銅綠假單胞菌水解彈性蛋白能力相關基因pa5022及其應用的製作方法

2023-05-16 07:13:26

專利名稱：銅綠假單胞菌水解彈性蛋白能力相關基因pa5022及其應用的製作方法
銅綠假單胞菌水解彈性蛋白能力相皿因屍^W2及其，
fe^領域本發明屬於m^物生t/^領域，特別涉及一種銅綠假單胞菌7jC解彈性蛋白能 力相，因iM5022及其自。
背景技術：
銅綠假單胞菌(P促wdbwowoy您《<§/ 0似，PA)，屬於假單胞菌禾鬥(Family pseudomonas)假單胞菌屬(Pseudomonas)，又稱為綠JW菌。革蘭氏陰性菌，廣泛分布於自然界 中(如土壤、7柳空氣)，正常人體的艦、M3t和上呼鵬中，是一種觀的^f頓織。在一 些漫'Ki)i、難導致宿主免疫功能受損的因素中，易引起支氣管-肺部的原發性銅綠假單胞菌感 染。同時也FS^5、創傷感染病人，囊性纖維頓A&晚期腫瘤患者死亡的觀原因，常引 起菌血症、肺炎、泌尿系統麟、燒傷感染和支氣管擴張、慢肢氣管 *性纖維{ ^感染 等頓，嚴離害著人類的麟和生命。
銅綠假單胞^#性蛋白麟一種觀的毒力因子，由/o^基因編碼。該酶的合^5離體密 度感皿統(quorum sensing)的調控。群體密度感g^細菌之間相互交流以感知外界環m
而協調特定基因教的一種誠。驗，已糹Si:M^多的調節子倉辦調控群體密度感頓統，
進而在^^及緑後水平上調控著彈性蛋白酶的就。彈性蛋白酶是一種鵬卜蛋白酶，艦n型
分泌系統分泌至iM^卜。目前bm^現n型分泌系統由12-16個組^a^。
對彈性蛋白水解能力相關基因的研究可以進一步完善群體密度感目 彈性蛋白酶的調控 網絡，揭示彈性蛋白酶的分泌調節過程。研究新基因的功能，探索銅綠假單胞菌的致病機制，為 藥物設計皿新的耙位點，為預防和抑制銅綠假單胞菌的 理論依據。

發明內容本發明目的JiJ^與菌株水解彈性蛋白能力相關的新基因，研究雜彈性蛋白
水解能力中的作用，以此為耙位點，設i憤的抗鵬物，預防和治療銅綠假單胞菌弓胞的感染。
本發明鄉的銅綠假單胞菌水解彈性蛋白能力相錢因iM5W麼是如序列^^列1麻TO ,列。
戰的銅綠假單胞菌7jC解彈性蛋白倉巨力相幾因可以用於以該基因為新繊點設計並 制 制菌體水解彈性蛋白能力的藥物，以斷琪毒力i^C病性，增3S^素的藥效。
本發明基因屍^o"的獲得方法利用Mu轉jsta^bH:，構建轉座子插入突^:庫，
性蛋白水解能力附氐的突變子，提取突^E株的基因組DNA，用i^"I酶切基因組DNA，酶切片 段與pUC18載體連接，艦電轉化將雜J^t/^fcA鄉桿菌DH5(x感受態細胞，塗在賴轉 黴素和卡那黴素) ^的LB平^i:， ^ilPCR和酶切鑑定，篩選陽性轉化子，測自定轉tt;子中 Mu所插入片段的核苷,列，經NCBI中Blast ttXt確定Mu所插入的基因位置。本發明的有^m:
基因Mu轉座子插入失活的突變^7K解彈性蛋白能力斷氐，說明雌因與銅綠假單胞 菌彈性蛋白酶的合成調賊分泌aii有關，而此前該基因是一個功能完絲知的新基因，本魏 首7:fc^現其與彈性蛋白水解能力相關。新基因功能的發W"揭示彈性蛋白酶的合成調控網絡、分 泌過程、^tt藥物設計的耙位點，預防和治療銅綠假單胞菌的自皿指導意義。

圖1是菌^7iC解彈性蛋白能力示意1、野頓PA68作為陽',照 2、屍，"::MuPA68突變株。 圖2 Mu克Pt^酶切^電泳M: DL15000 3、克I^T質粒4、克軒質f細^7"I酶切。
圖3. Mu轉座子PCR ,電泳圖訴PCR方法檢測轉化子的Mu轉座子)；
1、 DL2000 2、 Mu克軒PCR，。
表l.野^M菌株與^^株中/oy5、 /必/、 v^ 基因^^ii7K平的測定結果。
魏例i:艦Mu轉j^m^m行效子辦的粒
1. 從於37。Cl6 20h的ffl羊LB固體平fei^兆取一個單皿，轉到含有5mLLB液體培養 基的體中，37°C, 200ipm，過M蕩i歸14 18h。
2. 次日按l : 100轉接到含有100mLLB液體Jt^基的三角瓶中，37°C， 200rpm，振蕩*§#^勺 3-5h，使用752就鵬計測定細菌ig^^540nm處的吸光度，在ODs4o:^0.5 0.6時，停止歸。
3. 在無菌斜牛下將第2員養的菌,移到一^^菌的就冷的50mL離心管中，在冰上皿
lQmin,傲^t;糊至(rc。
4. 於4。C， 6000ipm，離心10min，麟菌體。
5. 倒出@#^，用^^IR的預冷的300mM虎塘重懸菌體，4°C， 6000rpm，離心10min。
6. 重複(5)，依 細1/2^R、 1/5^^預冷的300mM蔗糖溶^m懸、洗滌菌體。
7. 最後將細胞溶於lmL 300 mM蔗糖溶液中，按1(%17管^^ 1.5mL的無麟心管中，冰 鄉絲用。
8. 取l^iL Mu轉座復糊，力口APJ 100nL製備好的PA68感受態細胞中，混勻，吸取混^tf)口入至!fl^冷的0.2cm電轉化杯中，用Bio-Rad電穿孔仗^S^J52.6kv，進行電擊，i戰下電擊 所用的,和時間。
9. 在電擊後的轉化體系中加入1l5fe 37。C溫浴的900^L SOC ±歸基中，37°C， 200 rpm，復甦lh。
10. MM蘇後的轉化體系塗^&含50^ig/mL卡那黴素的LB平肚。37。Ci歸16—18 h，陰 tM照不加Mu轉座復^tl。如果在陰',照平feJ:無mi:長出，,性LB平fei:長出的轉 化彌瑰一步離。
11. 取2m1轉化子培養菌液做模板，以人工Mu轉座子上的特異序列Mul (5，-GCAACTGTCCATACTCTGA-3，)和Mu2 (5， - CGCTGGGnTATCGTCGA-3，)做引物，用 PCR方i增Mu轉座子片段。同時分別以銅綠假單胞ra株皿粒pHTH2做陰14^陽性 對照。擴增##為，先在94。CM性15min，然後，94。C^^性lmin， 55。C退火lmin， 72°C 延伸lmin，共30個循環，雜72。C延伸10min。
12. PCRT^O.8%瓊月識繊中電泳檢測，EB她後紫外;l:TT觀察結果並留照片，具有700bp 卡那黴素抗性基因的轉化子即為Mu轉j^5變轉化子。
鄉例2:水解彈性蛋白能力改變的效子的離 1.在無菌i歸皿內鋪上一薄層LB培養基，待其凝固後再鋪上一薄層彈性蛋白選#^#基(配 加口下每升i^&^基含彈性蛋白4g， ^W糖1 g,酵娜1 g, K2HP041 g， KH2PO40.5 g， MgSO 4.7H2O0.1g，瓊月謝20g, pH7.0)。從Mu轉座子突數庫中活化^f菌株，用滅菌的雅 挑取麟點種至膽歸基表面，37'Ci歸24>48h。細菌由於7jC解彈性蛋白的能力不同，在^#基上 形駄小不一的透明水解圈，以野頓菌株PA68為對照，j^W'隨白7jC解能力^^靴的菌株 (圖l)。
^6fe例3:銅^fg單胞菌水解彈性蛋白能力相^S因的克隆 第j、野4M和缺陷^^因組DNA的提取 1. ^Jf^劃線，的LB固體平^J^兆OT生^^缺陷株單,，接種到5mL Urolh液體:t^ 基中，37°C， 200rpm,過夜i歸；2. 次日按l : lOO的比例轉接到lOmLL-brolh液體歸基中，37°C， 200rpm，歸14-16h;
3. 將菌^fl移至一llmL離心管中，4°C， 12000rpm^離心lmin。棄去上清，麟菌體；
4. 在離心管中加入1 .lmL ,緩衝液(20 mM Tris'HCl pH8.0， 10 mM EDTA， 10 mM NaCl， 20% 賺)SffJ:浮菌體，再加入50pLRNase (10mg/ml)， 37。C水浴lh;
5. 力口入1.1 mL的2% SDS，充分振蕩至溶液澄清，再加IImL蛋白酶K (20 mg/ml)， 37'C水浴 過夜，其間經徵番動一T^心管，使蛋白酶K能充分zK解蛋白；
6. 力口入2.21^#^^的1 3卿苯酚/氯你混合液，劇烈振蕩，12000 rpm,離心20min;
7. 吸KJbMJ^Cffi轉移至另一新離心管中，Sftffl酚/氯Ml提3次，操作步驟同6，至蛋白抽 提乾淨為止；
8. 吸^±清，加入2fm^R(約4ml)^7jC乙醇，用|^#離細出沉澱，置^^^ff的llmL 離心管中，70%乙 ^次，^M少帶出、液體，真空千燥；
9. 細幹後的DNA中加入1.5 mlTES溶液(500mMTris'HCl， pH8.0， 5mMEDTA， 50mMNaCl) 離DNA，之後加入15nlRNase (10mg/ml)， 37。C水浴lh;
10. 力口入1.511111118柳苯酚/氯娜提蛋白，12000 rpm，離心15min， ^U:清；重飾提一次， 肚清；力口入1.51111氯仿翻提—次，社清；
11. 加入2{§#^5&^乙醇(約4ml), -20°CS^S0.5h， 4'C， 12000rpm，離心10min;
12. 棄去上清，沉澱用lmL70。/。乙,滌2次，真空千鵬重溶"BS4的TE中。0.8%的瓊月離 繊電泳^l^測DNA的質駄濃度。
第二步、質粒的小量提取，參照《MolecularCloning》(Sambrook"o/., 1989 )的方法並加 以鵬。
1. 挑取轉化子單a^種於5mLLB液鵬養基中，37°C， 180rpm,過頓蕩i歸；
2. 取1-1.51^菌^^移至一1.51111離心管中，12000ipm， lmin，離心,菌體；
3. 棄去上清，菌體盡雖幹，置於冰上，加入IOOmL預冷的溶液I (參見《MolecularCloning》)， 重懸繊冰浴5mins
4. 力口入200mL溶液II (1%SDS， 0.2mol/LNaOH)，輕輕的混合均勻至溶 的清^&粘稠，冰
6浴5min，注鎌液II^m現配；
5. 力口入150pL溶細I，輕輕的混勻，冰浴5min;
6. 4°C， 12000rpm，離心10min，吸祉清轉移至另一體中；
7. 新管中加入8pLRnase (10mg/mL)，艘37。C水浴中45min;
8. 加入^^P、(約400mL)的Tris飽和苯酚/氯仿/異戊HM合液(25 : 24 : 1 )抽提，4'C， 12000rpm，離心10min，吸^LL清轉移至另一新管中；
9. 新管中力口入2f^R (約lmL)預冷的557k乙醇，混合均勻，-20°C，艘20min;
10. 4。C， 12000rpm,離心10min，棄去上清；
11. 用lmL 70%乙1|^滌沉澱一次，真空千燥，沉澱溶^f^M的(10-50mL) TE (pH=8.0)貌菌水中。
12. 0.8%的瓊月|^ 電泳檢測提取的質粒的量，以DL15000為DNAi)^量標準。第三步、載體pUC18質粒的酶切及彌酸化鵬
用限制性內切酶/^I酶切鵬pUC18質粒，酶切的方法參見TaKaRa公司產品說明書。此酶切，可以直接用電泳檢測酶切結果，若酶切完全，貝iJ終ihES，採用加熱鵬(6(TC 15min)使限制性內切酶失活。
酶切鵬體系的鵬
(1) 用^f^R的Tris柳苯酚/氯仿/異戊醇鵬一次，4°C， 12000rpm，離心10min,轉移上清至另1離心管中；
(2) 加入l/10體積的3MNaAC(pH4.8)， 2倍^^1^冷的^7K乙醇，、凝B均勻後，於一20。C中
(3) 4。C， 12000 rpm離心10 min， DNA沉娜70X乙^fe滌兩次，真空千燥。沉澱溶預量的TE (10 mM Tris.HCl， 1 mM EDT入pH8.0)緩衝^S菌水中。
為防止載體自身連接SiS，斷K^化時的背景，提高3i^效率，用小腸鹼性磷酸單酯酶(CIAP)除去線形化的pUC18 W5，^^il酸。具#^法按照說明書進行。第四步、連接、轉化及 1.連接鵬體系(總糊為2。Ml):
基因組DNA和質粒pUC18的,(15pl體系)
DNA lpL ddH20 10pL pUC18 lpL
混勻，45。CzK浴5射中後，fflil冰浴，再力卩T4連接酶L5ML， 10xbuffer 1.5mL， 1冬16。C水浴過夜。
2連接,的艦
(1) TE補超200pL。
(2) 加入2倍糊的557K乙柳1/10 #^、的3mol/LNaAc(pH4.8)， -20。C，20min沉澱DNA。
(3) 4。C 12000ipm離心10min，棄上清。
(4) 力口入lmL70o/o的冷乙麟DNA沉澱兩次，真空千燥。
(5) 沉澱溶於5(aLddH20中。14pl ddH20， lpl酶切處Sjg的基因組DNA， lnl酶切鵬後的 載體pUC18片段，混和均勻，45"C水^^溫5min。
(6) 取出後立即置於冰上，力nA2[jI10xT4DNALigase Buffer, 2nlT4,DNALigase，混勻，16。C 鵬16>24h;
3.娜桿菌感菱態細胞的製備
(1) 挑脫ffl羊劃線線的;y^桿菌單離接種於5mLLB液體i^^基中，37°C， 180rpm，過 夜振蕩歸；
(2) 按1 : 100的比例轉接至200mL LB液體培養基中，37°C， 180rpm，振蕩培養至 0060^0.5-0.6，約3-5h;
(3) 將菌^f移至無菌的250mL離心管中，4°C， 6000rpm,離心10min， if^^菌體；
(4) 棄去上清，加入^R (200mL)的無菌去離子水(預冷)，重懸沉澱，4'C， 6000tpm， 離心10min;
(5) 棄去上清，力口入l/2術只(100mL)的無菌去離子水(預冷)，重複步驟(4)鵬作；(6) 加入l/2鵬(lOOmL)的無菌腦甘油(預冷)，鼓步驟(4),作；
(7) 力口入1/100 ^f只的無菌10%,油(預冷)，重懸沉澱，^Ml.5ml無麟心管中，95nL7 管，.70。C保存。
4. 規桿菌DH5a的電轉化施
(1) 5nLDNA雜，與95pL規桿菌感受態細胞混勻，冰浴5-10min。
(2) 混^t/^移至預冷的0.2cm電轉化杯中(陰'IW照不加混合物，只加感受態細胞)，在 Bio-Rad電轉化處體2,50kv，進行電擊。
(3) 從電轉化杯中吸出電轉化體系，並用lmL37r預熱的SOC液體i^^基(20g/L胰蛋白腖， 5g/L酵娜，0.5g/LNaC120mM麟糖，lOmM氯化鎂)糖後，37°C， 150轉/餅 歸lh。
(4) 菌液^(^布^" 20mmol/L MgS04 50ng/mL卡那黴素和IOO嗎/mL氨^W黴素的LB固 體歸基上，37。C倒數夜歸。
5. 克軒的飾鑑定
(1) M31夜培養的Mfi:平^hM取轉化子，小量提^M粒，用限制性內切酶^p"I酶切
(2) 以DL15000為DNA標準，在0.8%瓊月離 中電泳檢測鑑定，衫跑同時具有pUC18 載體帶和外源目的基因帶的克軒(圖2)。
(3) 同時以從轉化子中提取的質粒為糹鎌，用Mu轉座子DNA片段的Mu轉座子檢測引物 Mu-kamPl和Mu-kamP2進行PCR (具^^法同實施例1中所述)。電泳檢測PCR，， 以DL2000為DNA標準，以質粒pHTH2為lBt照，若能擴增出700bp的特異性帶，則 說明轉化子質粒中含有AXMu轉座子DNA片段，克隆成功(圖3)。
(4) 對鵬克隆的轉化子質織行測序。
6. 陽性轉化子質粒的DNA觀!l序 以Mu轉座子兩端的反向序列為依據設計的AM42P1作為引物進行測序。^Eh海英俊公司
進行DNA測序。
7. 基因定位測序結果在銅綠假單胞菌的基因組資料庫(h p//www.pseudomonas.com)或GenBank (htto://wwwjicbi.n]nLnflLgov/)中BLAST進行序列t瀏找到Mu所插AS因在銅綠假單胞菌基因 組中的錢。 、
其中^t^化子Mu轉鵬突變的基因是E4M22。 ^!ffi例4:相^S因啟動子,盼測定
1. 啟動子-/^2融合質粒的構建
應用預測軟體，尋找/必/、 v^及三個基因上遊可能的啟動子序列。使用軟體由 http:〃www.fruitflv.org/sea 10015/0101110161:1111111網^1#^ 1999 NNPP version 2.2 (March 1999) of the promoterpredictor。以PA68基因組DNA為模板，將ltW究的三個基因各自上遊的一SJ^列進行擴 增，所有的序列均應包娜測的啟動子區和調控基因編碼區的頭部，且反芽物內部不含￡toRI 位點和5omffl位點。正向引働tl五coRI位點，反向引働HtoHI位點，便於將來與報告基因的正 向融合。擴增並^ii fcoRI和5鵬HI酶切的DNA片段與^3l同樣mSI切的pBluescript-SK連接構 建^中間質粒pSKPLI， pSKPB, pSKPV(具,作同^li例3 )。^31測^^析的中間質禾4ffl五coRI 和及卵ffl酶切得到外源外段與同樣雙酶切的？01^191300連接構建完成啟動子-/^2融合質粒 pDN19PLI， pDN19PB， pDN19PV (具鵬作同^St例3)。
2. 將構辦的融合質粒分別電轉4^^感受態細胞PA68及E45022突變株中(具鵬作同^M例1)。 分別挑取PA68， ^5022突變船有融合質粒的轉化子的,單麟，接種矜50ug/ml四環素 的液體LB中過夜，。次日轉接到20ml LB液體i歸基中，調 始菌液OAoo為0.02， "。C 200ipm通氣震蕩歸18h，參考纖er的方法測定^判L蹄酶活性(畫er， 1972)，比較每對PA68 和iM50"突變株中融合質粒轉化子的酶活差異。結果見表l。 A糊離酶活性的測定施如下
(1) ^W菌液於冰水混糊中冰浴20min;
(2) 取lml菌液，以i歸基為參比，測定600nm吸，；
(3) 取100^1菌液，加入900^1 Z Buffer;
(4) 加入氯仿10Ml， 0.1%SDS15^1，震蕩10s;(5) 28。C水浴5min;
(6) ^31M的菌液中加入0.2ml ONPG， 28'C7iC浴中搖動^H^開始，精確計時到El^輕現 黃色；
(7) 待轉黃後，力口入0.5mllmol/LNa2CO3使鵬中止；
(8) 12000rpm離心2min，祉清，以ZBuffer為參比，測定420nm的吸爐。 注)Z Buffer的配製，每贈
16.1gNa2HP04H20， 5.5gNaH2P04H20， 0.75gKCl，
0.246gMgSO47H2O， 2.7ml巰基乙醇，調節pH至7.0
ONPG的配製
翻稱量O腦，用ABuffer溶解，配製成4mg/ml濃度
ABuffer的配製
0.1MNa2HPO4， 0.1MNaH2PO4
表l野^M菌株與突變株中/asB、 te/、叫si 基因轉^7jC平的測定
PA68/promoter-/^5Q22 mutant/promoter-
418±35178±13
582&t2131151±72
Pfag-lacZ1182±57137±12
/os/、 v^si 、 /0^啟動子-/0￡^融合質粒，^菌株、iM5W2突變株中測定 的酶雜果，結果為三次糊測定酶活的平均值it示瞎，單勧纖er Units
11序列表
南開大學
〈20H^fg單胞菌7Klf彈,白倉幼相^因iM5022及其，
1
1
3357
DNA
<213,綠假單胞菌(屍犯Mato/wonasflerugfwosw,PA) 1
atgcctgcccttcgctccctgatcgctattcttttcctcggcctctgccttgccagtccg60
ccgctcctcgcccagtccgagccgccctcggccgaggccgtccagcaaagcctcgacaag120
ctggccgagcgcaagctcgccgaagccgaccagaaggtcgccaaggccagcctcgaacag180
accctcaagttcctcgccgcgcgcgacgaagcgctgcagagcctggaggacctgaaaaag240
cgcctgagcgacgcgccccggcagatcgaggaaaaccagcgcgaactggagcgcctgaag300
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catttccactggagccgcgaacaggtcggcttcctcgaccggcacctggtccgcctcggc腳
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ctcagccgcctgctgttcagcagccccggcgacgaacgtccgtcgctgatcaagatgatc2040
gtcggcatcctcttcaccgcgctgccgctggtgctcttcgtcgcggtctgcttcggctac2100
tactacacctcgctgaagctcaccgaccgtctcatcgataccctttacctgctgctgctc2160
tggttcgtcatcgaagccgccttcgtccgcggcctgggcgtggcggcccggcgcctggcc2220
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1權利要求
1、一種銅綠假單胞菌水解彈性蛋白能力相關基因PA5022，其核苷酸序列如序列表序列1所示。
2、 權利要求1皿的銅綠假單胞菌水解彈性蛋白能力相皿因^^2的應用，用於以] 因為新藥PE點設計並制，制菌體彈性蛋白酶產生的藥物，以斷氐其毒力皿病性，增強抗生素 的藥效。
全文摘要
本發明公開了銅綠假單胞菌水解彈性蛋白能力相關基因PA5022及其應用。屬於微生物生物技術領域。此基因大小為3357bp，其核苷酸序列如序列表序列1所示。目前國際上對該基因的功能尚沒有確切報導。銅綠假單菌的彈性蛋白酶是一種鋅金屬蛋白酶，能夠水解彈性蛋白，本發明發現PA5022基因的失活導致銅綠假單胞菌水解彈性蛋白的能力降低。銅綠假單菌的彈性蛋白酶是該菌的重要的毒力因子及致病因素。對該基因的發現及研究有助於研究銅綠假單胞菌彈性蛋白酶的合成與調控機制，揭示銅綠假單胞菌的致病機理，為預防和治療該菌引起的感染提供理論依據。
文檔編號C12N15/57GK101643741SQ20091007037
公開日2010年2月10日 申請日期2009年9月8日 優先權日2009年9月8日
發明者喬明強, 劉力偉, 張秀明, 徐海津, 銳 牟, 白豔玲, 米曉媛, 靳永新 申請人:南開大學