一種快速同步檢測小麥黃花葉病毒和中國小麥花葉病毒的方法
2023-05-15 10:37:46 1
專利名稱：一種快速同步檢測小麥黃花葉病毒和中國小麥花葉病毒的方法
技術領域：
:本發明涉及一種快速同步檢測小麥黃花葉病毒和中國小麥花葉病毒的方法及其在農業上的應用，屬於農業科學技術領域。
背景技術：
:小麥是全世界最主要的糧食作物之一，其中麥類病毒病是影響其生產的主要因子之一。迄今為止由禾穀多黏菌(Polymyxa graminis)傳播的小麥類病毒主要有真菌傳杆狀病毒屬(Furovirus)的中國小麥花葉病毒(Chinese wheat mosaicvirus,CWMV)、小麥土傳花葉病毒(Soil-bome wheat mosaic virus, SBWMV)、土傳禾穀類花葉病毒(Soil-bomecereal mosaic virus, SBCMV)和大麥黃花葉病毒屬(Bymovirus)的小麥黃花葉病毒(Wheatyellow mosaic virus, WYMV)和小麥梭條斑花葉病毒(Wheat spindle streak mosaicvirus，WSSMV)。其中SBWMV主要分布於美國、法國、義大利和日本，SBCMV分布於法國、英國和美國，WSSMV分布於加拿大、美國和法國等歐美國家，在中國小麥上發生的主要是WYMV和CWMV,其中WYMV在日本亦有分布。WYMV 基因組由 2 條單鏈 RNA (single-stranded RNAs, ssRNA)組成，分別是RNAl (7636 nt)和RNA2 (3659 nt)。WYMV在中國的冬小麥種植區如江蘇、河南、陝西、四川、湖北、安徽、浙江和山東等地廣泛分布，一般造成小麥產量損失20% -70%，甚至絕收。CWMV是近年來在中國新發現的一種小麥病毒，該病毒基因組為RNAl(7147nt)和RNA2 (3569nt)組成。該病毒早期被誤認為是SBWMV，經全基因組測序發現CWMV和SBWMV的RNAl和RNA2核苷酸序列同源性分別為75%和63%，編碼蛋白胺基酸序列的同源性分別為84%和62%，兩者存在明顯差異。在中國目前主要分布於山東、江蘇，常與WYMV複合感染。目前對WYMV和CWMV主要採用血清學方法和分子生物學方法對兩種病毒單獨檢測，如型怡明用間接酶聯和直接DAS酶聯法檢測WYMV，張宗英利用RT-PCR、ELISA和Westernblotting等檢測河南駐馬店小麥樣上的WYMV，尚巧霞利用ELISA+RT-PCR方法對四川小麥中的WYMV進行檢測，耿波用雙抗夾心方法檢測WYMV，劉曉軍初步建立CWMV的RT-LAMP檢測體系。為簡化試驗步驟，近年來在植物上利用多重RT-PCR同時檢測多種病毒的方法發展較快，如嶽紅妮成功從複合侵染的小麥材料中檢測大麥條紋花葉病毒(Barleystripe mosaicvirus, BSMV)、大麥黃矮病毒 PAV 株系(Barley yellow dwarf virus, BYDV-PAV)、WYMV 及小麥藍矮植原體(Wheat blue dwarf，WBD)，Mahua Deb建立一種多重RT-PCR同時檢測大麥小麥黃矮病毒(Barley and Cereal ye I lowdwarf virus, B/CYDV) 5 個株系、WSSMV、SBWMV和小麥線條花葉病毒(Wheatstreak mosaic virus,WSMV)8種麥類病毒,而從複合侵染樣品中同時檢測WYMV和CWMV兩種病毒尚未有報導。WYMV和CWMV侵染小麥的症狀主要為葉片黃化或花葉，植株矮化，進一步發展直至枯萎死亡，均由禾穀多黏菌傳播，其生物學特性十分相似，難以從經驗觀察的角度有效區分，且CWMV常與WYMV複合侵染，增加了病害診斷的難度。為了能快速準確診病害類型， 本研究試圖建立一種能從小麥病葉中同步檢測WYMV和CWMV的方法，以方便快捷診斷田間小麥的侵染狀況，為病害科學防治提供依據
發明內容
:本發明提供了一種快速同步檢測小麥黃花葉病毒和中國小麥花葉病毒的方法。許多學者利用傳統生物學接種鑑定、分子生物學和血清學方法單獨檢測小麥黃花葉病毒(WYMV)和中國小麥花葉病毒(CWMV)，本發明是首次利用多重RT-RCR從複合侵染樣品中同時檢測WYMV和CWMV兩種病毒。本發明所提供的一種快速同步檢測小麥黃花葉病毒和中國小麥花葉病毒的方法，是通過以下方法獲得的:1)根據NCBI已報導的小麥黃花葉病毒和中國小麥花葉病毒核苷酸序列,通過軟體 Primer Premier 5.0 設計引物；2) Trizol reagent 法提取植株總 RNA ;3)以CWWY-R2為引物，參照M-MuLV反轉錄酶使用說明反轉錄合成cDNA ； 4)優化多重RT-PCR反應體系(dNTP濃度、Taq DNA聚合酶濃度和Mg2+濃度)和反應條件(退火溫度、循環次數和延伸時間)；5)在最佳反應參數條件下，以江蘇省農科院植保所病害室保存的WYMV和CWMV提純病毒為陽性對照驗證這一方法的準確性。本發明提供的引物序列如下:
權利要求
1.一種快速同步檢測小麥黃花葉病毒和中國小麥花葉病毒的方法，其特徵在於:利用簡併引物,在優化的多重RT-PCR反應系統中同時檢測這兩種病毒。
.2.1中所述的簡併引物是指:
全文摘要
本發明公開了一種快速同步檢測小麥黃花葉病毒和中國小麥花葉病毒的方法，根據兩種病毒基因序列的異同點設計了三條引物反向引物CWWY-R2為5′-GGTTCCMGTTATCGTACT-3′。正向引物CW1-F25′-GGAAGGGATGCCATACAACT-3′，WY1-F25′-ACCCTACAAACAAACTCTGC-3′，植物總RNA為模板，以CWWY-R2為引物，反轉錄合成cDNA。然後通過優化建立了一種同步檢測兩種病毒的反應體系cDNA1.6μL、引物(10μmol/L)各0.4μL、10×PCR Buffer(不含Mg2+)2μL、dNTPs(10mmol/L each)0.4μL、Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.8μL、MgCl2(25mmol)0.8μL、ddH2O 13.2μL合計20μL；PCR反應條件94℃預變性5min、94℃50s、50℃50s、72℃90s共30個循環，72℃延伸10min。PCR擴增預期目的片段分別為WYMV 508bp、CWMV 918bp。利用該方法對江蘇高郵、揚州和大豐的樣本進行檢測，分別為WYMV、WYMV、CWMV單一侵染。
文檔編號C12Q1/68GK103103288SQ20131000043
公開日2013年5月15日 申請日期2013年1月5日 優先權日2013年1月5日
發明者繆倩, 季英華, 任春梅, 魏利輝, 周益軍, 程兆榜 申請人:江蘇省農業科學院