一種多重競爭性pcr檢測拷貝數變異的方法
2023-05-16 21:58:31 1
專利名稱：一種多重競爭性pcr檢測拷貝數變異的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種基於螢光通用引物的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法，應用於生物科學研究與臨床分子診斷。
背景技術：
拷貝數變異(copy number variations,CNVs)是近年來發現的基因組多樣性的新形式，它是指與參考序列相比，基因組中Ikb 3Mb的DNA片段的結構變異現象。CNVs廣泛存於基因組中，與一些遺傳性疾病的發生相關，對人類抗病性和易感性表型等變異有重要影響。這就要求建立一種快速、準確和低成本的CNVs分型檢測技術。隨著生物技術的發展，不同的研究小組相繼開發了許多的檢測方法，主要包括以雜交為基礎和以PCR為基礎的檢測技術。前者可以在全基因組水平上對CNVs進行檢測， 代表技術有微陣列比較基因雜交(SolinasToldo，Lampel et al. 1997)、全基因組SNP晶片(Irving, Bloodworth et al. 2005)、代表性寡核苷酸微陣列技術(Lucito, Healy et al. 2003)等，其優點是通量高且易於實現自動化，但是普遍存在解析度低、成本高和周期長的缺點。後者主要是針對具體的目標位點進行檢測，代表性的技術有實時螢光定量PCR、 多重連接探針擴增技術(MLPA) (Schouten, McElgunn et al. 2002)和多重可擴增探針雜交 (MAPH) (Armour, Sismani et al. 2000)等。實時突光定量技術有操作簡單、重複性好、實驗周期短等優點，但是檢測通量較小；與實時螢光定量PCR相比，MLPA和MAPH的檢測通量有了很大提高，不過PCR微環境的變化會導致不同位點不能完全同步擴增，而且PCR的平臺效應也會影響檢測結果。以PCR為基礎的檢測技術存在一個共同的缺陷就是待測樣本和對照樣本是分開檢測的，這樣兩者PCR效率的差異會引起檢測結果的偏差。競爭性PCR克服了這個缺陷，實現CNVs的快速、準確、經濟的檢測。在PCR擴增過程中，PCR產物的量可以用公式Y = A (1+R)n來表示，其Y表示PCR產物的量，A表示初始模板的量，R表示PCR的擴增效率，η表示PCR的循環數，當PCR擴增效率相同時，PCR產物的量與初始模板的量成正比。競爭性PCR利用了這一原理，在同一 PCR反應體系中涉及兩組模板，一組是待測樣本，另一組是合成的一段核酸序列，用作內對照，兩組模板僅在目標序列長度上(存在一些鹼基的插入或缺失)存在一些差異，其他反應條件一致，因此兩者擴增效率接近一致，兩種擴增產物量的比直觀的反映了初始模板(待測樣本和內對照不存在拷貝數差異)量的比，可以根據內對照的初始模板的量來計算樣本的濃度。在檢測拷貝數變異時，當兩模板具有相同的濃度或削除了濃度差異帶來的影響時，PCR產物量的比值就反映模板拷貝數的差異。PRT 法(Paralogue Ratio Test) (Armour,Palla et al. 2007)是基於競爭性PCR的一種檢測CVNs的一種方法，此方法的優點是待測位點和內對照共存於基因組序列中，但是缺點也是很明顯的，只能針對有限的基因位點進行檢測，而且針對不同檢測位點都要設計一對螢光引物，加大了實驗成本。內對照可以採用人工合成的方法，還有其他的一些製備方法(Zentilin and Giacca 2007),不過這種方法設計的內對照序列較待測位點的序列不一致，導致兩者PCR擴增效率差異大，最終影響拷貝數的檢測。
發明內容
本發明要解決的技術問題是克服現有技術的缺陷，提供一種成本低、通量較高、樣本需求低、檢測靈敏性高的CNVs檢測方法。本發明的目的通過以下技術方案實現技術方案之一是提供一種基於螢光通用引物的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法，包括以下步驟(I)提供多重競爭性PCR引物，由至少一對通用螢光引物、至少一對位於待測基因上下遊的嵌合特異引物和至少三對參照引物組成所述通用螢光引物長度範圍為10 25bp，5』端用螢光標記，TM值彡57°C值，且通用引物對待測基因組具有特異性；所述嵌合特異引物和所述參照引物針對參照區段和檢測區段設計，TM值> 62°C， 長度範圍為28 50bp，3』端為18 25bp的特異引物序列，5』端為所述通用引物序列，所述3』端和5』端的序列之間插入兩個鹼基的固定組合；所有嵌合引物之間的TM值的差異不超過3°C ;所述三對參照引物設計在相同或不同的參照區段上，且與待測基因無特異性匹配；所述多重競爭性PCR引物所產生的不同擴增產物片段之間有可檢出的長度差異；(2)定量合成內對照DNA片段針對每一個待測區段和每一個參照區段的擴增產物片段，合成相對應的內對照序列，並進行精確定量；所述內對照序列與所述待測區段和參照區段的擴增產物片段相比插入或缺失2 3bp的DNA片段；(3)多重競爭性PCR的反應過程(a)將含待測區段和參照區段的待測樣本和對照樣本分別與相等或整數倍mol數的內對照DNA片段混合在一起，然後進行PCR，前3 16個循環，退火溫度高於所述通用螢光引物的退火溫度，用於所述嵌合特異引物引導的擴增，後17 20個循環，退火溫度低於所述通用螢光引物的退火溫度，用於所述通用引物引導的擴增，兩組退火溫度的差距 ^ 5 0C ；(b)根據螢光標記PCR擴增產物長度不同，對擴增產物片段進行檢測，獲得待測樣本中待測區段和參照區段以及內對照擴增產物片段的長度信息與相應的螢光強度信息；⑷數據分析i.計算每個待測區段和參照區段的樣本峰高和/或峰面積(S)和內對照的峰高和或峰面積(I)，得到每個待測區段和參照區段的比值(S/I)；ii.以一個參照區段的比值為標準，將所有待測區段和參照區段的比值同其作比， 進行數據內部標化；iii.按照i和ii的步驟將對照樣本進行數據內部標化；iv.將待測樣本和對照樣本的內部標化值作比，獲得待測樣本與對照樣本的比值， 該比值乘以對照樣本的拷貝數，得到待測樣本的拷貝數。上述技術方案的優選方式之一為，所述通用突光引物長度範圍為18 20bp。上述技術方案的優選方式之二為，所述嵌合特異引物和所述參照引物的長度範圍為 38 45bp。
上述技術方案的優選方式之三為，所述多重PCR引物對應的擴增產物的長度範圍為120 350bp，不同擴增產物片段的長度差異為8 50bp。上述技術方案的優選方式之四為，所述嵌合特異引物和所述參照引物的3』端的特異引物序列段長度為18 20bp。上述技術方案的優選方式之五為，所述的多重競爭性PCR引物由一到四對不同螢光標記的通用螢光引物、一到二十五對針對相同或不同待測基因的嵌合特異引物和三到六對針對相同或不同基因的參照引物組成。或者作為另一種優選方式，所述的多重競爭性PCR 引物由一對通用螢光引物、一到五對針對不同待測基因的嵌合特異引物和三到五對參照引物組成。上述技術方案的優選方式之六為，所述的三到六對參照引物中至少兩對設計在常染色體上，至少一對設計在X染色體上。本發明的技術方案之二是提供上述的分析方法在檢測基因拷貝數變異中的應用。本發明的技術方案之二是一種基於上述的分析方法的試劑盒，提供通用螢光引物、嵌合特異引物、參照引物和定量的內對照DNAjP /或多重競爭性PCR的反應的試劑。本發明在總結現有技術中各種檢測方法的優缺點基礎上，經過自主創新研發，成功地試用於應用於生物科學研究與臨床分子診斷等領域，並且有廣泛的潛在應用市場。本發明令人驚奇地發現具有以下優點I、成本低。針對所有的檢測位點，應用了通用螢光引物，並採用同一的參照區段， 這些措施都大大降低了實驗成本。2、實驗周期短。相對於MLPA技術(需要兩天)來講，一天內就可以得到實驗結果。 可對少量樣本多個基因進行同時檢測，大大縮短了實驗周期，提高了實驗效率。3、數據更準確。本發明中使用了通用螢光引物，而引物的3』端統一為Ct兩個鹼基，保證了不同位點擴增的同步性和起始效率的一致性。
圖I為一個參照區段和三個目標區段的多重PCR的試驗結果。圖2為圖I的多重PCR的試驗的原理示意圖(分析過程中涉及兩組引物一組是多重上下遊嵌合特異引物；另一組是螢光通用引物)。圖3為實施例I中樣本檢測結果示意圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡明本發明，應理解，實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式有同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。實施例I利用本發明所述的方法對3個轉基因小鼠(ZYJ-1、ZJY-2、ZJY_3)進行了拷貝數的檢測，另外還包括2隻C57BL/6小鼠(其中一隻為雌性B6F，一隻為雄性B6M)為對照樣本。實驗步驟
1、通用引物、嵌合特異引物的設計通用引物的設計設計原則保證上下遊引物的TM值彡57°C，且差距不超過3°C，針對小鼠和人基因組特異，引物相互作用小，上遊通用引5』端用Fam螢光標記。通用引物序列為上遊5』 -TTCATCCGTTCGTCCTAC-3』 ；下遊5』 -ACAGCGTCAATCTCGTTC-3』。嵌合特異引物的設計根據小鼠轉基因的區段，我們選擇了 3個目標基因和5個參基因區段(其中3個位於常染色個上，2個位於X染色體上)，共設計了 8對特異引物，並與通用引物組合成特異引物，且在通用引物的3』端插入ct兩個鹼基，要求TM值>62°C，擴增產物的長度在120 350bp之間，相鄰產物長度的差至少為8bp。所有的引物均經過Blast 和Oligo mask軟體的分析,從而減少非特異擴增和引物二聚體。表一目標區段和參照區段的嵌合特異引物序列
權利要求
1. 一種基於螢光通用引物的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法，包括以下步驟(1)提供多重競爭性PCR引物，由至少一對通用螢光引物、至少一對位於待測基因上下遊的嵌合特異引物和至少三對參照引物組成所述通用螢光引物長度範圍為10 25bp，5 』端用螢光標記，TM值彡57 °C值，且通用弓丨物對待測基因組具有特異性；所述嵌合特異引物和所述參照引物針對檢測區段和參照區段設計，TM值> 62°C，長度範圍為28 50bp，3』端為18 25bp的特異引物序列，5』端為所述通用引物序列，所述3』 端和5』端的序列之間插入兩個鹼基的固定組合；所有嵌合引物之間的TM值的差異不超過 3°C ;所述三對參照引物設計在相同或不同的參照區段上，且與待測基因無特異性匹配；所述多重競爭性PCR引物所產生的不同擴增產物片段之間有可檢出的長度差異；(2)定量合成內對照DNA片段針對每一個待測區段和每一個參照區段的擴增產物片段，合成相對應的內對照序列，並進行精確定量；所述內對照序列與所述待測區段和參照區段的擴增產物片段相比插入或缺失2 3bp的DNA片段；(3)多重競爭性PCR的反應過程(a)將含待測區段和參照區段的待測樣本和對照樣本分別與相等或整數倍mol數的內對照DNA片段混合在一起，然後進行PCR，前3 16個循環，退火溫度高於所述通用螢光引物的退火溫度，用於所述嵌合特異引物引導的擴增，後17 20個循環，退火溫度低於所述通用螢光引物的退火溫度，用於所述通用引物引導的擴增，兩組退火溫度的差距彡5°C ；(b)根據螢光標記PCR擴增產物長度不同，對擴增產物片段進行檢測，獲得待測樣本中待測區段和參照區段以及內對照擴增產物片段的長度信息與相應的螢光強度信息；(4)數據分析1.計算每個待測區段和參照區段的樣本峰高和/或峰面積(S)和內對照的峰高和或峰面積(I)，得到每個待測區段和參照區段的比值(S/I)；ii.以一個參照區段的比值為標準，將所有待測區段和參照區段的比值同其作比，進行數據內部標化；iii.按照i和ii的步驟將對照樣本進行數據內部標化；iv.將待測樣本和對照樣本的內部標化值作比,獲得待測樣本與對照樣本的比值,該比值乘以對照樣本的拷貝數，得到待測樣本的拷貝數。
2.根據權利要求I所述的分析方法，其特徵在於，所述通用螢光引物長度範圍為18 20bp。
3.根據權利要求I所述的分析方法，其特徵在於，所述嵌合特異引物和所述參照引物的長度範圍為38 45bp。
4.根據權利要求I所述的分析方法，其特徵在於，所述多重PCR引物對應的擴增產物的長度範圍為120 350bp，不同擴增產物片段的長度差異為8 50bp。
5.根據權利要求I所述的分析方法，其特徵在於，所述嵌合特異引物和所述參照引物的3』端的特異引物序列段長度為18 20bp。
6.根據權利要求I所述的分析方法，其特徵在於，所述的多重競爭性PCR引物由一到四對不同螢光標記的通用螢光引物、一到二十五對針對相同或不同待測基因的嵌合特異引物和三到六對針對相同或不同基因的參照引物組成。
7.根據權利要求6所述的分析方法，其特徵在於，所述的多重競爭性PCR引物由一對通用螢光引物、一到五對針對不同待測基因的嵌合特異引物和三到五對參照引物組成。
8.根據權利要求6所述的分析方法，其特徵在於，所述的三到六對參照引物中至少兩對設計在常染色體上，至少一對設計在X染色體上。
9.權利要求I所述的分析方法在檢測基因拷貝數變異中的應用。
10.一種基於權利要求I所述的分析方法的試劑盒，提供通用螢光引物、嵌合特異引物、參照引物和定量的內對照DNAjP /或多重競爭性PCR的反應的試劑。
全文摘要
本發明涉及基於通用螢光引物的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法，包括下列步驟(1)提供多重競爭性PCR引物，由至少一對通用螢光引物、至少一對位於待測基因上下遊的嵌合特異引物和至少三對參照引物組成；(2)定量合成內對照DNA片段；(3)多重競爭性PCR反應過程；和(4)數據分析。本發明還提供基於以上分析方法的試劑盒，適用於5～28個基因/反應的拷貝數變異的檢測，是一種快速、中通量、經濟的拷貝數變異檢測方案。
文檔編號C12Q1/68GK102586456SQ20121006653
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月14日 優先權日2012年3月14日
發明者李鵬翔, 肖君華, 陸炯, 陳燁, 陳軼群 申請人:上海翼和應用生物技術有限公司