一種重組質粒和重組工程菌及其構建方法和應用與流程

2023-05-16 01:23:26 1

本發明涉及基因工程
技術領域：
，更具體的說是涉及一種重組質粒和重組工程菌及其構建方法和應用。
背景技術：
：微生物轉化法是利用微生物細胞產生的一種或者多種酶把一種化合物變成結構相關的更有經濟價值的產物，其本質是利用微生物本身所產生的酶對外源底物進行的催化反應。大腸桿菌表達系統是目前最常用的外源蛋白表達系統，大腸桿菌由於遺傳背景簡單，容易培養，以及由大量可供選擇的克隆載體與表達載體，使之成為人們克隆表達外源基因的主要菌株。甾體激素(steroidhormone)，包括腎上腺皮質激素和性激素，它是一類維持生命、保持正常生活、促進性器官發育、維持生育的重要生物活性物質。甾體激素藥物是指分子結構中含有甾體結構的激素類藥物，是臨床上一類重要的藥物，主要包括腎上腺皮質激素(adrenocorticohormones)和性激素(sexhormone)兩大類。皮質激素類藥物用於臨床的有醋酸可的松(cortisoneacetate)、氫化可的松(hydrocortisone)等。21-脫氧皮質醇(21-Deoxycortisol，4-Pregnene-11beta,17alpha-diol-3,20-dione，C21H30O4，分子量346.4605)是一種重要的甾體激素，同時也是一種重要的甾體激素合成的中間體，它是由17α-羥孕酮(17α-Hydroxyprogesterone，17alpha-Hydroxy-4-pregnene-3,20-dione，C21H30O3，分子量330.4611)11位被氧化成β構型的羥基而得到。目前還未有生物全合成或者生物轉化生成21-脫氧皮質醇的文獻及專利發表。因此，在大腸桿菌中將17α-羥孕酮生物轉化為21-脫氧皮質醇是一個非常具有前景的能夠運用於工業上的技術。技術實現要素：有鑑於此，本發明的目的在於提供一種重組質粒，使得所述重組質粒轉化到大腸桿菌中能夠將17α-羥孕酮生物轉化為21-脫氧皮質醇並具有較高產量，可應用於轉化生成21-脫氧皮質醇的重組工程菌的構建中。本發明的另一個目的在於提供一種重組工程菌，使得所述重組工程菌能夠將17α-羥孕酮生物轉化為21-脫氧皮質醇並具有較高產量，可應用於21-脫氧皮質醇的微生物轉化中。為實現上述發明目的，本發明提供如下技術方案：一種重組質粒，在基礎質粒上包括T7啟動子、T7終止子、11位β羥化酶基因CYP11B1、電子傳遞體基因Adx、電子傳遞體基因AdR，所述11位β羥化酶能基因CYP11B1、電子傳遞體基因Adx、電子傳遞體基因AdR位於T7啟動子和T7終止子之間。本發明將11位β羥化酶基因CYP11B1、電子傳遞體基因Adx、電子傳遞體基因AdR通過T7啟動子和終止子開啟表達，由此構建出重組質粒，利用該重組質粒轉化到工程菌中可實現將17α-羥孕酮生物轉化為21-脫氧皮質醇並具有較高產量。其中，作為優選，所述基礎質粒為pET21a質粒，其上包含T7啟動子和T7終止子，是一種商品化質粒，在構建時較為方便，本發明同時也可使用額外添加T7啟動子和T7終止子的其他適合質粒。在本發明的具體實施方式中，所述11位β羥化酶基因CYP11B1為人源(Homosapiens)、牛源(BosTaurus)、褐家鼠來源(Rattusnorvegicus)，羊源(Ovisaries)、袋獾來源(Sarcophilusharrisii)、狐蝠源(PteropusAlecto)或日本鬼傘科蘑菇來源(Coprinopsiscinereaokayama7#130)的野生型CYP11B1或突變型CYP11B1；為了方便表述，在本發明中可簡寫為Hs野生型或突變型CYP11B1、Rn野生型或突變型CYP11B1、Bt野生型或突變型CYP11B1、Oa野生型或突變型CYP11B1、Sh野生型或突變型CYP11B1、Pa野生型或突變型CYP11B1、Cc野生型或突變型CYP11B1。在本發明的具體實施方式中，所述電子傳遞體基因Adx、電子傳遞體基因AdR均為牛源(BosTaurus)基因。作為優選，上述突變型的各來源CYP11B1都將疏水端N端編碼23位的胺基酸突變成為了編碼親水性精氨酸的核苷酸序列，具體所述人源、牛源、褐家鼠來源，羊源、袋獾來源、狐蝠源以及日本鬼傘科蘑菇來源的突變型CYP11B1核苷酸序列依次如SEQIDNO:1-7所示；所述牛源Adx是編碼4到108位胺基酸的核苷酸序列，具體所述電子傳遞體基因Adx、電子傳遞體基因AdR核苷酸序列依次如SEQIDNO:8-9所示；上述各基因均適當規避常用限制性酶切位點後通過人工合成得到，在本發明具體實施方式中，為了改善轉入的大腸桿菌工程菌高效生物轉化效率，SEQIDNO:1-9所示核苷酸序列還經過大腸桿菌密碼子優化。同時，本發明根據所述重組質粒所能實現的技術效果提出了其在將17α-羥孕酮生物轉化為21-脫氧皮質醇中的應用和/或在製備將17α-羥孕酮生物轉化為21-脫氧皮質醇的工程菌中的應用；作為優選，所述工程菌為大腸桿菌，更優選地為MG1655(DE3)菌株，該菌株是MassachusettsInstituteofTechnology的KristalaL.J.Prather教授文章中發布的菌株(TsengHC,HarwellCL,MartinCH,etal.Biosynthesisofchiral3-hydroxyvaleratefromsinglepropionate-unrelatedcarbonsourcesinmetabolicallyengineeredE.coli[J].Microbialcellfactories,2010,9(1):1)，文中詳細記載了將市售MG1655大腸桿菌通過基因工程技術改造為一類能夠有效表達異源蛋白的菌株，統一命名為MG1655(DE3)。本發明還對應提供了所述重組質粒的構建方法，包括：將11位β羥化酶基因CYP11B1、電子傳遞體基因Adx、電子傳遞體基因AdR通過酶切方式連接到包含T7啟動子和T7終止子的基礎質粒上，所述11位β羥化酶能基因CYP11B1、電子傳遞體基因Adx、電子傳遞體基因AdR位於T7啟動子和T7終止子之間，獲得重組質粒。作為優選，所述構建方法包括：分別在11位β羥化酶基因CYP11B1、電子傳遞體基因Adx和電子傳遞體基因AdR5』端添加NdeI酶切位點、3』端添加SpeI酶切位點，然後分別將三個外源基因通過SpeI和NdeI酶切後，連入添加有SpeI酶切位點的pET21a質粒中，得到pET21a-CYP11B1質粒、pET21a-Adx質粒和pET21a-AdR質粒，所述SpeI酶切位點位於NdeI和BamHI酶切位點之間；將pET21a-CYP11B1質粒、pET21a-Adx質粒和pET21a-AdR質粒中任意兩個質粒分別進行XbaI和BamHI酶切獲得兩個目的基因，將兩個目的基因逐個與進行SpeI和BamHI酶切的剩餘質粒連接，獲得重組質粒。在上述構建方法中，本發明採用biobrick的構建策略，利用SpeI與XbaI是同尾酶，經過處理後會留下相同的粘性末端的特點，在T4連接酶的作用下將所需要的三個外源基因逐個連接到基礎質粒上，並且保證已連接的外源基因不受後續酶切影響。更為優選地，所述構建方法包括：分別在11位β羥化酶基因CYP11B1、電子傳遞體基因Adx和電子傳遞體基因AdR5』端添加核苷酸序列CAT、3』端添加核苷酸序列CTAGT，然後分別將三個外源基因通過SpeI和NdeI酶切後，連入添加有SpeI酶切位點的pET21a質粒中，得到pET21a-CYP11B1質粒、pET21a-Adx質粒和pET21a-AdR質粒，所述SpeI酶切位點位於NdeI和BamHI酶切位點之間；將pET21a-CYP11B1質粒和pET21a-AdR質粒分別進行XbaI和BamHI酶切獲得CYP11B1、AdR兩個目的基因，先將CYP11B1與進行SpeI和BamHI酶切的pET21a-Adx質粒連接，獲得pET21a-Adx-CYP11B1質粒，然後再將AdR與進行SpeI和BamHI酶切的pET21a-Adx-CYP11B1質粒連接，獲得重組質粒。根據所述重組質粒在製備將17α-羥孕酮生物轉化為21-脫氧皮質醇的工程菌中的應用，本發明提供了一種重組工程菌，其轉化有本發明所述重組質粒。作為優選，所述工程菌為大腸桿菌，更優選為MG1655(DE3)菌株。作為優選，上述重組工程菌還轉化有包含幫助外源表達蛋白正確摺疊的基因的質粒；更優選地，所述質粒為包含分子伴侶基因grdES和分子伴侶基因grdEL的質粒；在具體的實施方式中，該質粒選擇為pGro7質粒。將所述重組工程菌應用到17α-羥孕酮生物轉化為21-脫氧皮質醇中，其不但可以成功的生產出21-脫氧皮質醇，並且具有較高的產量，其中以人源和牛源的CYP11B1產量最高，野生型可達到60mg/(L*d)以上，突變型可達到180mg/(L*d)以上。因此，本發明提出了所述重組工程菌在將17α-羥孕酮生物轉化為21-脫氧皮質醇中的應用。對應的，所述重組工程菌的構建方法為將所述重組質粒轉化到工程菌中，轉化方法可採用本領域常規方法，例如電轉化法。此外，本發明還提供了一種將17α-羥孕酮生物轉化為21-脫氧皮質醇的方法，將所述重組工程菌接種至種子培養基活化培養，然後再轉接到發酵培養基中發酵培養，加入L-阿拉伯糖、IPTG、紅血素前體deta-氨基乙醯丙酸、氨苄青黴素誘導表達，然後收集細胞並清洗，將細胞重懸在包含17α-羥孕酮的磷酸緩衝液中進行生物轉化10-24h，從發酵液中分離提取21-脫氧皮質醇。更為具體地，將所述重組工程菌接種至種子培養基中在37℃、250rpm下活化培養14-16h，然後以初始菌體濃度OD600＝0.05轉接到發酵培養基中在37℃、250rpm下發酵培養至OD600＝0.6-0.8，加入4mg/mL的L-阿拉伯糖、1mM的IPTG、1mM紅血素前體deta-氨基乙醯丙酸，50μg/mL氨苄青黴素在27.5℃，200rpm下誘導表達21h，然後收集細胞並清洗，將細胞重懸在包含17α-羥孕酮的磷酸緩衝液中在27.5℃、170rpm下進行生物轉化10-24h，轉化完成後從發酵液中分離提取21-脫氧皮質醇。其中，所述種子培養基和發酵培養基均優選為每升蒸餾水中包含12g蛋白腖、24g酵母提取物、4mL甘油、4.62gKH2PO4、25gK2HPO4、50mg氨苄青黴素、50mg氯黴素的培養基。所述包含17α-羥孕酮的磷酸緩衝液優選為pH7.4，配製方法如下：6.98gK2HPO4，1.35gKH2PO4溶解於1L的蒸餾水中，加入40mL甘油、50μg/mL氨苄青黴素、50μg/mL氯黴素4mg/mL的L-阿拉伯糖、1mM的IPTG、1mM紅血素前體deta-氨基乙醯丙酸、0.72mg/mL的17α-羥孕酮。由以上技術方案可知，本發明為17α-羥孕酮生物轉化為21-脫氧皮質醇提供優化的外源基因，選取多種來源的11位β羥化酶基因CYP11B1以及電子傳遞體基因Adx、電子傳遞體基因AdR，整合至T7啟動子和終止子基礎質粒上，構建出的重組質粒轉化至工程菌中能夠實現21-脫氧皮質醇的高產。附圖說明圖1所示為商品化質粒pGro7(A圖)和pET21a(B圖)圖譜；圖2所示為添加有SpeI酶切位點的pET21a質粒圖譜；圖3所示為商品化質粒pUC57圖譜；圖4-6所示為本發明所述重組質粒構建流程示意圖；圖7所示為各種來源的突變型CYP11B1重組大腸桿菌的搖瓶發酵試驗柱形圖；圖8所示為各種來源的野生型CYP11B1重組大腸桿菌的搖瓶發酵試驗柱形圖。具體實施方式本發明公開了一種重組質粒和重組工程菌及其構建方法和應用，本領域技術人員可以借鑑本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明所述產品、方法和應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
發明內容、精神和範圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。在本發明中所涉及的一些質粒載體、菌株均可市售獲得，如pET21a質粒可購自Takara，質粒圖譜見圖1，在其基礎上添加有SpeI酶切位點的pET21a質粒圖譜見圖2；菌株MG1655可購自ATCC；質粒pGro7可購自Takara，質粒圖譜見圖1；在全合成本發明所需要的各外源基因過程中，需要將其連接到質粒載體上保存，在本發明具體實施方式中採用pUC57質粒，可購自Takara，質粒圖譜見圖3。下面結合實施例，進一步闡述本發明。實施例1：重組質粒的構建全合成β羥化酶基因CYP11B1、電子傳遞體基因Adx和電子傳遞體基因AdR，同時分別在11位β羥化酶基因CYP11B1、電子傳遞體基因Adx和電子傳遞體基因AdR5』端添加核苷酸序列CAT、3』端添加核苷酸序列CTAGT連接到pUC57質粒中保存，然後分別將三個外源基因通過SpeI和NdeI酶切後，連入添加有SpeI酶切位點的pET21a質粒中，得到pET21a-CYP11B1質粒、pET21a-Adx質粒和pET21a-AdR質粒，所述SpeI酶切位點位於NdeI和BamHI酶切位點之間；將pET21a-CYP11B1質粒和pET21a-AdR質粒分別進行XbaI和BamHI酶切獲得CYP11B1、AdR兩個目的基因，先將CYP11B1與進行SpeI和BamHI酶切的pET21a-Adx質粒連接，獲得pET21a-Adx-CYP11B1質粒，然後再將AdR與進行SpeI和BamHI酶切的pET21a-Adx-CYP11B1質粒連接，獲得重組質粒(構建流程圖見圖4-6)。上述構建的質粒轉化入大腸桿菌感受態DH5α中，菌落PCR篩選，提質粒進行單、雙酶切驗證以及測序驗證，以確保目的片段連接正確且鹼基序列未發生突變。實施例2：重組大腸桿菌的構建將質粒pGro7(含有分子伴侶基因grdES和grdEL，能夠幫助外源表達蛋白的正確摺疊)通過電轉化法導入到大腸桿菌MG1655(DE3)中，轉化後採用LB+Cmr平板(瓊脂粉15g/L，NaCl10g/L，蛋白腖10g/L，酵母提取物10g/L，氯黴素38μg/L)進行篩選。在平板上挑出單菌落後，接種到LB+Cmr液體培養基(NaCl10g/L，Pepone10g/L，Yeastextract10g/L，氯黴素38μg/L)中進行培養，並保存甘油菌，命名為MG1655(DE3)-pGro7。將MG1655(DE3)-pGro7菌株做成電轉感受態，將按照實施例1方法構建的重組質粒導入感受態細胞中，轉化後採用LB+Cmr+Ampr平板(瓊脂粉15g/L，NaCl10g/L，Pepone10g/L，Yeastextract10g/L，氯黴素38μg/L，氨苄青黴素100μg/L)進行篩選。篩選平板上的單菌落，獲得重組大腸桿菌。實施例3：重組大腸桿菌的21-脫氧皮質醇搖瓶發酵種子培養基：12g蛋白腖、24g酵母提取物、4mL甘油、4.62gKH2PO4、25gK2HPO4、50mg氨苄青黴素、50mg氯黴素溶解於1L的蒸餾水中；發酵培養基：12g蛋白腖、24g酵母提取物、4mL甘油、4.62gKH2PO4、25gK2HPO4、50mg氨苄青黴素、50mg氯黴素溶解於1L的蒸餾水中。將按照實施例2構建的重組菌株接種於5mL種子培養基中，在37℃、250rpm培養14-16h，以初始菌體濃度OD600＝0.05分別接種於50mL發酵培養基中，於37℃、250rpm條件下培養至OD600＝0.6-0.8，加入4mg/mL的L-阿拉伯糖、1mM的IPTG、1mM紅血素前體deta-氨基乙醯丙酸，50μg/mL氨苄青黴素誘導分子伴侶蛋白和CYP11B1及其電子傳遞體蛋白表達。27.5℃，200rpm蛋白表達21h後，8000rpm，1min收集細胞，將細胞用4℃無菌PH＝7.4的磷酸緩衝液(6.98gK2HPO4，1.35gKH2PO4溶解於1L的蒸餾水中，121℃，20min滅菌)清洗2遍，將細菌重懸在50mL無菌PH＝7.4的磷酸緩衝液(6.98gK2HPO4，1.35gKH2PO4溶解於1L的蒸餾水中，加入40mL甘油、50μg/mL氨苄青黴素、50μg/mL氯黴素4mg/mL的L-阿拉伯糖、1mM的IPTG、1mM紅血素前體deta-氨基乙醯丙酸)中，27.5℃170rpm培養24h。底物的添加方法：將17α-羥孕酮溶解於50％β-環糊精(將500gβ環糊精溶解於1L蒸餾水)中，配成36mg/mL的母液，每50mL磷酸緩衝液中加入1mL底物母液。實施例4：人源突變型CYP11B1重組大腸桿菌的搖瓶發酵試驗外源基因：Hs突變型CYP11B1(SEQIDNO:1)、牛源Adx(SEQIDNO:8)、牛源AdR(SEQIDNO:9)；將上述外源基因按照實施例1-3的方法構建獲得人源突變型CYP11B1重組大腸桿菌，命名為SyBE_Ec02040086，然後進行搖瓶發酵24h，以MG1655(DE3)菌株和MG1655(DE3)-pGro7菌株作為對照。產物提取及檢測方法：取10mL發酵液，用等體積的二氯甲烷萃取兩次，12000rpm、4℃離心5min，取下部萃取液5mL用純淨的氮氣吹乾，然後加入5mL二氯甲烷渦旋1min溶解，12000rpm、4℃離心5min，取上部無沉澱潔淨萃取液2mL用純淨的氮氣吹乾。用1mL甲醇溶解白色的析出物，用2μm濾膜過濾後上紫外液相檢測，21-脫氧皮質醇的檢測波長為450nm，結果見表1。表121-脫氧皮質醇產量菌株21-脫氧皮質醇產量SyBE_Ec02040086178.945mg/(L*d)MG1655(DE3)0MG1655(DE3)-pGro70由表1可以得知，轉化有本發明所述重組質粒的大腸桿菌能夠利用底物17α-羥孕酮，並將其生物轉化為21-脫氧皮質醇，且具有較高的產量，而未轉化質粒以及僅轉化有pGro7的菌株產量均為0。實施例5：各種來源的突變型CYP11B1重組大腸桿菌的搖瓶發酵試驗外源基因：Hs突變型CYP11B1、Bt突變型CYP11B1、Rn突變型CYP11B1、Oa突變型CYP11B1、Sh突變型CYP11B1、Pa突變型CYP11B1、Cc突變型CYP11B1(SEQIDNO:1-7)；牛源Adx(SEQIDNO:8)、牛源AdR(SEQIDNO:9)；另外，增加Sa突變型CYP11B1(鼩鼱來源，Sorexaraneus，SEQIDNO:10)、Mo野生型CYP11B1(稻瘟病菌來源，MagnaportheoryzaeP131，SEQIDNO:11)作為對照，其同樣在野生型基因序列基礎上將疏水端N端編碼23位的胺基酸突變成為了編碼親水性精氨酸的核苷酸序列，並經過大腸桿菌密碼子優化。將上述外源基因按照實施例1-2的方法構建獲得各種來源的突變型CYP11B1重組大腸桿菌，重複構建3次，每個來源的突變型CYP11B1重組大腸桿菌為3株，命名如下：MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-HsCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-BtCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-RnCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-OaCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-ShCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-SaCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-PaCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-CcCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-MoCYP11B1-Adx-AdR；然後按照實施例3的方法進行搖瓶發酵(將各來源的3株重組菌株分別進行，最後統計各來源重組菌株發酵結果的平均值)，結果見圖7。由圖7可知，各重組菌株中以人源突變型CYP11B1重組大腸桿菌以及牛源突變型CYP11B1重組大腸桿菌產量較高，而作為對照的Sa突變型CYP11B1重組大腸桿菌產量為0，Mo野生型CYP11B1重組大腸桿菌產量較低，表明並不是所有來源的CYP11B1經過突變優化均能夠實現高產量轉化目的。實施例6：各種來源的野生型CYP11B1重組大腸桿菌的搖瓶發酵試驗外源基因：Hs野生型CYP11B1、Rn野生型CYP11B1、Bt野生型CYP11B1、Oa野生型CYP11B1、Sh野生型CYP11B1、Sa野生型CYP11B1、Pa野生型CYP11B1、Cc野生型CYP11B1、Mo野生型CYP11B1；牛源Adx(SEQIDNO:8)、牛源AdR(SEQIDNO:9)；其中，Sa野生型CYP11B1、Mo野生型CYP11B1作為對照，並且經過大腸桿菌密碼子優化。將上述外源基因按照實施例1-2的方法構建獲得各種來源的野生型CYP11B1重組大腸桿菌，重複構建3次，每個來源的野生型CYP11B1重組大腸桿菌為3株，命名如下：MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-HswtCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-BtwtCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-RnwtCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-OawtCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-ShwtCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-SawtCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-PawtCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-CcwtCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-MowtCYP11B1-Adx-AdR；然後按照實施例3的方法進行搖瓶發酵(將各來源的3株重組菌株分別進行，最後統計各來源重組菌株發酵結果的平均值)，結果見圖8。由圖8可知，各重組菌株中以人源野生型CYP11B1重組大腸桿菌以及牛源突變型CYP11B1重組大腸桿菌產量較高，而作為對照的Sa野生型CYP11B1以及Mo野生型CYP11B1重組大腸桿菌產量均為0，表明並不是所有來源的CYP11B1均能夠實現轉化目的。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。SEQUENCELISTING天津大學一種重組質粒和重組工程菌及其構建方法和應用MP161635611PatentInversion3.311512DNA人工序列1atggcgctgcgtgcgaaagcggaagtgtgcatggcggttccgtggctgagcctgcaacgt60gcgcaagcgctgcgtacccgtgcggcgcgtgtgccgcgtaccgttctgccgtttgaagcg120atgccgcgtcgtccgggtaaccgttggctgcgtctgctgcaaatctggcgtgagcaaggc180tacgaagacctgcacctggaagtgcaccagaccttccaagaactgggtccgatttttcgt240tatgatctgggtggcgcgggcatggtgtgcgttatgctgccggaggacgtggaaaagctg300caacaagttgatagcctgcacccgcaccgtatgagcctggagccgtgggtggcgtaccgt360cagcaccgtggtcacaagtgcggcgtttttctgctgaacggtccggagtggcgtttcaac420cgtctgcgtctgaacccggaagtgctgagcccgaacgcggttcaacgttttctgccgatg480gtggacgcggttgcgcgtgatttcagccaggcgctgaagaaaaaggtgctgcaaaacgcg540cgtggtagcctgaccctggacgttcagccgagcatctttcactataccattgaggcgagc600aacctggcgctgttcggcgaacgtctgggtctggttggccatagcccgagcagcgcgagc660ctgaacttcctgcacgcgctggaagtgatgtttaagagcaccgttcagctgatgttcatg720ccgcgtagcctgagccgttggaccagcccgaaagtgtggaaggagcacttcgaagcgtgg780gactgcatctttcaatacggtgataactgcatccagaaaatttatcaagagctggcgttt840agccgtccgcagcaatacaccagcatcgttgcggagctgctgctgaacgcggaactgagc900ccggacgcgattaaggcgaacagcatggaactgaccgcgggcagcgtggataccaccgtt960ttcccgctgctgatgaccctgtttgagctggcgcgtaacccgaacgtgcagcaagcgctg1020cgtcaggaaagcctggctgcggcggcgagcattagcgagcacccgcaaaaagcgaccacc1080gaactgccgctgctgcgtgcggcgctgaaggaaaccctgcgtctgtatccggtgggtctg1140ttcctggaacgtgtggcgagcagcgacctggttctgcaaaactaccacatcccggcgggt1200accctggtgcgtgtttttctgtatagcctgggtcgtaacccggcgctgtttccgcgtccg1260gagcgttacaacccgcagcgttggctggatattcgtggtagcggccgtaacttttatcac1320gtgccgttcggttttggcatgcgtcagtgcctgggccgtcgtctggcggaggcggaaatg1380ctgctgctgctgcaccacgtgctgaaacacctgcaagttgaaaccctgacccaagaagat1440atcaagatggtttacagcttcattctgcgtccgagcatgttcccgctgctgacctttcgt1500gcgatcaactaa151221512DNA人工序列2atggcgctgtgggcgaaagcgcgtgtgcgtatggcgggtccgtggctgagcctgcatgaa60gcgcgtctgctgcgtacccgtggtgcggcggcgccgaaagcggttctgccgtttgaggcg120atgccgcgttgcccgggtaacaagtggatgcgtatgctgcaaatctggaaagagcaaagc180agcgaaaacatgcacctggacatgcaccagaccttccaagaactgggcccgatttttcgt240tacgatgtgggtggccgtcacatggtgttcgttatgctgccggaggacgttgaacgtctg300caacaagcggatagccaccacccgcagcgtatgatcctggagccgtggctggcgtatcgt360caagcgcgtggtcacaagtgcggcgtgtttctgctgaacggtccgcagtggcgtctggac420cgtctgcgtctgaacccggatgttctgagcctgccggcgctgcaaaagtacaccccgctg480gttgacggcgttgcgcgtgatttcagccagaccctgaaagcgcgtgtgctgcaaaacgcg540cgtggtagcctgaccctgggtcaccgtgcgcagctgtttcgttacaccatcgaagcgagc600accctggttctgtatggcgagcgtctgggcctgctgacccagcaaccgaacccggacagc660ctgaacttcattcacgcgctggaagcgatgctgaagagcaccgtgcagctgatgtttgtt720ccgcgtcgtctgagccgttggatgagcaccaacatgtggcgtgagcacttcgaagcgtgg780gattacatctttcaatatgcgaaccgtgcgatccagcgtatttaccaagaactggcgctg840ggtcacccgtggcactatagcggcattgtggcggagctgctgatgcgtgcggacatgacc900ctggataccatcaaagcgaacaccattgacctgaccgcgggtagcgttgataccaccgcg960ttcccgctgctgatgaccctgtttgaactggcgcgtaacccggaagtgcagcaagcggtt1020cgtcaggagagcctggtggcggaagcgcgtatcagcgagaacccgcaacgtgcgattacc1080gaactgccgctgctgcgtgcggcgctgaaggaaaccctgcgtctgtatccggttggcatc1140accctggagcgtgaagtgagcagcgacctggttctgcaaaactaccacattccggcgggt1200accctggtgaaagttctgctgtatagcctgggtcgtaacccggcggtgtttgcgcgtccg1260gaaagctaccacccgcagcgttggctggatcgtcaaggtagcggcagccgttttccgcac1320ctggcgttcggttttggcgttcgtcagtgcctgggtcgtcgtgtggcggaagtggaaatg1380ctgctgctgctgcaccacgtgctgaagaacttcctggttgaaaccctggagcaggaagac1440atcaaaatggtgtatcgttttattctgatgccgagcaccctgccgctgttcacctttcgt1500gcgatccaataa151231500DNA人工序列3atggcgctgcgtgttaccgcggacgtttggctggcgcgtccgtggcaatgcctgcatcgt60acccgtgcgctgcgtaccaccgcgaaggtggcgccgaagaccctgaaaccgttcgaggcg120atcccgcaatacagccgtaacaagtggctgaaaatgatccagattctgcgtgagcagggt180caagaaaacctgcacctggagatgcaccaggcgttccaagaactgggcccgatctttcgt240cacagcgcgggtggcgcgcaaattgtgagcgttatgctgccggaggacgcggaaaagctg300caccaggttgaaagcatcctgccgcaccgtatgccgctggagccgtgggtggcgcaccgt360gaactgcgtggtctgcgtcgtggcgtttttctgctgaacggtgcggattggcgtttcaac420cgtctgcaactgaacccgaacatgctgagcccgaaagcgattcagagcttcgtgccgttt480gttgacgtggttgcgcgtgattttgtggagaacctgaagaaacgtatgctggaaaacgtt540cacggtagcatgagcatcaacatccaaagcaacatgttcaactacacgatggaggcgagc600cacttcgtgattagcggtgaacgtctgggtctgaccggtcacgatctgaagccggagagc660gttaccttcacccacgcgctgcacagcatgtttaagagcaccacccagctgatgttcctg720ccgaaaagcctgacccgttggaccagcacccgtgtgtggaaagagcacttcgacagctgg780gatatcattagcgaatacgtgaccaagtgcatcaaaaacgtttatcgtgagctggcggaa840ggtcgtcagcaaagctggagcgttattagcgagatggtggcgcagagcaccctgagcatg900gacgcgatccacgcgaacagcatggaactgattgcgggcagcgtggataccaccgcgatc960agcctggttatgaccctgtttgaactggcgcgtaacccggacgtgcagcaagcgctgcgt1020caagagagcctggcggcggaagcgagcattgttgcgaacccgcagaaggcgatgagcgat1080ctgccgctgctgcgtgcggcgctgaaagaaaccctgcgtctgtacccggtgggtagcttc1140gttgaacgtatcgtgcacagcgacctggttctgcaaaactatcacgtgccggcgggtacc1200tttgttatcatttacctgtatagcatgggccgtaacccggcggtgtttccgcgtccggag1260cgttacatgccgcagcgttggctggaacgcaagcgtagctttcaacacctggcgttcggt1320tttggcatgcgtcagtgcctgggccgtcgtctggcggaagtggaaatgctgctgctgctg1380caccacatgctgaaaaccttccaggtggaaaccctgcgtcaggaagatatgcaaatggtt1440ttccgttttctgctgatgccgagcagcagcccgttcctgacctttcgtccggttagctaa150041512DNA人工序列4atggcgctgtgggcgaaagcgcgtgtgtggatggcgggtcc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