一種基於光學dna生物傳感器的1,8-二氨基萘的檢測方法
2023-05-15 10:49:41
專利名稱：一種基於光學dna生物傳感器的1,8-二氨基萘的檢測方法
技術領域：
本發明屬於分析化學和DNA生物傳感技術領域，涉及一種基於光學DNA生物傳感器的I，8-二氨基萘的檢測方法，能快速有效的實現對I，8-二氨基萘的檢測。
背景技術：
芳香胺是一類重要的環境汙染物，已被列為優先監控的環境汙染物之一。在工業上芳香胺用途非常廣泛，作為重要的化工原料和精細化工中間體，常被用於印染、製藥、醫藥、農藥、塑料、橡膠、紡織、陶瓷上釉和油漆等工藝生產過程，尤其是印染工業，廢水常含高濃度的芳香胺中間體，而且部分染料經過複雜的化學反應和微生物作用最終也會釋放出芳香胺汙染物，從而造成環境的汙染。此外，芳香胺化合物進入人體後經過體內的酶的活化作用可對DNA造成損害，引起DNA突變，從而誘發癌症等惡性疾病(如導致膀胱癌、輸尿管癌、腎癌)，對人類的健康危害極大。芳香胺的分析檢測方法有很多種，如氣相色譜法、高效液相色譜法、毛細管電泳法、氣相色譜-質譜法、液相色譜-質譜法等，這些方法能同時定量測定多種芳香胺汙染物，具有高效靈敏等特點，但是具有設備昂貴、需專業技術人員操作、樣品處理繁瑣等缺點。隨著電化學技術和DNA生物傳感技術的發展，DNA生物傳感器作為一種新型的檢測技術亦被用於檢測芳香胺汙染物。Wang等應用天然小牛胸腺DNA修飾的碳糊電極生物傳感器，實現了對2-氨基荼、I-氨基蒽、2-氨基蒽、9,10- 二氨基菲、I-氨基批等芳香胺類汙染物的檢測。Chiti等採用天然DNA和含人工合成的含23個鹼基的DNA片段修飾的絲網石墨印刷電極傳感器，對芳香胺2-氨基萘、2-氨基蒽、1，2_ 二氨基蒽醌、吖啶黃等化合物進行了檢測。Prabhakar等應用天然小牛胸腺DNA修飾的聚卩比咯_聚氯乙烯磺酸鹽/氧化銦膜電極傳感器，用循環伏安法對芳香族化合物2-氨基蒽進行了檢測。然而，以DNA作為分子識別主體對芳香胺化合物的檢測多是採用DNA修飾電極傳感器的方法，雖然這些DNA生物傳感器對芳香胺類汙染物具有較高的靈敏性，但其不足之處是電極製備時間較長，成本相對較高。研究發現，G-DNA是一類具有類過氧化物酶的催化活性的DNA片段，在雙氧水存在條件下G-DNA結構能催化雙氧水氧化魯米諾產生化學發光，具有響應時間快，專一性高等特點。Li等應用G-DNA類過氧化物酶的催化活性成功實現了對重金屬離子Ag+及Pb2+的檢測，Xiao等基於此機理實現了對目標DNA鏈的檢測，Liu等應用凝血酶及ATP等小分子可以誘導G-DNA結構的形成，亦成功實現了對其的檢測。到目前為止，應用G-DNA催化魯米諾化學發光對芳香胺類化合物的檢測還未見報導，與DNA修飾固體電極式傳感器方法相比，此法無需將DNA修飾到電極表面，大大縮短的周期，同時降低了成本，檢測的響應速度亦明顯提高。綜上所述，建立、完善和發 展芳香胺汙染物的分析方法是分析化學和環境化學的熱點研究課題，也是環境綜合治理的關鍵環節之一，具有重要的研究意義。同時開發一種新的高靈敏、低成本的檢測方法對完善現有檢測技術手段亦具有重要意義和較好的應用價值。
發明內容
本發明的目的在於提供一種基於光學DNA生物傳感器的快速檢測1，8- 二氨基萘的方法。本發明的技術方案如下一種基於光學DNA生物傳感器的1，8_ 二氨基萘的檢測方法，包括以下步驟I)將固體hairpin DNA用pH = 8. 0, 20mM Tris-NaClO4緩衝溶液溶解並稀釋到一定濃度，並用漩渦振蕩器混勻，靜置於室溫下6h，備用；2)取適量上述步驟I)配製的hairpin DNA溶液加到凍存管中，並向其中加入一定濃度的1，8_ 二氨基萘溶液，放置30min ；3)向上述步驟2)體系中加入一定濃度的K+及hemin溶液，放置Ih ；4)向上述步驟3)體系中加入一定濃度的H2O2及魯米諾溶液，進行化學發光測定。優選地,上述步驟I)中所述hairpin DNA雙鏈部分鹼基對數為9對。優選地,上述步驟2)中所述hairpin DNA濃度為lOOnM。優選地，上述步驟3)中所述K+濃度為10mM。優選地,上述步驟3)中所述hemin濃度為I ii M。優選地，上述步驟4)中所述H2O2濃度為300 u M0優選地，上述步驟4)中所述魯米諾濃度為50 u M0優選地，上述步驟1-4)中所述溶液pH值為8. O。與現有技術相比本專利技術具有以下優點I.本發明所採用的hairpin DNA序列為人工合成的DNA序列，可以對DNA序列進行優化；2.本發明所採用的hairpin DNA雙鏈「莖」部分的匹配鹼基對為9對，對1，8_ 二氨基萘檢測具有較高的靈敏性；3.本發明的光學DNA生物傳感技術是在溶液體系中進行測定，比固體電極式DNA生物傳感器實驗周期短，可靠性高，成本較低；4.本發明採用化學發光法進行測定，具有操作簡單、響應速度快、抗幹擾性強等特點。
附圖為不同體系測定的化學發光光譜TriS-NaClO4緩衝溶液體系(_)，含有G-DNA、魯米諾、H2O2, K+、hemin的Tris-NaClO4緩衝溶液體系，含有G-DNA、魯米諾、H2O2、K+、hemin 及 1,8- 二氨基萘的 Tris-NaClO4 緩衝溶液體系( )。
具體實施例方式以下實施實例對本發明做更詳細的描述，但所述實施不構成對本發明的限制。實施例I I)以pH = 8. 0的20mM Tris-NaClO4緩衝溶液將固體hairpin DNA溶解，用漩渦振蕩器混勻，並靜置於室溫下6h，在此條件下形成hairpin DNA結構；2)取適量上述步驟I)配製的hairpinDNA溶液加到凍存管中，並向其中加入一定濃度的1，8_ 二氨基萘溶液，放置30min，然後向上述體系中加入一定濃度的K+及hemin溶液，放置lh，在此條件下形成具有類過氧化物酶活性的G-DNA結構；實施例2控制測定體系hairpin DNA濃度為IOOnM, K+濃度為IOmM, hemin濃度為IiiM, H2O2濃度為300 u M，魯米諾濃度為50 u M，分別與用20mM Tris-NaClO4的(pH = 8. 0)緩衝溶液配製的不同濃度 I，8_ 二氛基蔡(6nmol/L、30nmol/L、150nmol/L、300nmol/L 及 600nmol/L)溶液作用，測定體系化學發光強度。上述不同濃度的I，8-二氨基萘溶液分別進行化學發光實驗，化學發光強度見表I。表I與不同濃度1，8_ 二氨基萘作用後化學發光強度
權利要求
1.一種基於光學DNA生物傳感器的1，8_二氨基萘的檢測方法，其特徵在於包括以下步驟 1)將固體hairpinDNA用pH = 8. O，20mM Tris-NaClO4緩衝溶液溶解並稀釋到一定濃度，並用漩渦振蕩器混勻，靜置於室溫下6h，備用； 2)取適量上述步驟I)配製的hairpinDNA溶液加到凍存管中，並向其中加入一定濃度的1，8_ 二氨基萘溶液，放置30min ； 3)向上述步驟2)體系中加入一定濃度的K+及hemin溶液，放置Ih； 4)向上述步驟3)體系中加入一定濃度的H2O2及魯米諾溶液，進行化學發光測定。
2.如權利要求I所述的基於光學DNA生物傳感器的1，8-二氨基萘的檢測方法，其特徵在於配製hairpinDNA溶液的Tris-NaClO4緩衝溶液濃度為20mM, pH = 8. O。
3.如權利要求I所述的基於光學DNA生物傳感器的1，8-二氨基萘的檢測方法，其特徵在於hairpin DNA與1,8-二氨基萘反應時間為30min,然後與K+及hemin溶液作用時間為lh。
4.如權利要求I所述的基於光學DNA生物傳感器的I，8-二氨基萘的檢測方法，其特徵在於hairpin DNA 濃度為 lOOnM，K+ 濃度為 10mM，hemin 濃度為 I y M, H2O2 濃度為 300 u M,魯米諾濃度為50 u M0
5.如權利要求I所述的基於光學DNA生物傳感器的1，8-二氨基萘的檢測方法，其特徵在於hairpin DNA的雙鏈「莖」部分匹配的鹼基為9對。
6.如權利要求I或2所述的基於光學DNA生物傳感器的1，8-二氨基萘的檢測方法，其特徵在於所使用的hairpin DNA序列中包含可以形成G-DNA序列片段。
7.如權利要求1-4所述的檢測方法，其特徵在於氨基萘為1，8_二氨基萘。
全文摘要
一種基於光學DNA生物傳感器的1,8-二氨基萘的檢測方法。本發明屬於分析化學檢測和DNA生物傳感器技術領域，涉及一種基於類過氧化物酶G-DNA催化雙氧水氧化魯米諾產生化學發光從而對1，8-二氨基萘進行檢測。具體的以含G-DNA結構的hairpin DNA為原料，hairpin DNA與1，8-二氨基萘作用後，並在K+及hemin作用下形成具有類過氧化物酶催化活性的G-DNA，通過催化雙氧水氧化魯米諾產生化學發光的變化從而實現對1，8-二氨基萘進行檢測。該光學DNA生物傳感器方法簡單方便，檢測周期短，響應時間快，穩定性好且具有高靈敏等優點。
文檔編號G01N21/76GK102621133SQ20121011143
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月17日 優先權日2012年4月17日
發明者劉冠男, 劉新會, 鞏文雯, 成登苗, 李曉宏, 梁剛, 陶莉 申請人:北京師範大學