一類治療阿爾茨海默病的選擇性多巴胺d1受體激動劑的製作方法
2023-05-16 03:22:11 3
專利名稱：一類治療阿爾茨海默病的選擇性多巴胺d1受體激動劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及一類先導化合物選擇性多巴胺Dl受體激動活性的及其治療阿爾茨海默病的用途。
背景技術：
阿爾茨海默病(Alzheimer' s disease, AD)是一種以認知記憶障礙為主要特徵的退化性神經系統疾病，在發達國家已經成為僅次於心血管病、腫瘤 和中風而位居第四位的致死原因。目前全球有AD患者約2430萬人，預計到2040年全球將共有AD患者8100萬。AD的病因至今尚不明確，可能是多種因素共同參與的結果。圍繞著AD的發生，存在包括基因突變學說、膽鹼能學說、澱粉樣蛋白(Αβ)級聯學說、tau蛋白異常修飾學說、免疫與炎症學說以及氧化應激學說在內的各種學說。其中Αβ級聯學說佔據主導地位。該學說認為Αβ是AD發病的中心環節，Αβ的聚集和沉積促發炎症級聯反應、神經元纖維纏結、軸突損傷和突觸丟失，最終導致神經元凋亡和痴呆。目前治療AD的藥物主要是針對AD不同的發病機理而產生的，主要包括作用於膽鹼能系統的藥物、雌激素、神經營養因子、非留體抗炎藥、抗氧化劑、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑、抗A β藥物、改善腦代謝的藥物等，但只有抗A β藥物是針對疾病的中心環節的治療措施。因此抗Αβ藥物治療被認為是AD最有希望的治療方法。AD患者Αβ蛋白逐漸在細胞內外通過成核作用形成毒素斑點，導致神經元缺失，變性，產生認知和記憶障礙。因此減少Αβ的產生對改善AD的認知和記憶障礙有理論依據。目前美國猶他州鹽湖城的一家生物製藥公司MyriadGenetic (Nasdaq NYGN)正在進行特異性減少毒性多肽澱粉樣A β 42藥的II期臨床，但臨床上尚無此類藥物出現。多巴胺受體按照不同受體亞型與激動劑結合後信號轉導機制的差異，可分為兩類D1類和D2類受體。Dl類受體與Gs蛋白偶聯，受到刺激後是腺苷酸環化酶活性升高，這類受體包括Dl和D5兩種亞型。D2類受體與Gi蛋白偶聯，受刺激後不改變腺苷酸環化酶的活性或使其活性降低，它包括D2，D3，D4三種亞型。在中樞神經系統(CNS)中Dl受體是分布最廣泛的DA受體，以尾狀殼核，橫核，黑質網狀部和嗅球表達最多，外周Dl受體主要分布在心臟和腎臟。近幾年研究發現Dl與阿爾茲海默症發病機制有關聯，有望成為AD的防治新靶點。研究表明激動Dl受體能保護神經元免受A β低聚物導致的突觸功能障礙，且多巴胺在體外具有分解Αβ纖維蛋白的作用，另外腦內注射Dl受體激動劑能改善東莨菪鹼造成的痴呆狀況，這些都提示Dl受體激動劑能夠用於AD的防治。
發明內容
本發明的目的在於提供一種治療阿爾茨海默病的化合物，該化合物是多巴胺Dl受體激動劑，對阿爾茨海默病有預防或者治療作用。本發明所述的化合物包括含治療有效量的化學式(I)的化合物或其藥學上可接受的鹽。本發明採用高通量篩選技術，建立了多巴胺Dl受體激動劑高通量篩選模型並應用於化合物大規模篩選，通過篩選一批從CHEMDIV公司購買的化合物並進行功能性驗證尋找到了具有化學式(I)的多巴胺Dl受體激動劑。本發明的技術方案為在中國倉鼠卵巢癌細胞(CHO)內穩定轉染多巴胺Dl受體，建立Dl受體激動劑高通量篩選模型，進行初篩，復篩，構效關係分析，得到一類具有抗AD作用的候選藥物。具體步驟如下步驟一建立及培養穩定轉染Dl受體的CHO細胞株。步驟二 標準曲線的測定及最佳細胞數確定。 步驟三陽性藥驗證。步驟四採用穩轉細胞株和摸索的最佳檢測條件對化合物進行Dl受體激動劑的高通量篩選，得到有明顯量效關係的化合物。
圖I :標準曲線及最佳細胞數曲線圖2 :陽性藥氫溴酸鹽(SKF81297)量效曲線圖3 :化合物1-5的量效曲線圖4 :化合物6-11的量效曲線
具體實施例方式以下結合
本發明的
具體實施例方式I.建立及培養穩定轉染多巴胺Dl受體的CHO細胞株。應用重組酶介導的盒交換技術(Recombinase-MediatedCassette Exchange,RMCE)批量構建G蛋白偶聯受體細胞株，並使其穩定轉染多巴胺Dl受體，培養CHO-Dl細胞使其達到穩定生長狀態。2.標準曲線的測定及最佳細胞數確定。為驗證實驗體系的正確性以及能篩選出可靠的多巴胺Dl受體激動劑，在建立模型時需要測定標準曲線並確定最佳細胞數。待CHO-Dl細胞生長到80%的時用O. 5mM EDTA的PBS消化細胞，離心去除上層液體，最後將細胞用刺激緩衝液重懸用於確定最佳細胞數。使用PerkinElmer公司的LANCE cAMP 384Kit試劑盒，配製標準環磷酸腺苷(cAMP)梯度稀釋液及腺苷酸環化酶激活劑(forskolin)梯度稀釋液。標準曲線測定方法將cAMP的標準溶液50 μ mol/L ( LANCE cAMP檢測試劑盒自帶)，用刺激緩衝液逐級稀釋為終濃度4倍的工作濃度，cAMP與抗體溶液各5 μ I加入384孔板中共同孵育45分鐘，加入10 μ I終止液，孵育一個小時後檢測；最佳細胞數檢測方法將50mM的forskolin母液用刺激緩衝液逐級稀釋為終濃度4倍的工作濃度，forskolin與含有細胞的抗體溶液各5 μ I加入384孔板中共同孵育45分鐘，加入10 μ I終止液，孵育一個小時後在EnVision微孔板測讀儀上檢測。根據forskolin量效曲線窗口(性噪比S/B)及曲線與cAMP標準曲線斜率相近的細胞濃度作為最佳細胞數。標準曲線及最佳細胞數確定見圖I。3.選用多巴胺Dl受體激動劑的陽性藥SKF81297對所建立的多巴胺Dl活性篩選模型進行驗證並且根據量效曲線計算其的ec5Q。陽性藥測定方法將IOOmM的SKF81297母液，用刺激緩衝逐級稀釋為終濃度2倍的工作濃度，陽性藥SKF812975 μ I與含有最佳細胞數的抗體溶液5 μ I加入384孔板中共同孵育45分鐘，加入10 μ I終止液再孵育一個小時後用EnVision微孔板測讀儀檢測，陽性藥量效曲線見圖2。4.在上述的最佳檢測條件下進行多巴胺Dl受體激動劑的的初篩和復篩。初篩與復篩過程相同，初篩只選用一個濃度對8萬個化合物進行初步篩選，再選擇初篩有效的化合物梯度稀釋8個濃度進行復篩，過程如下用Janus全自動加樣工作站稀釋化合物並吸取5 μ I轉移到384孔板中，再用Multidrop自動加樣儀將含有最佳細胞數的抗體溶液5 μ I加入384孔板中，兩者共同孵育45分鐘後，Multidrop自動加樣儀將10 μ I終止液加入384孔板中，再次孵育一個小時，用EnVision微孔板測讀儀檢測。復篩得到一系列具有Dl受體激動作用的化合物，各個化合物的EC5tl結果見圖3，圖4.
復篩實驗結果
權利要求
1.下式化合物或其藥學上可以接受的鹽
2.根據權利要求I的化合物或其藥學可接受的鹽，其作用於多巴胺Dl受體的選擇性激動活性。
3.根據權利要求2所述的用途，其中所述化合物或其藥學上可接受的鹽用於製備治療 或預防阿爾茨海默病的用途。
全文摘要
本發明涉及一類具有多巴胺D1受體激動活性的化學式(I)的化合物或其藥學上可接受的鹽。此類化合物有很強的體外激動多巴胺D1受體的活性，EC50可達到nM水平，其中活性最強的化合物的EC50為7.56±0.45，可作為Aβ抑制劑，用於治療阿爾茨海默病。
文檔編號C07D405/12GK102964340SQ20121054128
公開日2013年3月13日 申請日期2012年12月12日 優先權日2012年12月12日
發明者嚴明, 何玲, 張陸勇, 連燕霞 申請人:中國藥科大學