免疫抑制狀態雞用作測試藥物免疫增強作用的動物模型的製作方法

2023-05-16 22:00:51 4

專利名稱：免疫抑制狀態雞用作測試藥物免疫增強作用的動物模型的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用作測試藥物免疫增強作用的動物模型及其建立方法，屬生物技術領域。
背景技術：
在臨床應用中，一些化藥和中藥被認為對人及動物有免疫增強作用。由於缺乏一種可用來科學和客觀評價藥物的免疫增強作用的實驗體系，在申報新藥證書時，均不能提供必要的試驗數據。因此，迄今為止尚沒有一種具免疫增強作用的藥物或製劑被批准為正式藥品。免疫抑制狀態雞的實驗模型作為一種實驗系統可為檢測和評價對雞的免疫增強作用提供科學和客觀的實驗數據。這對新藥的開發和評價將會有很大的應用前景。

發明內容
本發明所涉及的設計原理對於免疫功能正常的人或動物來說，免疫功能的增強可能意味著病態，而用於治療目的的免疫增強性藥物，應是針對免疫功能低下的個體和群體。如能在雞群中建立起可控程度的免疫抑制狀態，就可用做測試藥物免疫增強作用的動物模型，這也就是本發明所要達到的目的。
建立免疫抑制狀態雞的實驗模型的原則方法 將用不同劑量的免疫抑制性病毒接種不同日齡、沒有特定母源抗體的雛雞，建立起不同程度免疫抑制狀態的雞群。對以上所建立的免疫抑制狀態的雞在1周、2周或3周齡時使用雞新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)、H5-AIV型或H9-AIV型的禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)製備的滅活油乳疫苗。在免疫後3、4和5周採血提取血清分別測定對NDV和H5-AIV和H9-AIV的血凝抑制(HI)抗體滴度，以此作為免疫功能狀態的客觀量化的指標。
本發明具體實施方案1 禽網狀內皮增生病毒(Avian Reticuloendotheliosis viruses，REV)感染免疫抑制狀態試驗1.1 REV的標準化為了保證病毒毒力的穩定性從而有效地控制感染雞群的免疫抑制狀態，本發明使用REV-C99株的傳染性克隆作為病毒的來源。在用該傳染性克隆DNA(可用基因工程的方法無限複製而且不會有明顯變異)轉染雞胚成纖維細胞產生病毒後，在雞胚成纖維細胞(CEF)上連續傳代不超過6代(該病毒已於2001年07月28日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.1429；專利申請號2005101262182)。
1.2雞群免疫抑制狀態的建立方法取沒有REV母源抗體的雞(SPF來源雞或經預先測定沒有REV母源抗體的雞)，分別在1、7、14日齡接種100、1000、10000個TCID50的REV-C99病毒，將可建立處於不同程度免疫抑制狀態的雞群作為動物模型；也可以用沒有J亞群雞白血病病毒(ALV-J)母源抗體的雞(SPF來源雞或經預先測定沒有CLV-J母源抗體的雞)，分別在1、7、14日齡接種1000、10000、100000個TCID50的NX0101株ALV-J病毒(張紀元等，J亞群白血病病毒NX0101株感染性克隆化病毒的構建及其致病性，微生物學報，2005，45437-440；Cui et al.，Reduced serologic response to Newcastle disease virus inbroiler chickens exposed to a Chinese field strain of subgroup J avian leukosis virus.Avian Diseases，2006，50191-195.)，建立起處於不同程度免疫抑制狀態的雞群作為動物模型。
1.3 REV感染建立免疫抑制狀態的檢測 以用對NDV、H5-AIV型或H5-AIV型滅活疫苗免疫雞隻後的HI抗體滴度為指標，可以客觀並可量化地確定REV感染雞群的免疫抑制狀態(程度)，結果見表1、表2、表3和表4。
表1 不同劑量REV感染對NDV HI抗體滴度的影響(Log2)

表中數字為平均數±標準差(樣本數)。
兩個不同大字母表示差異極顯著(p＜0.01)，不同字母表示差異顯著(p＜0.05)。
表2不同劑量REV感染對免疫雞H9-AIV HI抗體滴度的影響(Log2)

表中數字為平均數±標準差(樣本數)。
兩個不同大字母表示差異極顯著(p＜0.01)，不同字母表示差異顯著(p＜0.05)。
表3 REV感染對免疫雞AIV-H5 HI抗體滴度的影響(Log2)

兩個不同大字母表示差異極顯著(p＜0.01)，兩個不同小寫字母表示差異顯著(p＜0.05)，不同字母表示差異顯著(p＜0.05)。
表4 REV感染對SPF雞中樞免疫器官的影響(％)

兩個不同大字母表示差異極顯著(p＜0.01)，兩個不同小寫字母表示差異顯著(p＜0.05)，不同字母表示差異顯著(p＜0.05)。
由此建立的免疫抑制狀態的雞群，可作為用來判斷或評價藥物是否有免疫增強的實驗模型。
2 REV誘發免疫抑制狀態雞群作為測試免疫增強性藥物的動物模型的初步應用利用本發明建立的動物模型，根據對NDV或H5-AIV型和H9-AIV型的HI抗體滴度的差異，可以科學而又客觀地評價藥物的免疫增強作用。初步實驗的結果見表5。由表5可見，免疫抑制狀態的雞群使用藥物A可使對NDV和AIV的HI抗體水平顯著高於對照組，但在正常雞群，同樣該藥物無此作用。
表5不同藥物對不同健康狀態下雞的抗體水平的比較

B組雞在1日齡接種5000TCID50的REV-C99株，7日齡接種NDV和H5-AIV型滅活疫苗。在免疫後4、5、6周分別作檢測ND、H5-AIV的HI抗體水平3次。
A組雞未經REV感染，Al、A2和A3三組間抗體滴度無顯著差異，表明所用的二種藥物對正常雞不顯示任何免疫增強作用。
而經REV感染造成免疫抑制狀態的B1，B2和B3三組雞，對NDV和H5-AIV的HI抗體效價均顯著低於未經REV感染的雞。但是，經餵飼某種中藥浸劑的B2組，其HI抗體滴度顯著高於不餵藥的B1組或餵另一種藥物的B3組。這表明，該中藥浸劑對於處於免疫抑制狀態的雞，可顯示一定程度的免疫增強作用。
本發明的優點本發明利用雞免疫抑制病毒感染雞造成動物體可控的免疫抑制狀態，建立的動物模型，根據對NDV或H5-AIV型和H9-AIV型AIV的HI抗體滴度的差異，可以科學而又客觀地評價藥物的免疫增強作用。
權利要求
1.一種用於測試藥物免疫增強作用的動物模型，其特徵在於1)將用不同劑量的可穩定保持毒力水平的REV-C99株禽網狀內皮增生病毒接種不同日齡、沒有特定母源抗體的雛雞，建立起可控程度免疫抑制狀態的雞群；2)處於免疫抑制狀態的雞群作為動物模型，並以對雞新城疫滅活疫苗和禽流感滅活疫苗的血凝抑制抗體反應為指標，用以測定和評價特檢藥物的免疫增強作用。
2如權力要求1所述的用於測試藥物免疫增強作用的動物模型，其特徵在於用NX0101株J亞群雞白血病病毒(ALV-J)替代REV-C99株禽網狀內皮增生病毒感染雞建立起可控程度免疫抑制狀態的雞群。
全文摘要
本發明涉及一種用作測試藥物免疫增強作用的動物模型及其建立方法。用免疫抑制性病毒(如REV或ALV－J)誘發雞群的可控程度的免疫抑制狀態。以處於免疫抑制狀態的雞為動物模型作為一種實驗系統可為檢測和評價藥物對雞的免疫增強作用提供科學和客觀的實驗數據。這對新藥的開發和評價將會有很大的應用前景。
文檔編號A61K49/00GK1994471SQ20061016731
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月27日 優先權日2006年12月27日
發明者崔治中, 孫淑紅 申請人:山東農業大學