Braf基因突變檢測特異性引物和液相晶片的製作方法
2023-05-16 00:50:41 1
專利名稱：Braf基因突變檢測特異性引物和液相晶片的製作方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學領域，涉及醫學和生物技術，具體的是涉及BRAF基因突變檢測特異性引物和液相晶片。
背景技術：
IE^I 1 ^ ! !^! ] !^ Bl (v-taf mourine sarcoma viral oncogene homolog Bi, BRAF)基因，定位於人染色體7q34，其具有功能的編碼區由2510對鹼基組成， 編碼MAPK通路中的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，該酶將信號從Ras轉導至MEK1/2，從而參與調控細胞內多種生物學事件。研究表明，BRAF主要有兩種突變類型①11%的突變位於外顯子11上的甘氨酸環，如G463、G465、G468等點突變；②89%的突變發生於外顯子15上的激活區，其中約92%位於第1799位核苷酸上(T突變為A)，導致其編碼的穀氨酸由纈氨酸取代(V600E)。目前，已經建立的BRAF基因突變檢測技術，主要是PCR-測序法和實時螢光定量 PCR檢測技術。PCR-測序法具有能夠確定突變範圍和類型的優點，是目前應用較為廣泛的檢測方法，但測序法的靈敏度只有20% _25%，遠遠不能滿足實際應用的需要，尤其是對於異質性的腫瘤體細胞突變，低靈敏度將導致大量的漏檢。同時，測序法檢測操作複雜，時效性差，對於要求高時效性和高靈敏度實際應用檢測，測序法的局限性早已凸顯。而實時螢光定量PCR檢測技術，其檢測效率高，時效性強，但其高居不下的假陽性率也為實際應用所詬病。基於上述檢測技術存在的問題，申請人前期成功開發的「BRAF基因突變的檢測探針、液相晶片及其檢測方法」(申請號200910037357. 6)檢測方法操作簡單，通過酶切富集排除了大量野生型序列造成的幹擾，結果特異性好，靈敏度高，準確度達99 %以上，但該方法涉及兩輪PCR操作，較易造成汙染，且雜交檢測步驟探針較為接近(只有突變位點不同)，不便於多種基因突變位點並行檢測。
發明內容
本發明的目的之一是提供BRAF基因突變檢測液相晶片。該液相晶片可用於檢測 BRAF基因的正常基因型和V600E突變型。實現上述目的的技術方案如下一種BRAF基因突變檢測液相晶片，主要包括有，(A)針對BRAF的V600E突變位點，分別設計的野生型和突變型的一對ASPE引物 每種ASPE弓丨物由5』端的tag序列和3』端針對目的基因突變位點的特異性引物組成，所述 tag序列選自SEQID NO. 25-SEQ ID NO. 30中的任2種序列；所述特異性引物是來源於SEQ ID NO. 1和SEQ IDN0. 2或其反向互補序列SEQ ID N0. 13和SEQ ID N0. 14中的鹼基序列， 且特異性引物的3』端的最後3位鹼基中的一個鹼基為突變位點，所述特異性引物的Tm值在52 58°C之間；(B)分別包被有特異的anti-tag序列的、具有不同顏色編碼的2種微球，所述anti-tag序列選自SEQ ID NO. 31 SEQ ID NO. 36中的序列，且所述anti-tag序列能相應地與(A)中所選的tag序列互補配對；(C)用於擴增具有V600E突變位點的BRAF基因目標序列的擴增引物。優選地，所述擴增引物為SEQ ID NO. 37和SEQ ID NO. 38。優選地，所述野生型的特異性引物為SEQ ID NO. 3 SEQ ID N0. 7中的一條，所述突變型的特異性引物為SEQ ID N0. 8 SEQ ID N0. 12中的一條；或所述野生型的特異性引物為SEQID N0. 15 SEQ ID N0. 19中的一條，所述突變型的特異性引物為SEQ ID N0. 20 SEQ IDN0. 24 中的一條。優選地，所述anti-tag序列與微球連接中間還設有間隔臂序列；所述間隔臂序列為5-10個T。本發明的另一目的是提供一種用於BRAF基因突變檢測的特異性引物。具體技術方案如下用於BRAF基因V600E突變檢測的特異性引物，所述特異性引物是來源於SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2或其反向互補序列SEQ ID N0. 13和SEQ ID N0. 14中的鹼基序列，且特異性引物的3』端的最後3位鹼基中的一個鹼基為突變位點，所述特異性引物的Tm值在 52 58°C之間。本發明的主要優點在於1.本發明所製備的BRAF基因突變檢測液相晶片具有非常好的信號-噪聲比，並且所設計的探針以及anti-tag序列之間基本上不存在交叉反應，可實現多個突變位點的並行檢測。2.本發明所設計的針對野生型和突變型的特異性ASPE引物，能夠在均一的反應條件下進行雜交反應，探針之間不存在非特異性結合，檢測特異性及準確性高，檢測結果與測序法吻合率達到100%。3、本發明檢測體系效果穩定可靠，特異性引物、Tag序列、擴增引物等組合使用使液相晶片和檢測方法形成一個檢測效果完好的系統。
具體實施例方式實施例IBRAF基因突變檢測液相晶片，主要包括有一、ASPE 引物針對BRAF的V600E突變位點，分別設計野生型和突變型ASPE引物對。BRAF基因突變檢測的ASPE引物的設計要點為ASPE引物由「Tag+特異性引物序列」組成。其中，5』端為根據BRAF基因突變檢測所設計的Tag序列，所設計的Tag序列在反應體系能最大限度的避免ASPE引物可能形成的二級結構，且Tag序列與Tag序列，Tag序列與特異性引物序列之間不發生交叉反應。Tag 序列和特異性引物序列形成完整的ASPE引物，並使所有的ASPE引物能夠在一個均一的反應體系中同步反應(即同一反應的緩衝環境，同一反應溫度等)，完成並行檢測。所設計的 Tag序列具體如表5。3』端為根據BRAF基因突變檢測所設計的特異性引物序列，所述特異性引物的Tm值在52 58°C之間；其中針對V600E突變型的特異性引物序列，其3』端的最後3位鹼基中的一個鹼基應為突變位點；所述V600E野生型的特異性引物序列3』端的最後3個鹼基應包含V600E位點。所述Tm值的計算方式為Tm = (G+C) X 4+ (A+T) X 2_4。表IBRAF基因突變檢測特異性引物的來源序列之一
權利要求
1.一種BRAF基因突變檢測液相晶片，其特徵是，主要包括有，(A)針對BRAF的V600E突變位點，分別設計的野生型和突變型ASPE引物對每種ASPE 引物由5』端的tag序列和3』端針對目的基因突變位點的特異性引物組成，所述tag序列選自SEQ IDN0. 25 SEQ ID NO. 30中的任2條序列；所述特異性引物是來源於SEQ ID NO. 1 和SEQ ID NO. 2或其反向互補序列中的鹼基序列，且特異性引物的3』端的最後3位鹼基中的一個鹼基為突變位點，所述特異性引物的Tm值在52 58°C之間；(B)分別包被有特異的anti-tag序列的、具有不同顏色編碼的2種微球，所述 anti-tag序列選自SEQ ID NO. 31 SEQ ID NO. 36中的序列，且所述anti-tag序列能相應地與(A)中所選的tag序列互補配對；(C)用於擴增具有V600E突變位點的BRAF基因目標序列的擴增引物。
2.根據權利要求1所述的BRAF基因突變檢測液相晶片，其特徵是，所述擴增引物為SEQ IDN0. 37 和 SEQ ID NO. 38。
3.根據權利要求1所述的BRAF基因突變檢測液相晶片，其特徵是，所述野生型的特異性引物為SEQ ID NO. 3 SEQ ID NO. 7中的一條，所述突變型的特異性引物為SEQ ID NO. 8 SEQID NO. 12中的一條；或所述野生型的特異性引物為SEQ ID NO. 15 SEQ ID NO. 19中的一條，所述突變型的特異性引物為SEQ ID NO. 20 SEQ ID NO. 24中的一條。
4.根據權利要求1-3任一所述的BRAF基因突變檢測液相晶片，其特徵是，所述tag序列為 SEQID NO. 25 和 SEQ ID NO. 26。
5.根據權利要求1-3任一所述的BRAF基因突變檢測液相晶片，其特徵是，所述 anti-tag序列與微球連接中間還設有間隔臂序列。
6.根據權利要求5任一所述的BRAF基因突變檢測液相晶片，其特徵是，所述間隔臂序列為5-10個T。
7.用於BRAF基因V600E突變檢測的特異性引物，其特徵是，所述特異性引物是來源於 SEQID NO. 1和SEQ ID NO. 2或其反向互補序列中的鹼基序列，且特異性引物的3，端的最後 3位鹼基中的一個鹼基為突變位點，所述特異性引物的Tm值在52 58°C之間。
全文摘要
本發明公開了一種BRAF基因突變檢測液相晶片，主要包括有，(A)針對BRAF的V600E突變位點，分別設計的野生型和突變型ASPE引物對每種ASPE引物由5』端的tag序列和3』端針對目的基因突變位點的特異性引物組成，特異性引物的3』端的最後3位鹼基中的一個鹼基為突變位點，所述特異性引物的Tm值在52～58℃之間；分別包被有特異的anti-tag序列的、具有不同顏色編碼的2種微球所述anti-tag序列能相應地與(A)中所選的tag序列互補配對；用於擴增具有V600E突變位點的BRAF基因目標序列的擴增引物。本發明所製備的BRAF基因突變檢測液相晶片具有非常好的信號-噪聲比，並且所設計的探針以及anti-tag序列之間基本上不存在交叉反應。
文檔編號C12N15/11GK102234684SQ201010160760
公開日2011年11月9日 申請日期2010年4月23日 優先權日2010年4月23日
發明者餘剛, 李國強, 秦會娟, 許嘉森 申請人:廣州益善生物技術有限公司