一種藥用天然產物的硬紫草轉基因毛狀根株系及其製備方法
2023-05-16 07:21:06 2
一種藥用天然產物的硬紫草轉基因毛狀根株系及其製備方法
【專利摘要】本發明屬於植物生物【技術領域】，具體涉及一種藥用天然產物的硬紫草轉基因毛狀根株系及其製備方法。該株系首先通過克隆一個硬紫草中的關鍵轉錄因子基因(LeMYC)並構建其植物過表達載體，然後將該載體轉入髮根農桿菌ATCC15834後，侵染硬紫草的無菌苗而獲得。該轉基因株系所產紫草寧及其衍生物的含量是直接用ATCC15834侵染硬紫草無菌苗所獲得的毛狀根株系的3.37倍。同時，該株系易於繁殖、生長迅速。本發明不僅可有效解決我國野外硬紫草資源日益短缺、人工栽培周期長、受氣候及地理條件等因素制約問題，並且可高效大量生產硬紫草藥用天然產物。該高產株系將為利用硬紫草毛狀根工廠化生產硬紫草藥用天然產物提供材料支撐，具有廣闊的開發應用前景。
【專利說明】一種藥用天然產物的硬紫草轉基因毛狀根株系及其製備方 法
【技術領域】
[0001] 本發明屬於植物生物【技術領域】，具體涉及一種藥用天然產物的硬紫草轉基因毛狀 根株系及其製備方法。
【背景技術】
[0002] 紫草屬紫草科多年生草本植物，為藥典收載臨床常用傳統中藥。1990年以後的 《中華人民共和國藥典》中收錄了紫草科（Boraginaceae)3種植物，即軟紫草屬（Arnebia Forsk)的新疆紫草[A. euchroma (Royle) Johnst.]，主產地為新疆；蒙紫草（黃花軟紫 草，A. guttata Bunge)，分布於我國西北至華北地區；紫草屬（Lithospermum)的硬紫草 (Lithospermum erythrorhizon)，在我國分布車交廣。漬紫草（Onosma paniculatum Bur. et Franch)在雲南也常作紫草入藥。
[0003] 紫草的活性成分主要分布於根，因而藥用價值最高，被稱為綠色黃金，成為行銷海 內外的"道地藥材"，其主要活性成分紫草素亦稱紫草寧及其衍生物為萘醌類化合物，具有 抗免疫缺血、抗腫瘤，治療風溼性關節炎、多硬化症、愛滋病、過敏性紫癜、銀肩病以及保肝 護肝、降血糖、降血粘度、降壓、解熱、鎮痛止痛等功效；多糖能增強機體特異性和非特異性 免疫能力；紫草油具有治療燒傷、燙傷、急慢性膿耳、口腔潰瘍、褥瘡、痔瘡、急慢性溼瘮以及 促進傷口癒合等功效；紫草色素具有抗真菌作用，可作為生物毒素用於番茄葉黴病的防治。 此外紫草素還可作為天然色素，被聯合國食品添加劑法典委員會列入食品、化妝品、藥品添 加劑範圍，廣泛用於化妝品、防曬製品（如塑料製品）、食品、藥品等著色以及印染、洗滌劑 的添加劑等，被國際譽為紅色素之王。紫草根油可直接入藥，製成軟膠囊可達藥用標準，籽 油具降糖、降壓、降血脂等功效，還可作工業用油。因此，紫草已逐漸成為醫療、食品色素和 化妝品及防病治病開發新藥研宄的熱點。
[0004] 隨著現代生物技術的發展，採用植物基因工程技術生產並提高人類所需的紫草 寧，成為一種非常重要的替代手段。上世紀70年代，日本即已成功運用兩階段培養體系，即 在光照條件下B5固體培養基上繁殖紫草細胞，然後在黑暗條件下利用M9液體生產培養基 中培養紫草細胞進行工業化生產紫草寧。然而在植物細胞培養過程中普遍存在細胞系不穩 定細胞生長緩慢，不耐剪切及代謝物產量低等問題又成為其實現規模化生產的瓶頸。
[0005] 紫草毛狀根體系的建立可為大量生產天然活性物質提供有效的手段。髮根農桿菌 (Agrobacteriumrhizogenes)是屬於根瘤菌科農桿菌屬革蘭氏陰性菌，能侵染絕大多數雙 子葉植物和少數單子葉植物誘發被侵染植物受傷部位產生毛狀根。髮根農桿菌之所以具有 這種致根特性是由於它具有能誘導毛狀根產生的Ri質粒，Ri質粒是髮根農桿菌染色體外 的一個大質粒，帶有冠癭鹼合成基因和生長素合成基因。毛狀根培養是較細胞培養產生天 然產物具有更優越的實驗材料。此外，由於髮根農桿菌攜帶的Ri質粒能將外源基因整合到 寄主染色體、其誘導產生的毛狀根易獲得再生植株等優點，因此，建立特定植物的轉基因毛 狀根體系，提高毛狀根中次生代謝物的產量，在定向植物分子育種方面具有廣泛應用前景。 近年來利用髮根農桿菌已轉化大約160多種植物，在40多種植物建立了毛狀根培養體系， 特別是一些藥用植物建立了毛狀根轉基因體系，極大地方便了藥用天然產物生產及遺傳育 種研宄。
[0006] 具有bHLH結構域的MYC蛋白是調節植物次生代謝物合成的一類重要轉錄因子，通 常又稱bHLH轉錄因子。它們在調節玉米、擬南芥、各種觀賞植物及園藝植物花青素的生物 合成方面具有重要作用。如玉米中編碼bHLH轉錄因子的基因R1具有調節穀粒糊粉層著色， 調節花葯及胚芽鞘著色功能。擬南芥中參與調控花青素合成的bHLH蛋白主要包括TT8、GL3 和EGL3,通過調節花青素原代謝途徑中的DFR和ANS/LDOX的表達而促進花青素原的合成。 各種觀賞植物及園藝植物花青素的合成也是受bHLH轉錄因子調控的，如非洲菊（Gerbera hybrida) GMYC1編碼的bHLH蛋白調節花冠和心皮中DFR的表達促進花青素的合成。bHLH 蛋白通常與R2R3類MYB轉錄因子和WD40蛋白形成轉錄複合體MBW共同調節花青素代謝途 徑中各種酶基因的表達，進而促進花青素等苯丙素類化合物的合成。
[0007] 本課題組在前期工作中對在M9培養基上生產紫草寧及其衍生物的紫草細胞轉錄 組深度測序發現一個高豐度的具有編碼bHLH結構域的轉錄本，結合文獻的相關報導，我們 推測bHLH轉錄因子可能在紫草寧及其衍生物的合成調節方面具有重要作用。
[0008] 通過轉基因技術將紫草本身的MYC基因轉入紫草中過表達，提高紫草毛狀根中紫 草寧的含量，從中篩選出高產藥用天然產物的硬紫草轉基因毛狀根株系，在理論上是完全 可行的。
[0009] 通過轉基因技術獲得高產藥用天然產物的紫草毛狀根株系，不僅在系統研宄紫草 藥用天然產物生物合成途徑及其分子調控機制方面具有重要的理論意義，並在商業化生產 紫草藥用天然產物方面具有非常重要的應用前景和價值。儘管目前國內外有利用毛狀根為 材料對紫草寧合成調控進行的相關研宄，但並無將紫草bHLH類MYC蛋白的相關基因轉入發 根農桿菌，誘導出能高效合成紫草藥用天然產物的紫草轉基因毛狀根並藉此提高紫草寧合 成的相關報導。
【發明內容】
[0010] 本發明需要解決的問題是通過轉基因技術獲得一個高產藥用天然產物的硬紫草 轉基因毛狀根株系及其製備方法。本發明根據實驗室前期M9培養基上生產紫草寧及其 衍生物的紫草細胞轉錄組深度測序信息，通過RACE技術（rapid amplification of cDNA ends)克隆出具有bHLH結構域的LeMYC轉錄因子基因（基因登錄號N0.KC818627)，將所選 擇的LeMYC基因構建植物過表達載體並轉入髮根農桿菌，然後侵染硬紫草無菌苗，高效誘 導出含目的基因LeMYC的硬紫草毛狀根株系，對獲得的轉基因毛狀根擴大培養並進行分子 鑑定和藥用天然產物含量檢測。
[0011] 本發明所述硬紫草轉基因毛狀根株系的製備方法包括如下步驟：
[0012] (1)提取在M9紫草寧色素生產培養基上紫草細胞總RNA並反轉錄為cDNA作為模 板，根據實驗室前期M9培養基上生產紫草寧及其衍生物的紫草細胞轉錄組深度測序信息 設計引物，通過RACE技術克隆出具有bHLH結構域的LeMYC轉錄因子基因的全長序列。高 保真酶擴增目的基因LeMYC，將獲得的目的片段與真核表達載體pEGAD-eGFP (購自北京天 根生化科技有限公司）連接，將連接產物用凍融法轉化髮根農桿菌ATCC15834(購自北京中 國農業微生物菌種保藏管理中心）感受態細胞；挑取陽性克隆。
[0013] (2)將硬紫草種子表面清洗乾淨，低溫浸泡在自來水中兩天，此間換水2-3次，然 後用溼砂和種子混勻後放入4°C冰箱層積處理1個月左右，種子出芽後，用自來水衝洗掉沙 子，用0. 1 %升汞消毒發芽的種子5分鐘，然後用無菌水衝洗5-7次，將水空幹接種在1/2MS 無激素的固體培養基上於25°C，16小時光照8小時暗培養2周。待幼苗長至2-4cm高度並 伸展出第2-3對真葉時用作被侵染材料。
[0014] (3)轉基因侵染菌液製備：挑取陽性克隆菌落，用YEB液體培養基擴增至0D600 = 0. 8時，添加乙醯丁香酮（AS)，作為轉基因侵染菌液。
[0015] (4)針刺莖節法誘導硬紫草轉基因毛狀根：用無菌針浸蘸上述活化的具有侵染特 性的菌液，用針尖穿刺硬紫草幼苗的第1-2對真葉的莖節處，針尖每浸蘸菌液一次，穿刺莖 節處一下，共穿刺2-3次。然後將侵染的幼苗轉移到MS固體培養基上於25°C弱散射光培 養。針刺一周左右即可發現侵染部位出現白色突起，隨後在侵染部位的白色突起首先變成 絨毛狀，然後長出一條或多條白色的毛狀根。將誘發的毛狀根從侵染點部位剪切下來，培養 在含有頭孢黴素500mg/L的B5培養基上，每周轉接一次，直至除完菌後，移到不含抗生素B5 培養基上培養。
[0016] (5)硬紫草轉基因毛狀根的培養：將徹底除菌的毛狀根轉入B5固體培養基擴大培 養；將固體擴大培養的毛狀根轉入B5液體培養基擴大培養。
[0017] (6)轉基因毛狀根分子鑑定：取野生型和預計為轉基因毛狀根材料提取其DNA作 為模板，運用PCR方法同時檢測農桿菌Ri質粒中RolC基因和35S-eGFP-LeMYC融合基因， 判斷是否為硬紫草轉基因毛狀根。
[0018] (7)紫草寧合成及測定：將鑑定的轉基因紫草毛狀根經B5液體生長培養15天後 轉入M9生產紫草寧液體培養基，置於26°C黑暗培養，一周後紫草寧含量即可達到很高濃 度；用石油醚浸泡紫草毛狀根及含有紫草寧的M9液體，提取紫草寧，紫外分光光度計測定 紫草寧含量，以野生型紫草毛狀根（只用不含外源基因的ATCC15834侵染而獲得的硬紫草 毛狀根）為對照，計算轉基因毛狀根中紫草寧含量變化。
[0019] 本發明與現有技術相比，其有益效果是：
[0020] 如前所述，野生紫草資源的日益匱乏及缺乏真正高效的人工合成紫草寧的培養體 系，已經成為紫草寧藥用研宄及大量商業化應用的一個制約因素。至今未見通過誘導出轉 入LeMYC基因的毛狀根，藉此提高紫草寧合成產量的相關文獻報導。本發明首次將一個紫 草bHLH類MYC家族蛋白的關鍵轉錄因子基因LeMYC轉入植物表達載體，將該載體轉入髮根 農桿菌後再轉入紫草無菌苗，誘導出紫草轉基因毛狀根；獲得的硬紫草轉基因毛狀根中紫 草寧含量較野生型紫草毛狀根大大提高。該方法可克服紫草愈傷細胞誘導、培養困難，細胞 易於老化褐化、紫草寧產量不高、產量不穩定、夏季難產或不產紫草寧等諸多問題；解決了 利用愈傷細胞進行遺傳轉化存在的周期長，轉化效率偏低等問題，轉基因毛狀根誘導和繁 殖不受外界環境、季節和紫草花期等因素制約，大大提高紫草轉基因效率；轉入的LeMYC基 因有助於紫草藥用天然產物合成的分子調控機制研宄，對紫草功能基因鑑定和研宄及植物 分子育種具有重要指導意義，對其他轉基因困難的木本植物提供了可靠的借鑑方法；獲得 的轉基因毛狀根紫草寧高產株系，具有廣闊的開發應用前景和商業價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021] 圖1用RACE技術克隆LeMYC基因的全長序列
[0022] 圖2針刺莖節法誘導出的轉LeMYC基因的硬紫草毛狀根
[0023] 圖3轉基因毛狀根在B5固體培養基培養
[0024] 圖4轉基因毛狀根在B5液體培養基培養
[0025] 圖5轉LeMYC基因硬紫草毛狀根RolC基因，35S-eGFP-LeMYC融合基因檢測
[0026] 圖6轉基因毛狀根在M9液體培養基培養
[0027] 圖7轉基因毛狀根紫草寧及其衍生物含量測定及比較
【具體實施方式】
[0028] 實施例1、LeMYC基因全長序列克隆及載體構建
[0029] (l)LeMYC基因全長序列克隆：基於硬紫草細胞兩階段培養即在B5培養基上細 胞增殖生長和在M9培養基上生產紫草素，我們對M9細胞的轉錄組進行了深度測序發現 存在一條與MYC基因高度保守的cDNA片段，序列長度為1653bp。根據這一序列信息我們 設計了用於 3' RACE 與 5' RACE 的引物。3' RACE FI :TCTATGCTCTTAGAGCAGTAGITCC ;3' RACE F2 ：TTCAGCTCCACCAACATCGCGTGGG ；5'RACE FI ：AAAGTGCCTGACCCGGAAGCCCGG ；5'RACE F2 ： TTCTTGCTCAGCCATGAAGGCAGG.利用該引物和試劑盒中的相應引物進行末端巢式PCR擴增， 分別得到該基因的5'和3'的基因片段大小分別為483bp、480bp (圖1)，經克隆測序後得到 了該基因的全長序列命名為LeMYC，基因的0RF框為191 lbp，編碼636個胺基酸。
[0030] ⑵過表達載體構建：根據已克隆的紫草LeMYC 5'和3'序列設計克隆該基因 的全長序列引物 LeMYC-ORF-F :5' -ATGATGAACTTCTGGAACAATACTACACC-3' ；LeMYC-〇RF-R : 5' -TTAGGCAGTTTCGGCTACTCTTGATGTC-3'，高保真酶擴增目的片段；將獲得的目的片段切膠 回收，並與pEGAD-eGFP載體連接，構建pEGAD-eGFP-LeMYC質粒；將pEGAD-eGFP-LeMYC質粒 用凍融法轉化髮根農桿菌ATCC15834感受態細胞，挑取陽性克隆。
[0031] 實施例2、轉硬紫草LeMYC基因毛狀根的誘導
[0032] (1)硬紫草無菌苗培養：選取飽滿的硬紫草種子，無菌水清洗後置於4°C環境中 黑暗培養1-2個月，直至種子發芽；挑取剛發芽的種子，清水洗乾淨；用0. 1 %的升汞消毒 5min，再用無菌水清洗5-7次；置於MS基本培養基，26°C -28°C光照培養，獲得一定數量的 紫草無菌苗。一個月後，當紫草無菌苗長出兩片真葉後，作為誘導毛狀根的外植體。
[0033] (2)轉基因侵染菌液製備：將獲得的陽性克隆菌落，轉入YEB液體培養基，在 26-28°C，lOOrpm的搖床中擴增至0D600 = 0. 8時，添加100 y M的AS，作為轉基因侵染菌液。
[0034] (3)針刺莖節法誘導硬紫草轉基因毛狀根：用接種針蘸上述活化的具有侵染特性 的轉基因菌液，用針尖穿刺紫草無菌苗的莖節處，針尖每浸蘸菌液一次，刺莖節處一下，每 株共穿刺2-3次；將侵染的無菌苗轉移到MS固體培養基上於26°C黑暗培養。10-15天左右 即可發現侵染部位出現白色突起，2天後在侵染部位的白色突起長出絨毛狀根系，然後長出 一條或多條毛狀根（圖2);以不含外源基因的野生型ATCC15834菌液按照上述相同方法， 誘導出紫草野生型毛狀根，作為對照材料。
[0035] 實施例3、轉硬紫草LeMYC基因毛狀根的培養
[0036](1)毛狀根除菌培養：誘導出來的毛狀根經過一星期的生長，剪取長度約1cm的毛 狀根，轉入B5+500mg/L頭孢黴素的固體除菌培養基，再過一星期轉入B5+250mg/L頭孢黴 素，直至除去殘留的髮根農桿菌；將徹底除菌的毛狀根轉入B5固體培養基培養（圖3);
[0037] (2)毛狀根擴大培養：將固體擴大培養的毛狀根轉入B5液體培養基，lOOrpm的搖 床中光照擴大培養（圖4)。
[0038] 實施例4、轉硬紫草LeMYC基因毛狀根的鑑定
[0039] 取一定數量毛狀根，CTAB法提取毛狀根DNA為模板，設計檢測RolC與 35S-eGFP-LeMYC融合基因的引物分別為RolC-F:5' -ACAAGCCACTTCTGITTCCC-3' ；RolC-R: 5' -CAGCGACTGCAACCAGTTTA-3'，CaMV35S-F:5'-CACTATCCTTCGCAAGACCCT-3' ；LeMYC-R-115 7:5' -ATCTCCCCTTCACCTCCAAATACTG-3'用PCR方法擴增，擴增產物測序比對，檢測轉基因毛 狀根中農桿菌Ri質粒中RolC基因存在與否，隨機選取的3個擴大培養硬紫草毛狀根株系， 均檢測到RolC基因的存在，說明獲得的均為毛狀根；同時檢測35S-eGFP-LeMYC融合基因 (圖5)，表明用含有構建載體的髮根農桿菌侵染紫草獲得的毛狀根為轉基因毛狀根。
[0040] 實施例5、轉硬紫草LeMYC基因毛狀根紫草寧含量測定
[0041] (1)將驗證為轉入目的基因的轉基因硬紫草毛狀根及野生型毛狀根轉入M9液體 培養基，置於26°C、100rpm的搖床中黑暗培養，一周後紫草寧含量即可達到很高濃度（圖 6) 〇
[0042] (2)用石油醚浸泡紫草毛狀根及含有紫草寧的M9液體，提取紫草寧，紫外分光光 度計測定紫草寧含量，以野生型紫草毛狀根為對照，計算轉基因毛狀根中紫草寧含量含量 (圖7)。紫草寧含量總量包括紫草細胞或毛狀根和分泌到M9培養基中的紫草寧含量總和。 具體方法如下：稱取在M9培養體系中的毛狀根，並取含有分泌的紫草寧的M9培養基，用石 油醚浸泡，反覆提取紫草寧，直到提取液無色，合併提取液，紫外分光光度計測定0D520的 吸光值，由下列方程得到紫草寧含量：紫草寧含量（mg/gFW) = 41. 66X0D520X稀釋倍數。
[0043] (3)紫草寧含量測定顯示，所得到的這一個轉LeMYC基因的硬紫草毛狀根中紫草 寧含量比野生型毛狀根中的含量提高3. 37倍，而且該株系具有生長速度快、繁殖容易的特 點，適於商業化生產所用，命名為LeMYC-1ine-001。
【權利要求】
1. 一種藥用天然產物的硬紫草轉基因毛狀根株系，其特徵是硬紫草轉LeMYC基因毛狀 根株系。
2. 根據權利要求1所述藥用天然產物的硬紫草轉基因毛狀根株系的製備方法，其特徵 是由以下步驟構成： (1) 提取在M9紫草寧色素生產培養基上紫草細胞總RNA並反轉錄為cDNA作為模板，通 過RACE技術克隆出具有bHLH結構域的LeMYC轉錄因子基因的全長序列。高保真酶擴增目 的基因 LeMYC，將獲得的目的片段與真核表達載體pEGAD-eGFP連接，將連接產物用凍融法 轉化髮根農桿菌ATCC15834感受態細胞，挑取陽性克隆； (2) 將硬紫草種子表面清洗乾淨，低溫浸泡在自來水中兩天，此間換水2-3次，然後 用溼砂和種子混勻後放入4°C冰箱層積處理1個月，種子出芽後，用自來水衝洗掉沙子，用 0. 1 %升汞消毒發芽的種子5分鐘，然後用無菌水衝洗5-7次，將水空幹接種在1/2MS無激 素的固體培養基上於25°C，16小時光照8小時暗培養2周，待幼苗長至2-4cm高度並伸展 出第2-3對真葉時用作被侵染材料； (3) 轉基因侵染菌液製備：挑取陽性克隆菌落，用YEB液體培養基擴增至0D600 = 0. 8 時，添加乙醯丁香酮，作為轉基因侵染菌液； (4) 針刺莖節法誘導硬紫草轉基因毛狀根：用無菌針浸蘸上述活化的具有侵染特性的 菌液，用針尖穿刺硬紫草幼苗的第1-2對真葉的莖節處，針尖每浸蘸菌液一次，穿刺莖節處 一下，共穿刺2-3次，然後將侵染的幼苗轉移到MS固體培養基上於25°C弱散射光培養。針 刺一周即可發現侵染部位出現白色突起，隨後在侵染部位的白色突起首先變成絨毛狀，然 後長出一條或多條白色的毛狀根，將誘發的毛狀根從侵染點部位剪切下來，培養在含有頭 孢黴素500mg/L的B5培養基上，每周轉接一次，直至除完菌後，移到不含抗生素 B5培養基 上培養； (5) 硬紫草轉基因毛狀根的培養：將徹底除菌的毛狀根轉入B5固體培養基擴大培養， 將固體擴大培養的毛狀根轉入B5液體培養基擴大培養； (6) 轉基因毛狀根分子鑑定：取野生型和預計為轉基因毛狀根材料提取其DNA作為模 板，運用PCR方法同時檢測農桿菌Ri質粒中RolC基因和35S-eGFP-LeMYC融合基因，判斷 是否為硬紫草轉基因毛狀根； (7) 紫草寧合成及測定：將鑑定的轉基因紫草毛狀根經B5液體生長培養15天後轉入 M9生產紫草寧液體培養基，置於26°C黑暗培養，一周後紫草寧含量即可達到很高濃度，用 石油醚浸泡紫草毛狀根及含有紫草寧的M9液體，提取紫草寧，紫外分光光度計測定紫草寧 含量，以野生型紫草毛狀根即不含外源基因的ATCC15834侵染而獲得的硬紫草毛狀根為對 照，計算轉基因毛狀根中紫草寧含量變化。
【文檔編號】C12Q1/68GK104450772SQ201410657429
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月18日 優先權日:2014年11月18日
【發明者】楊永華, 趙胡, 戚金亮, 吳鳳瑤, 朱煜, 楊榮武, 龐延軍 申請人:南京大學