一種促進胚胎幹細胞向心肌細胞分化的方法

2023-05-16 04:53:31

專利名稱：一種促進胚胎幹細胞向心肌細胞分化的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術和醫學領域，更具體地，本發明涉及一種促進胚胎幹細胞向心肌細胞分化的方法。
背景技術：
胚胎幹細胞(embryonic stem，ES)是一種全/多能幹細胞，源自處於囊胚期胚胎的內細胞團，不僅能夠在體內發育分化形成新生個體的各個組織器官，而且可以在體外培養條件下誘導分化形成各種特化細胞類型，如心室肌細胞，平滑肌細胞，內皮細胞，紅細胞，胰島細胞等等。人胚胎幹細胞體外建系的成功和誘導分化技術的成熟，使胚胎幹細胞成為臨床上器官移植治療和細胞移植治療的重要細胞來源。
由冠狀動脈病變引起的心肌梗塞(myocardial infarction，MI)是現代社會中人們最常見的疾病和主要致死原因。雖然近年在其診療方面有眾多進展，但心肌梗塞後受損的心肌逐漸被無收縮功能的纖維組織代替，從而導致的心力衰竭仍是主要的心臟病變。心臟移植或植入左室機械性的支撐系統，可挽救終末期心力衰竭病人的生命，但受限於供源的短缺(前者)和有限的使用壽命(後者)。由於心肌細胞是一種終末分化細胞，沒有增殖能力，因此，如何修復丟失損傷的心肌細胞，改善病變心肌血供和MI後心功能不全成為國際國內心臟學領域研究熱點。隨著幹細胞生物學的研究突破和其培養技術的改進，通過細胞移植(將健康的細胞移植入病變心臟)以重建受損心肌、恢復病變心臟功能的嘗試為治療心臟疾病展示了令人興奮的前景。
定向分化是胚胎幹細胞走向臨床的必要步驟。體外培養誘導胚胎幹細胞的分化得到的類胚體中含有各種特化細胞類型，所以如何提高心肌細胞的豐度、如何分離出純化的心肌細胞是將胚胎幹細胞作為細胞移植供體所急需解決的關鍵問題。

發明內容
本發明的目的在於提供一種促進胚胎幹細胞向心肌細胞分化的方法，所述方法可大大提高類胚體中心肌細胞的豐度，從而可為心肌梗塞的幹細胞臨床治療提供更多的細胞來源。
在本發明的第一方面，提供一種促進胚胎幹細胞向心肌細胞分化的方法，包括步驟(a)在低氧環境中，培養胚胎幹細胞48±24小時，得到第一培養物；(b)在常氧環境中，繼續培養第一培養物120±24小時，得到第二培養物，在第二培養物中心肌細胞佔所有細胞的10-15％；並且，所述的低氧環境是氣體環境，其中含有3±1體積百分比的氧氣；所述的常氧環境條件是氣體環境，其中含有21±1體積百分比的氧氣。
在本發明的另一優選例中，所述的胚胎幹細胞在以下的培養基中進行培養DMEM+15％FBS+L-Glu+P-S+MEM+β-ME。
在本發明的另一優選例中，所述的胚胎幹細胞選自未分化的胚胎幹細胞、或分化早期的胚胎幹細胞。
在本發明的另一優選例中，所述的分化早期為胚胎幹細胞開始分化起的0-48小時。
在本發明的另一優選例中，所述的低氧環境含有3±0.5體積百分比的氧氣；或者，所述的常氧環境含有21±0.5體積百分比的氧氣。
在本發明的另一優選例中，所述的低氧環境含有3±0.2體積百分比的氧氣；比如可以含有3體積百分比的氧氣。
在本發明的另一優選例中，所述的常氧環境含有21±0.2體積百分比的氧氣；比如可以含有21體積百分比的氧氣。
在本發明的另一優選例中，所述的胚胎幹細胞為哺乳動物的胚胎幹細胞。
在本發明的另一優選例中，所述的哺乳動物選自人、鼠、或猴。
在本發明的另一優選例中，在低氧環境中，培養胚胎幹細胞48±12小時；或者，在常氧環境中，繼續培養第一培養物120±12小時。
在本發明的另一優選例中，在步驟(a)和步驟(b)中，培養條件是37±1℃，5±0.5％CO2。
在本發明的第二方面，提供一種製備心肌細胞的方法，包括步驟(a)在低氧環境中，培養胚胎幹細胞48±24小時，得到第一培養物，(b)在常氧環境中，繼續培養第一培養物120±24小時，得到第二培養物，在第二培養物中心肌細胞佔所有細胞的10-15％，(c)從第二培養物中分離出心肌細胞；並且，所述的低氧環境是氣體環境，其中含有3±1體積百分比的氧氣；所述的常氧環境條件是氣體環境，其中含有21±1體積百分比的氧氣。
在本發明的第三方面，提供一種用於培養心肌細胞的裝置，所述的裝置包括一個封閉的箱體，以及位於箱體上的箱門，所述的箱體中包括氮氣供給裝置，氧氣排出裝置，以及含氧量檢測裝置，其中，所述的氮氣供給裝置和氧氣排出裝置調節箱體內的氧氣含量，使得氧氣在氣體中的含量為3±1體積百分比。
本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1顯示了轉入心肌特異性啟動子NCX1心肌特異性鈉鈣交換蛋白一型驅動綠色螢光蛋白基因的ES細胞誘導向心肌細胞的分化。其中，圖1A顯示了在類胚體博動區域特異性表達綠色螢光蛋白；圖1B顯示了分離單個心肌細胞中有綠色螢光蛋白的表達；本圖證明本發明人建立的心肌特異性鈉鈣交換蛋白一型驅動綠色螢光蛋白基因的ES細胞能夠表達心肌細胞特異性的綠色螢光。
圖2顯示了低氧處理提高類胚體向心肌的分化率。
圖3顯示了低氧處理能夠提高類胚體中心肌細胞的比例。低氧處理對類胚體的形態和大小無明顯影響，卻可以明顯提高胚體中表達綠色螢光蛋白的心肌細胞的比例。
圖4顯示了低氧處理能夠上調類胚體中心肌特異性轉錄因子和結構基因的表達。
具體實施例方式
本發明人經過廣泛而深入的研究和試驗，出乎意料地發現在體外培養分化的胚胎幹細胞的分化早期給以低氧刺激，能夠促進胚胎幹細胞向心肌細胞的分化，大大提高類胚體中心肌細胞的豐度，從而可為心肌梗塞的幹細胞臨床治療提供更多的細胞來源。基於此完成了本發明。
胚胎幹細胞如本發明所用，所述的胚胎幹細胞為未分化的胚胎幹細胞、或為分化早期(為胚胎幹細胞開始分化起的0-48小時)的胚胎幹細胞。其中，未分化胚胎幹細胞來源於囊胚期內細胞團。
在本發明中，所述的胚胎幹細胞為哺乳動物的胚胎幹細胞。在本發明的優選方式中，所述的哺乳動物包括但不限於人、鼠、牛、羊、豬、狗、貓、兔、馬、或猴；更優選的，所述的哺乳動物包括但不限於人、鼠、或猴。
在本發明中，所述的胚胎幹細胞可採用常規的方法來製備，或可獲自細胞保藏機構，例如ATCC。
細胞培養的條件在本發明中，可採用本領域技術人員已知的胚胎幹細胞培養技術來培養胚胎幹細胞。比如在合適的條件下，可將胚胎幹細胞培養在滋養層細胞上。
可用於本發明的培養基沒有特別限制，可以採用本領域常規的適用於培養胚胎幹細胞的培養基。代表性的例子比如DMEM+15％FBS+L-Glu+P-S+MEM+β-ME；其中，DMEM為一種通用培養基，FBS指特級胎牛血清，L-Glu指L型穀氨酸，P-S指鏈黴素+青黴素，MEM為非必需胺基酸，β-ME為β-巰基乙醇。
這些培養基可以用常規方法配製或購買獲得，例如，DMEM培養基可購自GIBCO公司。
在本發明的一個優選例中，胚胎幹細胞如下培養選用絲裂黴素C(購自SIGMA)處理的原代小鼠胚胎成纖維細胞作為滋養層細胞，將胚胎幹細胞培養在滋養層細胞上。培養基使用DMEM，添加15％胎牛血清，L-穀氨酸，鏈黴素-青黴素，非必需胺基酸，β-巰基乙醇(0.0007％)，平均36小時傳代。傳代採用0.05％Trypsin-EDTA。
更佳地，胚胎幹細胞的培養條件是37±1℃，5±0.5％CO2。
促進胚胎幹細胞向心肌細胞分化的培養環境如本發明所用，所述的「低氧環境」與「低氧氣氛」可互換使用，均是指一種氣體環境，所述氣體環境中除了對氧氣、二氧化碳、氮氣的含量進行調節外，其它氣體及其配比基本上接近空氣或與空氣完全等同。所述低氧環境中含有3±1體積百分比的氧氣；更優選的，所述的低氧環境含有3±0.5體積百分比的氧氣；比如可以含有3體積百分比的氧氣。
在本發明的另一優選方式中，所述的低氧環境的氣壓等於常氧環境的氣壓，本發明人通過調節氮氣的濃度來調節出低氧環境，因而在低氧環境中氮氣的濃度相對於常氧環境有升高(即與常氧相比，氧氣體積的減少量基本等於或完全等於氮氣體積的增加量)。
如本發明所用，所述的「常氧環境」和「常氧氣氛」可互換使用，均是指一種氣體環境，其中氧氣的含量接近於或等於空氣中氧氣的含量，其它氣體及其配比接近空氣或與空氣完全等同。所述常氧環境中含有21±1體積百分比的氧氣；更優選的，所述的常氧環境含有21±0.5體積百分比的氧氣；比如可以含有21體積百分比的氧氣。
在本發明的一種優選方式中，所述的「常氧環境」為一般的空氣環境，但是CO2濃度為5％。
在本發明的具體實施方式
中，本發明人進行了心肌特異性螢光表達試驗，心肌特異性基因表達水平試驗等檢測，均說明低氧刺激能夠大大促進胚胎幹細胞向心肌細胞的分化。
本發明的主要優點在於(1)通過本發明的方法，僅需要調節環境中的含氧量，即可實現胚胎幹細胞向心肌細胞的定向分化。一般地，持續在常氧條件下培養分化的胚胎幹細胞所得培養物中心肌細胞佔所有細胞的5％，而本發明在對胚胎幹細胞在分化早期的低氧處理明顯增加了心肌細胞的比例。
(1)本發明首次將低氧處理技術用於胚胎幹細胞向心肌細胞定向誘導，從而可大大提高心肌細胞的獲得率，可使用本發明製備的心肌細胞取代受損的心肌細胞，發揮重建受損心肌、恢復病變心臟功能。
(2)現有的胚胎幹細胞體外誘導向心肌細胞的分化方法往往複雜煩瑣且效果不理想，而採用本發明的低氧處理技術，不僅心肌細胞的獲得率高，條件易於控制、操作簡單，而且無需加入誘導試劑，成本低廉。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用於本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示範之用。
實施例1胚胎幹細胞的培養及體外誘導分化小鼠R1胚胎幹細胞(ES)系(Roder JC，Canada購自美國ATCC)培養在滋養層細胞上，滋養層細胞選用絲裂黴素C(購自SIGMA)處理的原代小鼠胚胎成纖維細胞(來源自遠交系昆明白鼠，13-15天齡胚胎)，培養使用DMEM，添加15％胎牛血清(購自Hyclone公司，ES cell qualified)，L-穀氨酸，P-S(青黴素+鏈黴素)，非必需胺基酸，(購自GIBCO，100X稀釋)，β-巰基乙醇(0.0007％)，平均36小時傳代。傳代採用0.2％Trypsin-EDTA(購自GIBCO)。
體外誘導分化採用懸滴培養方法，將適宜細胞密度(1.5-3.0×106細胞/培養皿(直徑60mm))的小鼠R1胚胎幹細胞(用0.05％Trypsin-EDTA消化成單個細胞懸液，採用差速貼壁的方法除去其中的滋養層細胞，使滋養層細胞佔細胞總數小於5％，用血球記數板記數；然後，用含有20％FBS的細胞培養液稀釋細胞至終濃度為約600細胞/20μl，然後將細胞懸液接種為每滴20μl的懸滴，以懸滴狀態培養兩天；然後，將形成的類胚體收集到無Matrigel處理的培養皿中，懸浮培養3天；然後，將經培養的類胚體接種到0.1％明膠-包被的(gelatin-coated)培養板上。
實施例2質粒構建和ES細胞的轉染先利用載體質粒pEGFP-N1(BD，購自Clontech)，用內切酶AatII酶切然後大片段自連，將原有的CMVIE啟動子失活，再用內切酶PstI酶切失活後的載體，然後將克隆的心肌特異性鈉鈣交換蛋白一型基因啟動子(採用常規的方法從基因組DNA中克隆得到，或可購自NIH/NIA研究所)用內切酶PstI切出，用T4連接酶連接，得到的克隆分別用PstI，SalI，AseI酶切鑑定，挑出其中正確插入的陽性克隆，大量擴增質粒用於轉染。用AseI酶切線性化質粒，得到的線性化質粒15μg，利用電轉儀(BioRad，GenePulser)轉染ES細胞，電轉條件設置為250V，500μF，ES細胞懸液為5×106/800μl，轉染後接種到有Neo抗性的滋養層細胞(Neo處理的原代小鼠胚胎成纖維細胞)上，36小時後在培養液中加入300μg/ml的G418(購自GIBCO)，培養7-10天，挑取單個克隆，培養擴增鑑定，選出陽性克隆並誘導分化成為心肌細胞。
結果，轉染篩選得到7個獨立克隆，挑選其中的兩個(克隆19和克隆20)做體外誘導分化實驗。NCX1-EGFP ES細胞系可以在分化得到的心肌細胞中表達綠色螢光蛋白，檢測胚體中綠色螢光就可以檢測胚體中心肌細胞的比率。
如圖1所示，誘導分化第6天，第9天螢光顯微鏡下觀察，發現在類胚體的搏動區域有特異性的綠色螢光，分離培養的單個心肌細胞免疫組化染色發現綠色螢光和心肌特異性結構蛋白α-sarcomeric actin(肌漿網肌動蛋白α亞型)分布在共同的細胞中。
因此，可見NCX1啟動子驅動綠色螢光蛋白基因表達轉染ES細胞，得到表達心肌特異性綠色螢光蛋白表達的ES細胞系。
實施例3 ES細胞的低氧培養誘導分化將正常培養的ES細胞(轉染鈉鈣交換蛋白啟動子驅動綠色螢光蛋白(NCX1)基因後的ES細胞)做成懸滴以後，分成低氧處理組和正常對照組。
將低氧處理組細胞放入低氧培養箱中培養(Thermo Forma)，培養條件為3％O2，5％二氧化碳，，持續培養48小時(2天)，而正常對照組細胞在21％O2，5％CO2條件下培養，懸滴培養結束後，兩組細胞都在正常氧濃度條件下培養。
實施例4 ES細胞向心肌細胞分化率的統計a.測定陽性胚體數將分化的類胚體接種到24孔板中，然後開始觀察類胚體中的跳動情況，有自主搏動心肌細胞的類胚體記為陽性胚體，每天觀察得到陽性胚體佔總胚體個數的百分率，得到ES細胞向心肌細胞分化的曲線(profile)。
結果如圖2，可見與正常條件培養組相比，低氧培養組有更大比例的類胚體中有搏動的心肌細胞。
b.測定螢光面積含有NCX1-EGFP基因的ES細胞誘導分化後，有自主搏動出現的類胚體在螢光顯微鏡(Leica)下觀察其綠色螢光的表達和分布並拍照，從照片上的綠色螢光面積的來鑑定單個類胚體中心肌細胞的比率。
結果如圖3所示，在單個類胚體中，相對於正常條件培養組，低氧處理組類胚體中有更多的綠色螢光，這就意味著低氧培養過的胚體中有更大比例的心肌細胞。
實施例5心肌細胞的免疫細胞化學染色從類胚體中分離出來的單個心肌細胞用4％多聚甲醛固定後用，0.1％Triton破膜，用10％羊血清封閉，然後加入0.1％的抗α-sacromeric actin(購自SIGMA，鼠源)，4℃過夜，接著加入二抗5％TRITC標記山羊抗小鼠IgG二抗(anti-mouseTRITC-conjugated，購自Santa Cruz公司)，室溫下放置1小時，螢光顯微鏡下檢測。
實施例6心肌特異性轉錄因子和結構基因表達的RT-PCR檢測分化不同天數的類胚體收集用於提取總RNA，然後利用Superscript II(購自Invitrogene)做逆轉錄，逆轉錄的產物當作模板做PCR，檢測低氧處理對不同基因表達的影響。各種引物的序列以及PCR的擴增條件分別如下NKX2.5正向引物(Sense)gCC AAC AgC AAC TTC gTg A(SEQ ID NO1)；反向引物(Antisense)CCg gTC CTA gTg Tgg AAT C(SEQ ID NO2)；94℃ 30s，58℃ 40s，72℃ 40s，35個循環。
MEF2C正向引物(Sense)AgA TAC CCA CAA CAC ACC A(SEQ ID NO3)；反向引物(Antisense)ATC CTT CAg AgA gTC gCA T(SEQID NO4)；94℃ 40s，60℃ 40s，72℃ 40s，35個循環。
MLC-2v正向引物(Sense)TGT GGG TCA CCT GAG GCT GTG GTT CAG(SEQ ID NO5)；反向引物(Antisense)GAA GGC TGA CTA TGT CCG GGA GAT GC(SEQ IDNO6)；94℃ 40s，57℃ 40s，72℃ 40s，29個循環。
aMHC正向引物(Sense)GCA GAC CAT CAA GGA CCT，(SEQ ID NO7)；反向引物(Antisense)GTT GGC CTG TTC CTC CGC C；(SEQ ID NO8)；94℃ 40s，57℃ 40s，72℃ 40s，33個循環。
M28s正向引物(Sense)AgC AgC CgA CTT AgA ACT gg (SEQ IDNO9)；
反向引物(Antisense)TAg ggA CAg Tgg gAA TCT Cg(SEQ IDNO10)；94℃ 40s，57℃ 40s，72℃ 40s，21個循環。
RT-PCR實驗檢測心肌特異性基因表達的結果見圖4，心肌特異性的轉錄因子NKX2.5，MEF2C，心肌特異性結構蛋白MLC-2v，RyR2，低氧培養組類胚體中上述基因的表達顯著上調，說明相對於正常培養條件，低氧處理的類胚體中有更大比例的心肌細胞。
實施例7分化得到心肌細胞的純化利用轉入NCX1-EGFP基因(即前面實施例2中鈉鈣交換蛋白基因啟動子驅動下的EGFP基因)的ES細胞誘導分化，用0.25％胰酶消化低氧處理過分化到第8天的類胚體，37℃ 6分鐘，每隔2分鐘敲打一次，消化結束後加入培養液，離心收集細胞，棄上清，用培養液重懸，得到單細胞懸液。
利用BD公司FaCSAria流式細胞儀分選出有綠色螢光蛋白表達的細胞，即得到純化的心肌細胞。
實施例8培養心肌細胞的裝置一種培養心肌細胞的培養箱，該培養箱包括一個箱體和一個箱門，所述的箱體中包括氮氣供給裝置，氧氣排出裝置，以及含氧量檢測裝置；其中，所述的氮氣供給裝置和氧氣排出裝置調節箱體內的氧氣含量，使得氧氣在氣體中的含量為3±1體積百分比。
培養小鼠R1 ES細胞時，打開箱門，將處於分化早期的胚胎幹細胞培養物置於箱體內部，調節氮氣供給裝置和氧氣排出裝置，調節氧氣含量，使氧氣在氣體中的含量為3±1體積百分比。
總結綜上所述，在本發明的實施例中，通過分化時程，心肌特異性螢光表達，心肌特異性基因表達水平等指標的檢測，證實低氧能夠有效的體外誘導胚胎幹細胞向心肌細胞的分化。低氧作為一種新的誘導胚胎幹細胞體向心肌細胞的分化幹預手段，有望為心肌梗塞的幹細胞臨床治療提供更多的細胞來源。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表110中國科學院上海生命科學研究院120一種促進胚胎幹細胞向心肌細胞分化的方法13006060516010170PatentIn version 3.3210121119212DNA213人工序列220
221misc_feature223引物4001gccaacagca acttcgtga 19210221119212DNA213人工序列220
221misc_feature223引物4002ccggtcctag_tgtggaatc 19210321119212DNA213人工序列220
221misc_feature223引物4003
agatacccac aacacacca19210421119212DNA213人工序列220
221misc_feature223引物4004atccttcaga gagtcgcat19210521127212DNA213人工序列220
221misc_feature223引物4005tgtgggtcac ctgaggctgt ggttcag 27210621126212DNA213人工序列4006gaaggctgac tatgtccggg agatgc26210721118212DNA213人工序列220
221misc_feature223引物4007
gcagaccatc aaggacct18210821119212DNA213人工序列220
221misc_feature223引物4008gttggcctgt tcctccgcc 19210921120212DNA213人工序列220
221misc_feature223引物4009agcagccgac ttagaactgg 202101021120212DNA213人工序列220
221misc_feature223引物40010tagggacagt gggaatctcg 20
權利要求
1.一種促進胚胎幹細胞向心肌細胞分化的方法，其特徵在於，包括步驟(a)在低氧環境中，培養胚胎幹細胞48±24小時，得到第一培養物；(b)在常氧環境中，繼續培養第一培養物120±24小時，得到第二培養物，在第二培養物中心肌細胞佔所有細胞的10-15％；並且，所述的低氧環境是氣體環境，其中含有3±1體積百分比的氧氣；所述的常氧環境條件是氣體環境，其中含有21±1體積百分比的氧氣。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的胚胎幹細胞選自未分化的胚胎幹細胞、或分化早期的胚胎幹細胞。
3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述的分化早期為胚胎幹細胞開始分化起的0-48小時。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的低氧環境含有3±0.5體積百分比的氧氣；或者，所述的常氧環境含有21±0.5體積百分比的氧氣。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的胚胎幹細胞為哺乳動物的胚胎幹細胞。
6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述的哺乳動物選自人、鼠、或猴。
7.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，在低氧環境中，培養胚胎幹細胞48±12小時；或者在常氧環境中，繼續培養第一培養物120±12小時。
8.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，在步驟(a)和步驟(b)中，培養條件是37±1℃，5±0.5％CO2。
9.一種製備心肌細胞的方法，其特徵在於，包括步驟(a)在低氧環境中，培養胚胎幹細胞48±24小時，得到第一培養物，(b)在常氧環境中，繼續培養第一培養物120±24小時，得到第二培養物，在第二培養物中心肌細胞佔所有細胞的10-15％，(c)從第二培養物中分離出心肌細胞；並且，所述的低氧環境是氣體環境，其中含有3±1體積百分比的氧氣；所述的常氧環境條件是氣體環境，其中含有21±1體積百分比的氧氣。
10.一種用於培養心肌細胞的裝置，其特徵在於，所述的裝置包括一個封閉的箱體，以及位於箱體上的箱門，所述的箱體中包括氮氣供給裝置，氧氣排出裝置，以及含氧量檢測裝置，其中，所述的氮氣供給裝置和氧氣排出裝置調節箱體內的氧氣含量，使得氧氣在氣體中的含量為3±1體積百分比。
全文摘要
本發明公開了一種促進胚胎幹細胞向心肌細胞分化的方法，包括將胚胎幹細胞培養物置於低氧環境中，培養適當的時間。本發明首次將低氧處理技術用於胚胎幹細胞向心肌細胞的定向誘導，從而可明顯提高心肌細胞的獲得率，並且，採用本發明的低氧處理技術，條件易於控制、操作簡單、成本低廉。
文檔編號C12N5/08GK101074428SQ20061002657
公開日2007年11月21日 申請日期2006年5月16日 優先權日2006年5月16日
發明者楊黃恬, 王嶸 申請人:中國科學院上海生命科學研究院