辣根過氧化物酶標記玉米赤黴烯酮的合成工藝的製作方法

2023-05-15 07:09:46 1

專利名稱：辣根過氧化物酶標記玉米赤黴烯酮的合成工藝的製作方法
技術領域：
本發明涉及酶標試劑的合成工藝領域，更具體地說，涉及一種辣根過氧化物酶標 記玉米赤黴烯酮的合成工藝。
背景技術：
玉米赤黴烯酮(zearalenone，ZEN)又稱F2毒素，是由鐮刀菌產生的一種具有 類雌激素作用的真菌二次代謝產物，屬於2，4 一二羥基苯甲酸內酯類化合物。化學名為 6-(10-羥基-6氧基-十一-碳烯基)β -雷鎖酸內酯，廣泛存在於黴變的玉米、高粱、小麥 等穀類作物和奶中。玉米赤黴烯酮具有很強的雌性激素作用，如果攝入被玉米赤黴烯酮汙染的飼料可 引起豬、大鼠、小鼠、家禽等動物的雌激素過多症和嚴重的生殖道症狀和不孕症。同時玉米 赤黴烯酮被證明還具有還具有免疫毒性、基因毒性、細胞毒性等，而且人們懷疑玉米赤黴烯 酮的雌激素作用導致兒童中產生早期青春綜合症的原因。因玉米赤黴烯酮具有熱穩定性 (在100-125°C還可保持穩定)且不溶於水，玉米赤黴烯酮的食源性危害受到越來越多的關 注。到2003年，全世界已有19個國家制訂了食品中玉米赤黴烯酮的限量標準，而且歐盟於 2005年制定了食品中玉米赤黴烯酮統一限量標。歐盟中規定未加工穀物，玉米加工品中玉 米赤黴烯酮含量必須低於100 μ g/kg，而嬰幼兒食品中的含量不得超過20 μ g/kg，其它食 品中限量在50-400 μ g/kg之間。每天人體攝入玉米赤黴烯酮量不得超過0. 05 μ g/kg。我 國尚未建立食品中玉米赤黴烯酮的國家標準檢測方法，迄今為止也沒有開展過全國性的糧 食中玉米赤黴烯酮汙染狀況調查，對消費者健康造成威脅，因此為保護消費者健康及我國 的糧食貿易，迫切需要建立測定一種靈敏的檢測玉米赤黴烯酮的方法。現今檢測玉米赤黴烯酮常用的方法有酶聯免疫吸附法(ELISA)、薄層色譜法、免 疫親和柱-HPLC法、質譜技術、氣相色譜、毛細管電泳以及其它基於抗體抗原免疫反應的方 法。但這幾種檢測方法均存在一些缺陷，而近年發展迅速的化學發光免疫分析法結合 了免疫反應的高特異性和化學發光反應的高靈敏性，儀器簡單，成本低廉得到了越來越多 的關注。但目前國內各檢測中心均採用的是國外昂貴的進口試劑盒及相應檢測系統，其中 辣根過氧化酶標記的玉米赤黴烯酮(ZEN-HRP)組分是該化學發光免疫分析試劑盒的關鍵 組分。但因辣根過氧化酶標記玉米赤黴烯酮的製備技術一直為該試劑盒廠家作為技術秘密 保護，現國內外還未見有相關報導。

發明內容
為了彌補化學發光免疫分析領域中檢測玉米赤黴烯酮試劑盒的關鍵組分辣根過 氧化物酶標記物還未有公開製備工藝的不足，本發明提供了一種簡便易行、成本低廉的辣 根過氧化物酶(HRP)標記玉米赤黴烯酮的合成工藝。本發明提供了 一種辣根過氧化物酶標記玉米赤黴烯酮的合成工藝，其中，所述工藝是通過羧基化玉米赤黴烯酮得到羧基化產物後，再與辣根過氧化物酶進行縮合反應得到 所述辣根過氧化物酶標記的玉米赤黴烯酮。優選地，所述羧基化玉米赤黴烯酮為玉米赤黴烯酮與鹽酸羧甲基羥胺在極性有機 溶劑中進行反應。優選地，所述極性有機溶劑為吡啶、二甲基亞碸。優選地，所述反應中鹽酸羧甲基羥胺是過量的；所述極性有機溶劑的用量為每毫 克玉米赤黴烯酮用0. 4 0. 6毫升。優選地，所述羧基化玉米赤黴烯酮得到羧基化產物還包括在玉米赤黴烯酮與鹽酸 羧甲基羥胺反應後，終止反應並分別用苯、乙酸乙酯進行萃取的步驟。優選地，所述羧基化玉米赤黴烯酮得到羧基化產物的具體過程為將玉米赤黴烯 酮和鹽酸羧甲基羥胺溶於吡啶中，其中每毫克玉米赤黴烯酮用0.5毫升吡啶，室溫攪拌過 夜，然後加入等反應體積的蒸餾水，調pH至8 9，振蕩使溶液澄清，用苯提取後，調水層pH 至酸性用乙酸乙酯萃取，乾燥得到羧基化產物即羧基化的玉米赤黴烯酮。在得到羧基化產物即羧基化的玉米赤黴烯酮後，可用常規的薄板層析法進行純化 鑑定。優選地，所述縮合反應為羧基化產物與琥珀醯亞胺、碳二亞胺反應後，將其滴加到 辣根過氧化物酶的鹼性溶液中反應。本步反應中因使用了琥珀醯亞胺，將常規的一步縮合 反應改進為兩步，碳二亞胺通過琥珀醯亞胺與羧基化產物相結合後，再與辣根過氧化物酶 反應，有效避免了在一步反應中酶之間的交聯反應，從而有效提高了辣根過氧化物酶標記 的有效性。優選地，所述縮合反應在二甲基甲醯胺(DMF)或乙醇中進行。該反應環境也可選 擇其他同時對水和有機溶劑均有親和力的極性有機溶劑。優選地，所述羧基化產物與辣根過氧化物酶的反應摩爾比為1.5 3 1。優選地，所述縮合反應的具體過程為將羧基化產物、琥珀醯亞胺以及碳二亞胺， 溶於二甲基甲醯胺中，室溫攪拌反應lh，將反應後的液體緩慢滴加到辣根過氧化物酶的 NaHCO3溶液中，其中羧基化產物與辣根過氧化物酶的反應摩爾比為2 1，室溫攪拌，透析 過夜，得產物辣根過氧化物酶標記玉米赤黴烯酮。本發明提供的辣根過氧化物酶標記玉米赤黴烯酮的合成工藝，具有以下有益效 果1、解決了化學發光免疫分析領域中檢測玉米赤黴烯酮試劑盒的關鍵組分辣根過 氧化物酶標記物現還未有公開製備工藝的問題因玉米赤黴烯酮的化學結構中缺少如胺基 或羧基等反應基，要將其連接到蛋白質上，必須通過化學方法，對其結構進行修飾，引入一 個活性基團，本發明合成工藝對玉米赤黴烯酮的化學結構進行了改進，在其分子中引入了 一可與蛋白質相結合的羧基，從而有效解決了該難題；2、本發明辣根過氧化物酶標記玉米赤黴烯酮的合成工藝合成的酶標記物效率較 高在該合成工藝進行酶標記反應步驟(即縮合反應)時，因使用了琥珀醯亞胺，將常規的 一步縮合反應改進為兩步，碳二亞胺通過琥珀醯亞胺與羧基化產物相結合後，再與辣根過 氧化物酶反應，有效避免了在一步反應中酶自身間的交聯反應，酶活性增高，從而有效提高 了辣根過氧化物酶標記的有效性。


圖1是實施例3合成的辣根過氧化物酶標記的玉米赤黴烯酮與Beacom公司購買 的辣根過氧化物酶標記的玉米赤黴烯酮分別應用於玉米赤黴烯酮化學發光免疫分析試劑 盒中的檢測結果比較圖。
具體實施例方式以下所舉實施例只用於解釋本發明，並非用於限定本發明的保護範圍。下述為本發明涉及到的試劑及其來源玉米赤黴烯酮GEN)、辣根過氧化物酶(HRP)、N, N- 二甲基甲醯胺(DMF)均購自 Sigma-Aldrich公司(聖路易斯，美國)；鹽酸羧甲基羥胺(CMO)購自Aldrich公司(密爾沃基，威斯康星洲，美國)。N-琥珀醯亞胺(NHS)及碳二亞胺(EDC)則購自pierce公司(羅克弗德，美國)。實施例1辣根過氧化物酶標記玉米赤黴烯酮的製備稱取0. 5mg ZEN和4. Omg鹽酸羧甲基羥胺，溶於0. 2ml吡啶，室溫下攪拌Mh。反 應溶液中加入0. 2ml蒸餾水，用0. 2M NaOH調節pH至8. 5，振蕩使溶液澄清。用苯(0. 2ml) 提取3次，水層用2M HCl調節pH至3，用乙酸乙酯(0. 5ml)萃取3次，真空抽乾，得到的羧 基化產物為羧基化的玉米赤黴烯酮。稱取0. 2mg羧基化的玉米赤黴烯酮，0. 4mg琥珀醯亞胺以及Img碳二亞胺，溶於 0. 7ml DMF,室溫下攪拌反應lh。將此反應液緩慢滴加到含13. 6mg HRP的0. IM NaHCO3溶液 中，室溫下攪拌2h.用0.02M PBS透析過夜，所得產物(ZEN-HRP)用等體積甘油保護，_20°C 以下保存。實施例2辣根過氧化物酶標記玉米赤黴烯酮的製備稱取0. 5mg ZEN和4. 3mg鹽酸羧甲基羥胺，溶於0.3ml 二甲基亞碸，室溫下攪拌 24h0反應溶液中加入0.3ml蒸餾水，用0.2M NaOH調節pH至9，振蕩使溶液澄清。用苯 (0. 3ml)提取3次，水層用2M HCl調節pH至4，用乙酸乙酯(0. 6ml)萃取3次，真空抽乾， 得到的羧基化產物為羧基化的玉米赤黴烯酮。稱取0. 2mg羧基化的玉米赤黴烯酮，0. 4mg琥珀醯亞胺以及Img碳二亞胺，溶於 0. 7ml乙醇，室溫下攪拌反應lh。將此反應液緩慢滴加到含6. 8mg HRP的0. IM NaHCO3溶液 中，室溫下攪拌2h.用0.02M PBS透析過夜，所得產物(ZEN-HRP)用等體積甘油保護，_20°C 以下保存。實施例3辣根過氧化物酶標記玉米赤黴烯酮的製備稱取0. 4mg ZEN和3. 2mg鹽酸羧甲基羥胺，溶於0. 2ml吡啶，室溫下攪拌Mh。反 應溶液中加入0. 2ml蒸餾水，用0. 2M NaOH調節pH至8，振蕩使溶液澄清。用苯(0. 2ml)提 取3次，水層用2M HCl調節pH至3，用乙酸乙酯(0. 5ml)萃取3次，真空抽乾，得到的羧基 化產物為羧基化的玉米赤黴烯酮。稱取0. 2mg羧基化的玉米赤黴烯酮，0. 4mg琥珀醯亞胺以及Img碳二亞胺，溶於 0.7ml DMF，室溫下攪拌反應lh。將此反應液緩慢滴加到含10. 2mg HRP的0. IM NaHC03溶液 中，室溫下攪拌2h。用0. 02M PBS透析過夜，所得產物(ZEN-HRP)用等體積甘油保護，_20°C以下保存。實施例4辣根過氧化物酶標記的玉米赤黴烯酮的應用實驗-將實施例3製備得到的辣根過氧化物酶標記的玉米赤黴烯酮(ZEN-HRP)與從 Beacom公司購買的^N-HRP應用於檢測^N的化學發光免疫分析試劑盒進行對比實驗，結 果如下1、對所製備的兩種試劑盒進行了方法學鑑定，結果如下表1試劑盒的技術指標檢測對比結果檢驗項目檢驗標準進口產品試劑盒本發明檢驗結果檢驗結果
權利要求
1.一種辣根過氧化物酶標記玉米赤黴烯酮的合成工藝，其特徵在於，所述工藝是通過 羧基化玉米赤黴烯酮得到羧基化產物後，再與辣根過氧化物酶進行縮合反應得到所述辣根 過氧化物酶標記的玉米赤黴烯酮。
2.根據權利要求1所述的合成工藝，其特徵在於，所述羧基化玉米赤黴烯酮為玉米赤 黴烯酮與鹽酸羧甲基羥胺在極性有機溶劑中進行反應。
3.根據權利要求2所述的合成工藝，其特徵在於，所述極性有機溶劑為吡啶、二甲基亞碸。
4.根據權利要求2所述的合成工藝，其特徵在於，所述反應中鹽酸羧甲基羥胺是過量 的；所述極性有機溶劑的用量為每毫克玉米赤黴烯酮用0. 4 0. 6毫升。
5.根據權利要求2所述的合成工藝，其特徵在於，所述羧基化玉米赤黴烯酮得到羧基 化產物還包括在玉米赤黴烯酮與鹽酸羧甲基羥胺反應後，終止反應並分別用苯、乙酸乙酯 進行 萃取的步驟。
6.根據權利要求1所述的合成工藝，其特徵在於，所述羧基化玉米赤黴烯酮得到羧基 化產物的具體過程為將玉米赤黴烯酮和鹽酸羧甲基羥胺溶於吡啶中，其中每毫克玉米赤 黴烯酮用0. 5毫升吡啶，室溫攪拌過夜，然後加入等反應體積的蒸餾水，調PH至8 9，振蕩 使溶液澄清，用苯提取後，調水層PH至酸性用乙酸乙酯萃取，乾燥得到羧基化產物即羧基 化的玉米赤黴烯酮。
7.根據權利要求1 6任一項所述的合成工藝，其特徵在於，所述縮合反應為羧基化產 物與琥珀醯亞胺、碳二亞胺反應後，將其滴加到辣根過氧化物酶的鹼性溶液中反應。
8.根據權利要求7所述的合成工藝，其特徵在於，所述縮合反應在二甲基甲醯胺或乙 醇中進行。
9.根據權利要求7所述的合成工藝，其特徵在於，所述羧基化產物與辣根過氧化物酶 的反應摩爾比為1. 5 3 1。
10.根據權利要求1或8 9任一項所述的合成工藝，其特徵在於，所述縮合反應的具 體過程為將羧基化產物、琥珀醯亞胺以及碳二亞胺，溶於二甲基甲醯胺中，室溫攪拌反應 lh，將反應後的液體緩慢滴加到辣根過氧化物酶的NaHCO3溶液中，其中羧基化產物與辣根 過氧化物酶的反應摩爾比為2 1，室溫攪拌，透析過夜，得產物辣根過氧化物酶標記玉米 赤黴烯酮。
全文摘要
本發明公開了一種辣根過氧化物酶標記玉米赤黴烯酮的合成工藝，所述合成工藝是通過羧基化玉米赤黴烯酮得到羧基化產物後，再與辣根過氧化物酶進行縮合反應得到所述辣根過氧化物酶標記的玉米赤黴烯酮。因化學發光免疫分析領域中檢測玉米赤黴烯酮試劑盒的關鍵組分辣根過氧化物酶標記物的製備工藝一直是一個難以攻克的難題，因此本發明提供的簡單易行、成本低廉的辣根過氧化物酶標記物合成工藝有很好的市場應用前景。
文檔編號C12P7/62GK102051389SQ201010536029
公開日2011年5月11日 申請日期2010年11月9日 優先權日2010年11月9日
發明者唐寶軍, 柴淑芳, 胡國茂 申請人:北京科美東雅生物技術有限公司