聯合培養細胞的微流控晶片的製作方法

2023-05-16 02:28:21 1

本實用新型屬於細胞培養後構建模型的一種晶片，特別針對兩種或兩種以上細胞構建接觸面模型時使用的一種微流控晶片，具體涉及為一種聯合培養細胞的微流控晶片。

背景技術：

目前，臨床中對於疾病機制的研究多依賴於傳統的動物造模和二維細胞培養的方法觀察病變現象。但動物模型造模周期長，且不能對病變過程實現實時動態監控，即不能實現病變過程的「全景」再現；而常規的細胞二維培養，微環境過於單一，與體內細胞生長方式及其所處微環境不符，造成得到的部分結果「失真」。因此需要一種可以建立三維細胞生長模型的結構以實現實時觀察不同細胞間的相互作用。

微流控晶片技術的發展使模型建立微量化，直觀化成為現實，因此可以利用微流控晶片建立一種三維細胞生長模型。如何設計微流控晶片的通道及各接觸面的構建，成為解決問題的關鍵。

本實用新型利用微流控技術，設計並製作了一種微流控晶片，用於模擬體內特定微結構(如肺泡上皮-間質交界、肺泡-毛細血管交界等)，並在此基礎上誘發病理模型，對病變過程進行實時監控，為後續機制研究及幹預治療奠定理論及方法基礎，具體提供了一種聯合培養細胞的微流控晶片。

技術實現要素：

為了實現在微流控晶片內建立三維細胞的目的，本實用新型的目的是提供一種能解決上述問題的聯合培養細胞的微流控晶片。

本實用新型的目的通過以下技術方案實現：

一種聯合培養細胞的微流控晶片，其包括晶片層與覆蓋層，其特徵在於，所述晶片層與覆蓋層結合後內包含2-多條通道，通道中間包括連通部分，且中間通道的深度較其他通道淺，或者中間通道較口徑較其他通道小；每條通道上設置進出孔。本微流控晶片通過設置2-多條通道及中間連通部分可以實現組織臨界面的建立，且簡單方便。

進一步，還設置覆蓋進出孔的封堵帽，封堵帽下部尺寸與進出孔孔徑相同，上端尺寸較大，此種設置方便對封堵帽的操作，且能有效對進出孔進行封堵。

進一步，所述通道數目為3條。3條通道的設置可以實現2-3中組織間臨界面的構建。

進一步，兩側通道呈分散狀設置，中間通道直線設置，通道中間連通部分均勻設置。此種設置可以使每個通道的進出孔有效分離，操作方便。

進一步，所述兩側通道以中間通道為軸線對稱設置。對稱的設置可以讓整個晶片看起來美觀，且能夠有效節省晶片空間。

進一步，所述通道形狀為方形，且通道兩端分別設置進出孔。兩端設置的進出孔可以更好的方便操作者的操作。

進一步，所述各通道在晶片層上底面水平，在覆蓋層上中間通道處設置突出，使中間通道較淺。此種設置可以保證構建臨界面更加接近真實臨界面。

進一步，所述通道形狀為圓形或者橢圓形通道。圓形與橢圓形的設置更加接近真實的官腔壁或者血管壁。

進一步，所述圓形或橢圓形通道均勻設置於晶片層與覆蓋層上，拼合而成，各通道在中間設置連通部分。

進一步，所述中間通道設置為方形通道，其他通道設置為圓形或橢圓形通道。此種設置可以有效模擬兩邊為官腔或血管中間不為腔道的組織臨界面模型。

進一步，採用PDMS材料及軟光刻技術進行晶片製作。

進一步，所述晶片尺寸約為1.4cm x1.4cm；各通道尺寸為：中間通道寬度(1mm),兩側通道寬度均為1.5mm。

利用上述晶片建立組織臨界面模型的方法，具體步驟如下：

(1)打開中間通道進出孔，關閉兩側微通道進出孔，將細胞-細胞外基質混合物注入中間通道，使其成三維生長；

(2)打開單側通道進出孔，其他關閉，用基質膠對通道內壁進行包被，將另一種細胞混懸液注入開發通道，使細胞單層貼壁生長於微通道內表面，呈腔狀生長，以模擬生物壁及腔；

(3)如果有多個通道，逐次開發單個通道進出孔，關閉其他通道進出孔，用步驟(2)中的方法將後續細胞混懸液注入右側通道，貼壁生長於通道內表面，呈管腔樣生長，每個通道內注入一種細胞混懸液；

(4)在上述生理結構模型基礎上，用藥物刺激誘發病理模型，觀測病變過程。

利用上述晶片建立組織臨界面模型的方法，所述微流控晶片設置3個通道，具體步驟如下：

(1)打開中間通道進出孔，關閉兩側微通道進出孔，將細胞-細胞外基質混合物注入中間通道，使其成三維生長；

(2)打開一側通道進出孔，關閉另一側通道進出孔，用基質膠對通道內壁進行包被，將另一種細胞混懸液注入打開通道，使細胞單層貼壁生長於微通道內表面，呈腔狀生長，以模擬生物壁及腔；

(3)打開另一側通道進出孔，用(2)中的方法將第三種細胞混懸液注入右側通道，貼壁生長於通道內表面，呈管腔樣生長；

(4)在上述生理結構模型基礎上，用藥物刺激誘發病理模型，觀測病變過程。

進一步，建立組織臨界面模型的方法為：

(1)打開中間通道進出孔，關閉左右兩側微通道進出孔，將間質細胞-細胞外基質混合物注入中間通道，使其成三維生長，模擬肺間質區域；

(2)打開左側通道進出孔，用基質膠對通道內壁進行包被，將上皮細胞混懸液注入左側通道，使上皮細胞單層貼壁生長於微通道內表面，呈腔狀生長，以模擬肺泡壁和肺泡腔；

(3)關閉左側微通道進出孔，打開右側通道進出孔，用(2)中的方法將血管內皮細胞混懸液注入右側通道，貼壁生長於通道內表面，呈管腔樣生長，以模擬血管壁和血管腔；

(4)在上述生理結構模型基礎上，用藥物刺激誘發病理模型，觀測病變過程。

進一步，用上述方法，還可模擬人體內各種組織交界面微結構，模擬該微結構的病變以觀察，幹預。

與現有技術相比，本實用新型聯合培養細胞的微流控晶片可以實現細胞的三維生長，並能有效建立組織臨界面模型，模擬生理結構。

附圖說明

圖1為本實用新型整體結構示意圖；

圖2為本實用新型帶封堵帽整體結構示意圖；

圖3為本實用新型晶片層結構示意圖；

圖4為本實用新型覆蓋層結構示意圖；

圖5為本實用新型中間部分橫向剖視圖；

圖6為本實用新型封堵帽結構示意圖；

圖7為本實用新型實施例5構建肺泡-毛細血管屏障結構圖；

圖中，1、晶片層；2、覆蓋層；21、進出孔；31、中間通道；32、兩側通道；33、連通部分；34、突出；4、封堵帽。

具體實施方式

實施例1一種聯合培養細胞的微流控晶片

一種聯合培養細胞的微流控晶片，包括晶片層1與覆蓋層2，其中晶片層1與覆蓋層2結合後內包含3條通道，通道中間包括連通部分33，且中間通道31的深度較其他通道淺，通道形狀為方形，且通道兩端分別設置進出孔21。兩側通道32呈分散狀設置，中間通道31直線設置，兩側通道32以中間通道31為軸線對稱設置，通道中間連通部分33均勻設置。此種設置可以使每個通道的進出孔21有效分離，操作方便。3通道在晶片層1上底面水平，在覆蓋層2上中間通道31處設置突出34，使中間通道31較淺。此種設置可以保證構建臨界面更加接近真實臨界面。採用PDMS材料及軟光刻技術進行晶片製作。本微流控晶片通過設置3條通道及中間連通部分33可以實現組織臨界面的建立，且簡單方便。

實施例2一種聯合培養細胞的微流控晶片

一種聯合培養細胞的微流控晶片，包括晶片層1與覆蓋層2，其中晶片層1與覆蓋層2結合後內包含3條通道，通道中間包括連通部分33，且中間通道31的深度較其他通道淺，通道形狀為方形，且通道兩端分別設置進出孔21。還設置覆蓋進出孔21的封堵帽4，封堵帽4下部尺寸與進出孔21孔徑相同，上端尺寸較大，此種設置方便對封堵帽4的操作，且能有效對進出孔21進行封堵。兩側通道32呈分散狀設置，中間通道31直線設置，兩側通道32以中間通道31為軸線對稱設置，通道中間連通部分33均勻設置。此種設置可以使每個通道的進出孔21有效分離，操作方便。3通道在晶片層1上底面水平，在覆蓋層2上中間通道31處設置突出34，使中間通道31較淺。此種設置可以保證構建臨界面更加接近真實臨界面。採用PDMS材料及軟光刻技術進行晶片製作。本微流控晶片通過設置3條通道及中間連通部分33可以實現組織臨界面的建立，且簡單方便。

實施例3一種聯合培養細胞的微流控晶片

一種聯合培養細胞的微流控晶片，包括晶片層1與覆蓋層2，其中晶片層1與覆蓋層2結合後內包含3條通道，通道中間包括連通部分33，中間通道31口徑較兩側通道32小；通道形狀為圓形或者橢圓形通道。圓形與橢圓形的設置更加接近真實的官腔壁或者血管壁。圓形或橢圓形通道均勻設置於晶片層1與覆蓋層2上，拼合而成，各通道在中間設置連通部分33。通道兩端分別設置進出孔21。還設置覆蓋進出孔21的封堵帽4，封堵帽4下部尺寸與進出孔21孔徑相同，上端尺寸較大，此種設置方便對封堵帽4的操作，且能有效對進出孔21進行封堵。採用PDMS材料及軟光刻技術進行晶片製作。本微流控晶片通過設置2-多條通道及中間連通部分33可以實現組織臨界面的建立，且簡單方便。

實施例4一種聯合培養細胞的微流控晶片

一種聯合培養細胞的微流控晶片，包括晶片層1與覆蓋層2，其中晶片層1與覆蓋層2結合後內包含3條通道，通道中間包括連通部分33，中間通道31口徑較兩側通道32小；中間通道31設置為方形通道，兩側通道32設置為圓形或橢圓形通道。此種設置可以有效模擬兩邊為官腔或血管中間不為腔道的組織臨界面模型。各通道兩端分別設置進出孔21。還設置覆蓋進出孔21的封堵帽4，封堵帽4下部尺寸與進出孔21孔徑相同，上端尺寸較大，此種設置方便對封堵帽4的操作，且能有效對進出孔21進行封堵。採用PDMS材料及軟光刻技術進行晶片製作。本微流控晶片通過設置2-多條通道及中間連通部分33可以實現組織臨界面的建立，且簡單方便。

實施例5一種肺泡-毛細血管屏障結構構建方法(上皮-間質細胞的聯合培養)

(1)打開中間通道31進出孔21，關閉左右兩側微通道進出孔21，將細胞外基質膠(matrigel)與培養基的混合液(1:2)從c入孔注入中間通道31，37℃靜置5min，使其形成凝膠狀態；

(2)僅打開左側通道進出孔21，將肺上皮細胞(A549)懸液從a孔注入晶片左側通道內，將晶片與水平面呈90度垂直靜置30min後，吸出通道內多餘的細胞懸液，最終使得上皮細胞貼左側通道內側表面生長，形成腔樣結構，模擬肺泡內表面上皮細胞層；

(3)關閉左側微通道進出孔21，打開右側通道進出孔21，將間質細胞(THP-1，MRC-5)懸液與matrigel膠1:2混合後，由e入孔注入晶片右側通道內，37℃靜置5min，使得間質細胞在matrigel膠中呈三維生長，模擬肺間質內細胞的生長方式；

(4)打開所有入孔，將新鮮培養基注入左側通道，培養基通過中間通道31擴散至右側通道，從而實現上皮-間質細胞的聯合培養，以便將該模型用於後續機制研究。

(5)在上述生理結構模型基礎上，用藥物刺激誘發病理模型，觀測病變過程。

構建的肺泡-毛細血管屏障結構如圖7所示。

實施例6一種肺泡-毛細血管屏障結構構建方法(上皮-間質-毛細血管內皮細胞聯合培養)

(1)打開中間通道31進出孔21，關閉左右兩側微通道進出孔21，將間質細胞懸液-細胞外基質膠(2:1)混合後，從進孔注入中間通道31，使其成三維生長，模擬肺間質區域；

(2)同上述實施例5中步驟2，將上皮細胞混懸液注入左側通道，使其呈腔樣生長，以模擬肺泡上皮層和肺泡腔；

(3)關閉左側微通道進出孔21，打開右側通道進出孔21，用上述步驟(2)中的方法將血管內皮細胞混懸液注入右側通道，使其貼通道內側表面呈管腔樣生長，以模擬血管壁和血管腔；

(4)在上述生理結構模型基礎上，用藥物刺激誘發病理模型，觀測病變過程。

上述實施例的說明只是用於理解本實用新型。應當指出，對於本領域的普通技術人員來說，在不脫離本實用新型原理的前提下，還可以對本實用新型進行若干改進，這些改進也將落入本實用新型權利要求的保護範圍內。