一株體外高效拮抗稻瘟病菌的水稻內生放線菌的製作方法

2023-05-16 20:15:06

一株體外高效拮抗稻瘟病菌的水稻內生放線菌的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一株體外高效拮抗稻瘟病菌的水稻內生放線菌Streptomycessp.OsiSh-2，CGMCCNo.8716，該菌具有體外高效拮抗稻瘟病菌能力，能對至少5種不同生理小種的梨孢黴菌有拮抗作用；能夠分泌幾丁質酶及纖維素酶；具有較強的生長能力，易於培養。在生物防治水稻稻瘟病、開發新藥物等方面具有較大的開發潛力。
【專利說明】一株體外高效拮抗稻瘟病菌的水稻內生放線菌

【技術領域】
[0001] 本發明涉及微生物領域，具體涉及從水稻中分離獲得一株具有體外高效拮抗稻瘟 病菌能力的水稻內生放線菌。

【背景技術】
[0002] 水稻是世界上最重要的農作物之一。包括大多數發展中國家在內，全世界約40 % 人口的主要食物來自水稻。但是，水稻的高產和穩產會受到一些病害的影響，其中以稻瘟病 尤為嚴重。該病在全球85個有水稻種植的國家和地區均有發生，每年由於水稻稻瘟病導致 的損失約佔總產量的10%?30%。稻癌病由真菌梨孢黴oiTzae)引起，該 病菌能夠侵染水稻的大多數組織。傳統的稻瘟病控制主要依靠噴灑化學農藥和選育新的抗 病品種。由於稻瘟病原菌遺傳複雜、致病多樣和極易變異等特點，新抗病品種需辛苦培育， 且常在推廣數年內失去抗性，這便降低了該方法控制稻瘟病的效果。化學農藥是目前抗稻 瘟病的一種有效措施，但是大量和長期使用化學農藥，既增加生產成本，也易導致病原菌產 生抗藥性而降低防治效果，同時造成環境汙染和破壞生態平衡，給人類健康及環境安全帶 來嚴重隱患。因此，越來越多的科學家希望通過生物農藥來控制和解決稻瘟病。
[0003] 內生菌是一種能夠在植物體內存活而不對寄主植物具有明顯危害的微生物，內生 菌製劑可以減少由于田間操作、氣候變化等因素對其生長、繁殖和防治效果的影響，是一種 天然的微生物活體農藥。以抗稻瘟病菌的內生菌活體作為農藥製劑，不僅能以其更安全的 生物代謝物避免化學農藥產生的隱患，還可以利用種類豐富的內生菌與病原菌之間的拮抗 對應關係，減少稻瘟病病菌多樣、易變異帶來的影響。
[0004] 從水稻中可以分離、篩選出一些具有抑制稻瘟病菌的內生菌，這些內生菌或是分 泌某些代謝物、或是提高水稻抵抗力來抵抗稻瘟病菌。目前所分離得到的抗病性內生菌大 多是易培養的細菌和真菌類群，而作為難分離的內生放線菌則報導較少。放線菌又是抗生 素的主要來源，目前已經發現的抗生素有近6000種，其中4000多種由放線菌產生。作為一 類能產生多種有益代謝產物的微生物，放線菌顯然具有很高的經濟價值。


【發明內容】

[0005] 本發明提供了一種具有防治稻瘟病潛力的水稻內生放線菌，該菌能對至少5種不 同生理小種的梨孢黴菌(稻瘟病的致病真菌）有拮抗作用，液體培養在第7天時菌液抑制稻 瘟病的能力最強。該菌株分離自健康水稻鞘部，其具有較強的生長能力，易於培養。 發明所得菌株通過結合菌落菌體形態特徵和基於細菌16S rRNA基因序列的系統發 育分析，鑑定為 屬，命名為 0siSh-2。該菌株已於 2014 年 1月10日由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)所保藏(保藏地址 是：北京市朝陽區北辰西路1號院3號)，保藏號為CGMCC No. 8716,分類命名為鏈黴菌 OsiSh-2,經檢測存活。 OsiSh-2菌株的分離、純化和篩選過程為：將秈稻穀梅4號洗去泥土後進行植物表面消 毒，乾燥後置於內生菌分離培養基(MS)上，27°C培養，待內生放線菌長出，再結合劃線分離 法在固體PDA平板上進行分離，直至獲得其純培養物。將分離得到的菌株與稻瘟病致病菌 梨孢黴同時接種到PDA固體平板上，放入黴菌培養箱中28°C倒置培養，每天觀察，篩選拮抗 真菌效果最明顯的菌株，即從水稻鞘部分離得到的高效拮抗梨孢黴菌株OsiSh-2。
[0006] 稻瘟病菌的細胞壁主要成分是幾丁質和纖維素，用幾丁質培養基和纖維素培養基 對該放線菌能否分泌幾丁質酶及纖維素酶進行了定性檢測。該放線菌在28°C恆溫培養條件 下能產生幾丁質酶和纖維素酶，表明OsiSh-2可能通過分泌幾丁質酶和纖維素酶，溶解殺 死真菌性病害。 本發明所述菌株的有益效果為：菌株作為健康水稻的內生菌，在28°C、PDA培養基培養 條件下能有效抑制稻瘟病病菌的生長；在ISP II液體培養基中，28°C，150r/min液體震蕩培 養條件下培養7天後，取出100 μ L菌液，加入到混合有梨孢黴孢子的PDA培養基中培養， 有明顯的抑制稻瘟病生長的抑菌圈出現；能對至少5種不同生理小種（來自於湖南農業大 學和湖南亞華種子有限公司）的梨孢黴菌有拮抗作用；本菌株具有較強的生長能力，易於培 養；能夠分泌幾丁質酶及纖維素酶。該菌的上述特徵表明其在生物防治水稻稻瘟病、開發新 藥物等方面具有較大的開發潛力。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0007] 圖1 :本發明菌株的菌落形態圖，a. OsiSh-2培養5天；b. OsiSh-2生長25天後 菌體變為黑色的培養圖； 圖2 :本發明菌株的顯微觀察圖； 圖3 :本發明菌株的進化樹； 圖4 :本發明菌株液體培養生長情況圖； 圖5 :本發明菌株在固體培養基上對稻瘟病菌RB3的抑制情況，a. OsiSh-2培養5天； b. OsiSh-2生長25天後菌體變為黑色的培養圖； 圖6 :本發明菌株培養7天的菌液對稻瘟病菌RB3的抑制情況，a. OsiSh-2培養5天； b. OsiSh-2生長25天後菌體變為黑色的培養圖； 圖7 :本發明菌株對5種不同生理小種的稻瘟病梨孢黴菌的抑制情況，a. - e.稻瘟病 菌對照；f. - j. 0siSh-2對5種不同生理小種的梨孢黴菌的抑制； 圖8 :本發明菌株分泌幾丁質酶的定性實驗，a. OsiSh-2分泌幾丁質酶的定性實驗結 果；b.空白對照； 圖9 :本發明菌株分泌纖維素酶的定性實驗，a. OsiSh-2分泌纖維素酶的定性實驗結 果；b.空白對照；

【具體實施方式】： 實施例1 :0siSh-2菌株的分離 OsiSh-2菌株的分離、純化和篩選過程為：將秈稻穀梅4號洗去泥土後進行植物表面消 毒，乾燥後，按照根、莖、葉鞘、葉片四種組織分割，每種組織都切割為lcm左右的小段，置於 內生菌分離培養基(MS)上，27°C培養，待內生放線菌長出，再結合劃線分離法在固體PDA平 板上進行分離，直至獲得其純培養物。將分離得到的菌株與稻瘟病致病菌梨孢黴同時接種 到PDA固體平板上，放入黴菌培養箱中28°C倒置培養，每天觀察，篩選拮抗真菌效果最明顯 的菌株，分離得到來自水稻葉鞘組織的高效拮抗梨孢黴菌株〇siSh-2。用幾丁質培養基和纖 維素培養基對該放線菌能否分泌幾丁質酶及纖維素酶進行了定性檢測。該放線菌在28°C恆 溫培養條件下能產生幾丁質酶和纖維素酶，表明OsiSh-2可以通過分泌幾丁質酶和纖維素 酶，溶解殺死真菌性病害。 所用MS培養基組成為：大豆粉20g，甘露醇20g，瓊脂粉20g，蒸餾水定容至1L，調節PH 值範圍7. 2±0. 2,121°C高溫高壓滅菌25分鐘。PDA培養基組成為：土豆200g，煮沸30min 後4層紗布過濾，濾液中加入10g葡萄糖，瓊脂15g，蒸餾水定容至1L，自然PH，121°C高溫 高壓滅菌25分鐘。ISP II液體培養基組成為：麥芽浸粉10g，酵母浸粉4g，葡萄糖4g，瓊脂 18g，蒸餾水定容至1L，調節PH值範圍7. 2±0. 2，121°C高溫高壓滅菌25分鐘。幾丁質培養 基組成為：膠狀幾丁質4. 5g，硫酸銨3g，七水合硫酸鎂0. 3g，磷酸二氫鉀2g，檸檬酸一水合 物lg，吐溫80 200 μ L，溴甲酚紫0· 15g，瓊脂15g，蒸餾水定容至1L，調節PH值到4. 7,121°C 高溫高壓滅菌15分鐘。纖維素培養基：羧甲基纖維素鈉20g，磷酸氫二鈉2. 5g，磷酸二氫 鉀1. 5g，蛋白腖2. 5g，酵母浸粉0. 5g，瓊脂15g，蒸餾水定容至1L，調節PH值到7. 0,121°C 高溫高壓滅菌15分鐘。
[0008] 實施例2 :菌株的生物學鑑定 1.菌株形態特徵 (1) 菌落形態特徵：將單菌落劃線接種至PDA固體培養基中，將平板倒置於恆溫培養 箱，28°C培養，3天以內長出無色基生菌絲和氣生菌絲，菌落表面褶皺、邊緣緊緻。3天後長 出白色孢子覆蓋在菌落上。20天後菌體逐漸變為黑色，見附圖1。 (2) 菌體形態特徵：用插片法培養該菌，在光學顯微鏡下觀察其氣生菌絲分枝情況，見 附圖2。 2.菌株16S rRNA分析 研磨菌體並用玻璃砂劇烈震蕩後，採用革蘭氏陽性菌基因組DNA提取試劑盒 (Shanghai Generay Biotech Co·, Ltd)的方法，抽提菌株基因組DNA，以該DNA為模板，米 用放線菌16S rRNA基因引物（27F-765R及704F-1492R)，擴增出菌株的16S rRNA片段並 測序，將得到的16S rRNA序列與NCBI中的核酸資料庫進行Blast同源性比對（www. ncbi. nlm. nih. gov/Blast)，與資料庫中已知放線菌 的 16S rRNA 全長序列的相似性達到了 99%，V4、V5可變區的序列相似性達到100%，將該菌株鑑定為 5^/'<9/7(〇?/^58。.08丨311-2。使用軟體]\0^^5.0中的鄰近結合法 (neighbor-joining method)製作 0siSh-2 的系統發育樹，見附圖 3。 實施例3 :菌株在ISP II液體培養基中的生長情況 採用放線菌稱乾重法繪製生長情況圖。將所得菌株接種到裝有50mL的ISP II液體培養 基的250mL規格錐形瓶中，在28°C，150r/min條件下振蕩培養，每天取樣20mL，平行取3次， 4000rpm離心30min以去掉上清液，烘乾過夜稱取菌體乾重。共測量7天，其結果見附圖4。
[0009] 實施例4 :菌株對稻瘟病的抑制情況結果 (1)固體拮抗實驗：在直徑為90mm的培養皿中心接種梨孢黴菌RB3 (來自湖南亞華種 子有限公司），刮取活化好的OsiSh-2菌在距離真菌30mm的位置上劃一條線。封口膜封好 培養皿，28°C倒置培養7天以上，最後以生長出來的真菌與放線菌之間的距離遠近判斷該 菌的拮抗能力強弱，結果見附圖5。拮抗其他4種梨孢黴菌生理小種61、62、307、02(來自 於湖南農業大學和湖南亞華種子有限公司）見附圖7。 (2)液體拮抗實驗：將菌株接種到裝有50mL ISP II液體培養基的250mL規格錐形瓶 中，28°C、150r/min條件下震蕩培養，每天取出lOOyL菌液，注入置於混合有梨孢黴孢子 的PDA培養基上的牛津杯中，28°C培養7天以上，觀察抑制稻瘟病生長的抑菌圈大小，結果 見附圖6,可見第7天菌液的抑菌圈所佔面積約為梨孢黴培養總面積的78%。
[0010] 實施例5 :分泌幾丁質酶及纖維素酶的定性實驗 (1)幾丁質酶定性實驗：用滅菌接種環挑取OsiSh-2菌塊置於幾丁質培養基中央，於28 °〇恆溫培養7天後開始觀察培養基顏色變化情況。空白幾丁質培養基為黃色，OsiSh-2產 生的幾丁質酶使培養基變為紫色，見附圖8,表1。
[0011] (2)纖維素酶定性實驗：使用剛果紅染色法。將OsiSh-2挑取置於纖維素培養基 中央，培養觀察7到15天。培養基經剛果紅染色後呈紅色，當培養基中的羧甲基纖維素被 OsiSh-2所產生的纖維素酶分解後，培養基中出現以OsiSh-2菌為中心的白色透明圈，見附 圖9,表1。
[0012] 表1菌OsiSh-2的水解酶產生情況

【權利要求】
1. 一株體外高效拮抗稻瘟病菌的水稻內生放線菌，所述水稻內生放線菌為 5^/'<9/^〇?/^<9518卩.〇8丨311-2，保藏號為〇6]\0^1^〇.8716。
2. 如權利要求1所述的水稻內生放線菌在防治水稻稻瘟病上的應用。
3. 如權利要求1所述水稻內生放線菌的培養方法，其特徵在於：將所述菌株接種到裝 ISP II液體培養基中，於28°C，150r/min條件下振蕩培養。
【文檔編號】C12N1/20GK104195064SQ201410278588
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年6月20日 優先權日:2014年6月20日
【發明者】朱詠華, 劉選明, 楊曉璐, 廖紅東, 袁珊珊, 徐婷, 曾夏東, 王真真 申請人:湖南大學