°C延伸5min。PCR擴增體系為PCR Buffer4dNTP2rTaq 酶0. 2
質粒2Fw2Rv2ddH207. 8_20 U 1PCR擴增結果如圖2所示，從圖中可以看出，PCR擴增得到大約550bp的產物(箭 頭所指位置)。將實施例1得到的鯊魚血管生成抑制因子基因序列克隆至原核表達載體PET3C 中，構建得到重組載體，命名為PET3C-SAIF，將該重組載體轉化感受態大腸桿菌細胞DH5a， 並塗布LB(Amp+)平板，挑取陽性克隆並進行酶切鑑定，酶切鑑定電泳結果如圖3所示。從圖3可以看出，酶切得到一條552bp的條帶，與預期目的片斷大小相符，由此說 明已經成功構建含有鯊魚血管生成抑制因子基因序列的重組載體。上述重組載體的構建、轉化大腸桿菌感受態細胞、塗布以及酶切鑑定等試驗均採 用本領域技術人員的常規操作。2.重組蛋白的表達將上述經過鑑定的重組載體pET3C-SAIF轉化感受態大腸桿菌細胞BL21 (DE3)，塗 布LB(Amp+)平板，挑取單克隆接種到LB培養基中，當0D = 0. 6時，加入IPTG誘導表達，誘 導3h後收取菌體(將該菌體命名為BL21/pET3C-SCAIF)，進行SDS-PAGE電泳。SDS-PAGE電泳結果如圖4所示，從圖中可以看出，在22kDa處有一條明顯的條帶 (箭頭所指位置)，該蛋白為183個胺基酸，蛋白理論分子量為22kDa，，因此該條帶位置與預 期目的蛋白大小相符，由此說明本實施例成功獲得鯊魚血管生成抑制因子全長cDNA序列 表達的重組蛋白SAIF。挑取表達量高的克隆作為菌種在搖瓶中擴大培養，同樣條件下誘導表達，誘導3h 後離心收取菌體，經超聲波破碎，離心後分別製備上清和沉澱的樣品，進行SDS-PAGE電泳， 發現目的蛋白均存在於沉澱中，說明重組SAIF的表達形式為包涵體形式。上述重組載體轉化大腸桿菌感受態細胞、塗布、IPTG誘導表達以及SDS-PAGE電泳 等試驗均採用本領域技術人員的常規操作。3 菌體 BL21/pET3C_SAIF 的發酵將上述獲得的菌體BL21/pET3C-SAIF在22L發酵罐中進行發酵處理，所採用的操 作均為本領域的常規方法，具體工藝條件如下在22L發酵罐中加入10L培養基(培養基含有蛋白腖1. 6%，酵母粉1. 6%，糖蜜 0.5%及磷酸緩衝液(Na2HP040. 2%，NaH2P040. 1 %, pH7. 0)，所述百分比均為質量百分比。 37°C培養，接種量10% (質量百分比)；溶氧控制在發酵前期低速，中期高速，後期低速；連 續流加葡萄糖250g，同時通過流加NaOH或HC1，控制pH變化；IPTG在發酵進行到3小時時 加入，誘導4小時後放罐最終獲得菌體25g/L。4.重組蛋白SAIF的純化離心收集上述發酵罐發酵所得菌體細胞，按照1 8(重量體積)的比例將細胞 重懸在破碎緩衝液中(50mM Tris+300mM NaCl, PH 7. 5)，超聲波破碎細胞後離心，棄上清。
7沉澱用緩衝液A[50mM Tris,2% Triton X-100(v/v), PH8. 0]進行包涵體清洗，棄上清，收 集包涵體。將包涵體溶於變性液(6M鹽酸胍，ImM EDTA，ImM DTT)進行包涵體變性，12000rp 離心30min，去除部分不溶雜質，保留上清。再將上清用濾紙過濾，進一步去除不溶雜質。 將上一步去除雜質的變性包涵體按1 10(v/v)比例滴加加入到復性液(0. 1M Tris,lmM EDTA, 0. 5M L-精氨酸，PH8. 0)中，用磁力攪拌器於4°C攪拌18h，然後12000rpm離心30min, 去除部分不溶雜質，保留上清。再將上清用濾紙過濾，進一步去除不溶雜質。將復性後的蛋 白溶液用NiFAST FLOW親和層析柱純化，得到復性的重組蛋白SAIF。包涵體清洗以及柱上復性洗脫後取樣進行SDS-PAGE電泳，結果如圖5所示，從圖 中可以看出，通過親和層析，一步獲得了純度> 90%的重組蛋白SAIF。實施例3 重組蛋白SAIF對血管內皮細胞的抑制作用以及對雞胚尿囊膜血管生 長抑制的檢測1.重組蛋白SCAIF抑制血管內皮細胞增殖的檢測將人臍靜脈血管內皮細胞HUVEC以lX104Cells/Well的密度培養於96孔板，培 養液為Hams F-12。將重組蛋白SAIF 按照 5ug/mL、10ug/mL、20ug/mL、40ug/mL、80ug/mL 的濃度分別加 入培養液共培養三天，然後進行MTT染色，觀察不同濃度重組蛋白SCAIF的染色結果。從圖6中可以看出，重組蛋白SCAIF對血管內皮細胞增殖具有抑制作用，並呈濃度 依賴性。2.對雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管生成的抑制買回孵化第6天的雞胚，放在實驗室的恆溫箱內適應ld，第二天，打開雞胚尿囊膜 一端，將濾膜剪成直徑1mm的正方形，並將實施例2製備所得鯊魚血管生成抑制因子小分 子肽0. 3ug/ul加在濾膜上，空白對照為生理鹽水，加樣量為20ul，等濾膜吸收了樣品後， 將其放在尿囊膜上，並用透明膠布封嚴，7d以後，打開透明膠布，用固定液(甲醇丙酮= 1 1，體積比)固定3min後，用剪刀剪下濾膜周圍的尿囊膜，平鋪於培養皿上，用相機拍 攝。實驗結果如圖8所示，從圖中可以看出，實驗組加入了鯊魚血管抑制因子小分子 肽的樣本中血管密度明顯低於對照組，說明鯊魚血管生成抑制因子小分子肽可以抑制雞胚 絨毛尿囊膜血管生成。
權利要求
一種鯊魚血管生成抑制因子，其胺基酸序列如SEQ ID NO1所示。
2.編碼權利要求1所述鯊魚血管生成抑制因子胺基酸序列的cDNA，其核苷酸序列如 SEQ ID NO 2 所示。
3.一種重組表達載體，其特徵在於所述重組表達載體包含權利要求2所述的cDNA序列。
4.一種重組微生物，其特徵在於所述重組微生物是由權利要求3所述重組表達載體轉 化大腸桿菌感受態細胞製備而得。
5.權利要求1所述鯊魚血管生成抑制因子的生產純化方法，其特徵在於包括如下步驟(1)從鯊魚軟骨組織中提取總RNA；(2)根據現有已知的鯊魚血管生成抑制因子序列的保守區域設計引物，序列如SEQID NO :4 9所示；(3)通過PCR擴增得到鯊魚血管生成抑制因子的基因全長序列；(4)將所得基因序列克隆至表達載體中，得到重組表達載體；(5)將重組表達載體轉化感受態大腸桿菌細胞BL21，挑取單克隆接種到培養基中，擴 增培養並誘導表達，離心收取菌體，經破碎、離心後所得沉澱即為包涵體形式的鯊魚血管生 成抑制因子；(6)將包涵體變性、離心、去除雜質，再加入到復性液中，經過攪拌、離心、過濾除雜、Ni FAST FLOW親和層析柱純化，得到復性的重組鯊魚血管生成抑制因子。
6.權利要求1所述鯊魚血管生成抑制因子在製備抑制血管生成或生長的藥物中的應用。
7.根據權利要求6所述鯊魚血管生成抑制因子的應用，其特徵在於所述抑制血管生成 是抑制腫瘤血管生成或生長。
全文摘要
本發明公開了一種鯊魚軟骨血管生成抑制因子及其生產純化方法和應用。本發明鯊魚軟骨血管生成抑制因子的胺基酸序列如SEQ ID NO1所示，編碼鯊魚軟骨血管生成抑制因子胺基酸序列的cDNA序列如SEQ ID NO2所示。本發明鯊魚軟骨血管生成抑制因子具有抑制血管內皮細胞生長及抑制血管生長的作用，可用於製備抑制血管生成或生長，特別是腫瘤血管生成或生長的藥物。
文檔編號C07K14/475GK101891811SQ20101019151
公開日2010年11月24日 申請日期2010年5月28日 優先權日2010年5月28日
發明者梁旭方, 洪岸, 謝秋玲, 陳小佳 申請人:暨南大學