濁點系統兩相分配生物反應器在酶法水解青黴素製備6－apa中的應用的製作方法

2023-05-06 20:57:46

專利名稱：濁點系統兩相分配生物反應器在酶法水解青黴素製備6－apa中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，具體涉及工業生物催化領域中應用濁點系統在酶法水解青黴素製備6-APA中的應用。
背景技術：
青黴素酶法水解如式1所示，酶法水解青黴素(PG)製備6-氨基青黴烷酸(6-APA)並產生副產物苯乙酸(PAA)是抗生素工業的重要基礎。
式1青黴素水解工藝國內外普遍採用酶轉化技術，其基本的工藝過程如圖1所示(Abian et al，Improving the industrial production of 6-APAenzymatichydrolysis of penicillin G in the presence of organic solvents.Biotechnol Prog，2003，191639-1642)。現行工藝採用反覆調節溶液pH的萃取、結晶後再實現酶法青黴素鉀鹽的水解。這一工藝不但因為反覆調節溶液的pH而產生大量工業廢物，同時繁雜的青黴素結晶工藝增加了操作費用和設備投資(van de Sandt et al，Innovations in cephalosporin and penicillinproductionpainting the antibiotics industry green.Chim.Oggi.2000，1872-75)。
國外已經開始探索非水相催化以刪除分離純化青黴素髮酵液的結晶過程，即採用水—有機溶劑兩相系統的酶法水解技術。一種方法是發酵液萃取後調節至高pH(7-8)後，不進行青黴素結晶工藝而直接進行水解過程。雖不能實現萃取水解，但刪除了結晶工藝，保證了青黴素醯化酶在高活性條件下操作仍具有很大的優勢。其不能工業化的主要原因是青黴素醯化酶在水—有機溶劑兩相系統中的穩定性顯著降低，提高青黴素醯化酶在水—有機溶劑兩相系統中的穩定性成為國內外催化劑工程研究的熱點問題(Abian et al，Improving theindustrial production of 6-APAenzymatic hydrolysis of penicillin G inthe presence of organic solvents.Biotechnol Prog，2003，191639-164)。另一種方法是在低pH(3-5)條件下實現萃取水解反應，其主要優點是不需反覆調節pH，環境友好，減少了酸鹼消耗；實現了對反應副產物PAA的萃取，使反應向水解方向進行；產物6-APA可同時結晶，減少了下遊分離費用。但青黴素醯化酶在低pH時活性降低是限制了其工業化過程的重要因素之一(denHollander et al，Discrete countercurrent contactingan experimentalmethod for developing continuous countercurrent reactors.Ind.Eng.Chem.Res.2005，44，231-235)；在低pH條件下，酶在有機溶劑中的穩定性也是一個需要考察的重要因素。
為了提高非水相催化的效率，除採用催化劑工程技術外，介質工程已成為國內外研究的又一熱點。除水-有機溶劑兩相系統外，雙水相系統、超臨界系統、離子液體等新技術也相繼出現。非離子表面活性劑水溶液在溫度高於某一溫度時形成互不相溶的兩相，這一溫度稱為濁點。這一表面活性劑水溶液系統稱為濁點系統。濁點系統中的溶質將不均勻地分配於濁點系統的兩相，利用這一系性質而而分離或濃縮溶質的技術稱為濁點萃取(Wang et al，Determinationof solubilization of phenol at coacervate phase of cloud point extraction.Colloids Surf.A.2003，216207-214)。
底物、產物和生物催化劑在兩相系統將不均勻地分配於系統的兩相，其中一相充當著底物的貯存庫和產物的萃取劑，從而實現底物的原位添加和產物的原位萃取，這一技術稱為兩相分配生物反應器。濁點系統應用於酶催化反應或生物轉化過程常稱為濁點系統兩相分配生物反應器。其優勢有非離子表面活性劑在操作溫度下基本不揮發，環境友好；系統具有特殊的微水環境結構，使酶、微生物保持了高度活性和穩定性；溶質在系統中分配的可調節因素多，操作彈性大；操作工藝和常規水-有機溶劑兩相系統基本一致，工業化基礎好(Wang et al，Microbial transformation of hydrophobic compounds in cloudpoint system.J.Mol.Cata.B-Enzym.2004，27147-153；Wang et al，Cloudpoint system as a tool to improve the efficiency of biotransformation.Enzyme Microb.Technol.2005，36(4)589-594；)。本領域迫切需要開發濁點系統兩相分配生物反應器的新用途，尤其是在酶法水解青黴素製備6-氨基頭孢烷酸(6-APA)中的應用。

發明內容
本發明的目的是提供了濁點系統在酶法水解青黴素製備6-氨基頭孢烷酸(6-APA)中的應用。
本發明的另一目的是提供了一種採用濁點系統兩相分配生物反應器技術，用酶法水解青黴素製備6-APA的方法。
本發明的第一方面提供了濁點系統兩相分配反應器技術在用酶法水解青黴素製備6-APA中的應用。
較佳的，所述濁點系統是指非離子表面活性劑溶液形成的兩相系統；所述的非離子表面活性劑是選自聚氧乙烯型非離子表面活性劑，多元醇系非離子表面活性劑，聚醚型非離子表面活性劑或烷醇醯胺系非離子表面活性劑中的一種或二種非離子表面活性劑。優選的，所述非離子表面活性劑是聚氧乙烯醇類非離子表面活性劑。更佳的，所述的非離子表面活性劑是Tergrtiol TMN-3和/或Brij30。
優選的，所述非離子表面活性劑與青黴素溶液體積比為1∶5。
在一優選例中，所述濁點系統包含二種非離子表面活性劑。優選的，所述二種非離子表面活性劑的體積比為1∶0.5~1∶2。
本發明的第二方面提供了一種採用濁點系統兩相分配生物反應器技術，用酶法水解青黴素製備6-APA的方法，所述方法包括以下步驟(a)調節pH為2-3，採用濁點萃取技術萃取青黴素髮酵液中的青黴素；(b)調節pH為5-6，實現青黴素的酶法水解；(c)調節pH為3.9，實現6-APA的結晶分離所述步驟(a)中萃取青黴素時不經過結晶過程。
所述濁點系統中青黴素水解技術採取常規的批式操作模式、半連續對流操作模式或者連續對流操作模式。
所述的濁點系統是指非離子表面活性劑溶液形成的兩相系統。
所述的非離子表面活性劑選自聚氧乙烯型非離子表面活性劑，多元醇系非離子表面活性劑，聚醚型非離子表面活性劑或烷醇醯胺系非離子表面活性劑中的一種或二種非離子表面活性劑。
優選的，所述非離子表面活性劑是聚氧乙烯醇類非離子表面活性劑。更佳的，所述的非離子表面活性劑是Tergrtiol TMN-3和/或Brij30。
優選的，所述非離子表面活性劑與青黴素溶液體積比為1∶5。
在一優選例中，所述濁點系統包含二種非離子表面活性劑。優選的，所述二種非離子表面活性劑的體積比為1∶0.5~1∶2。
發明人在研究濁點系統的基本性質的基礎上，首次成功地將其開發為一種新的生物催化介質而應用於酶法水解青黴素製備6-氨基頭孢烷酸。
本發明優選使用Tergitol TMN-3。非離子表面活性劑Tergitol TMN-3(廠家Fulka，分子式如式2所示)的水溶液在室溫下會形成表面活性劑濃度很高的凝聚層相和表面活性劑濃度很低的稀相。
式2在37℃條件下，表面活性劑與水溶液的體積比為2∶10，水溶液中青黴素原始濃度為2g/100ml時，不同pH下凝聚層相的萃取效率如圖2所示。這表明在較低pH條件下可以實現青黴素的萃取。同時調節適當的pH，可以改變青黴素在兩相系統中的分配。
本發明中通過添加酸鹼來調節PH，如HCl，NaOH等。
苯乙酸在濁點系統中分配是決定兩相分配生物反應器應用於青黴素水解的關鍵。在37℃，表面活性劑與水溶液的體積比為2∶10，水溶液中青黴素原始濃度為0.5g/100ml條件下PAA的分配係數如圖3所示。在pH低於6時，PAA的分配係數大於1，表明濁點系統對PAA有萃取作用，而在pH大於7時，PAA基本上分配於稀相。因此，調節濁點系統在較低的pH可實現兩相分配生物反應器對PAA的萃取反應，解除PAA對水解反應的抑制，同時使反應平衡向水解方向移動。而調節濁點系統在較高的pH，可以實現對PAA的反萃，實現PAA和表面活性劑的分離，以便回收副產物和實現表面活性劑的循環利用。
6-APA是青黴素水解的目標產物。在37℃條件下，6-APA在水溶液中的飽和溶解度和在非離子表面活性劑與6-APA飽和水溶液的體積比為2∶10時濁點萃取後的稀相6-APA濃度如圖4所示。6-APA的溶解度隨pH變化顯著，在低pH時的溶解度很小。在不同pH條件下，6-APA基本上主要分配於稀相。這表明在低pH條件下，如果青黴素水解反應的產物濃度較高時會出現6-APA的反應結晶，從而解除6-APA對水解反應的抑制，同時使反應平衡向水解方向移動。
綜合青黴素水解物系在濁點系統中的分配規律，調節適當的pH(4-6)，在濁點系統中實現青黴素水解有可能實現如圖5的分配過程。同時6-APA還可能在濁點系統中的稀相結晶。青黴素在兩相中分配，可以實現高底物濃度水解，解除了底物對酶活性的抑制，同時抑制了青黴素本身的降解。濁點系統對苯乙酸的萃取反應和6-APA的反應結晶，解除了產物對酶活性的抑制，同時移動了反應平衡，有利於反應向水解方向進行。
酶在濁點系統中的穩定性是實現青黴素在濁點系統兩相分配生物反應器中水解的關鍵因素之一。在37℃條件下，固定化青黴素醯化酶在緩衝溶液、表面活性劑與緩衝溶液的體積比為2∶10的濁點系統中振蕩8小時後酶的殘留活性如圖6所示。固定化酶在低pH下穩定性較差，而在高pH下具有較好的穩定性。酶在濁點系統中的穩定性也有相似的規律。這表明酶的不穩定性主要是由溶液的pH影響的，濁點系統對酶的穩定性影響較小。換句話說，固定化酶在濁點系統中具有較好的穩定性。
通過不同pH下青黴素的水解反應，發明人發現在濁點系統中，產物濃度(包括結晶部分)明顯高於對照系統，表明反應物系在濁點系統中兩相的不平均分配有利於解除對酶的抑制和移動反應平衡向水解方向進行。而在緩衝溶液的對照系統中，產物濃度隨pH的降低而降低。具體實驗條件為固定化酶量為0.2±0.01g，表面活性劑與緩衝液體積比2∶10，青黴素濃度為2g/100ml的磷酸鹽緩衝液10ml反應兩小時(圖7)。在緩衝溶液的對照系統中，產物濃度隨pH的降低而降低。
發明人進一步研究了低pH下酶的水解(圖8)pH為5.2，固定化酶量為0.2±0.01g，青黴素濃度為2g/100ml的磷酸鹽緩衝液10ml反應兩小時，不同表面活性劑與緩衝液體積比時青黴素的水解率(包括6-APA結晶部分)的結果如圖8所示。這表明改變表面活性劑加量，在不添加酸鹼調節pH的條件下有可能使青黴素徹底水解。
最後，發明人採用如圖1所示的濁點系統兩相分配生物反應器新工藝，克服了酶在非水溶劑中的不穩定性，以實現青黴素的分離與水解的過程集成，同時實現水解反應中不添加酸鹼來控制pH。刪除了青黴素髮酵液萃取中的結晶工藝，減少了工業廢物產生。在青黴素水解過程中直接萃取水解副產物苯乙酸，實現了PAA的反萃和表面活性劑的回收和循環利用，有利於降低成本，簡化工藝。
本發明所述的非離子表面活性劑選自聚氧乙烯型非離子表面活性劑，多元醇系非離子表面活性劑，聚醚型非離子表面活性劑或烷醇醯胺系非離子表面活性劑。
其中所述的聚氧乙烯型非離子表面活性劑，包括脂肪醇聚氧乙烯醚(AEO)、脂肪酸聚氧乙烯酯、烷基酚聚氧乙烯醚(APEO)、聚氧乙烯醯胺、聚氧乙烯脂肪胺、聚氧乙烯醇、吐溫等。其中烷基酚聚氧乙烯醚類包括Triton X-100或Triton X-114(辛基酚聚氧乙烯醚類)；其中聚氧乙烯醇類包括Brij30，Brij35，Brij56，Tergitol TMN-3或C12E7；聚氧乙烯醚類包括包括Tween20、Tween40、Tween60、Tween80、Span20、Span40、Span60或Span80；所述的多元醇系非離子表面活性劑，包括脂肪酸乙二醇酯、單脂肪酸甘油酯(單甘酯)、季戊四醇脂肪酸酯、失水山梨醇脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯等。
所述的聚醚型非離子表面活性劑，包括環氧乙烷和環氧丙烷嵌段共聚物。
所述的烷醇醯胺系非離子表面活性劑包括脂肪酸二乙醇醯胺、脂肪酸單乙醇醯胺、氧化胺和烷基多苷(APG)等。
本發明所述的濁點系統兩相分配生物反應器的優勢有非離子表面活性劑在操作溫度下基本不揮發，環境友好；系統具有特殊的微水環境結構，使酶、微生物保持了高度活性和穩定性；溶質在系統中分配的可調節因素多，操作彈性大；操作工藝和常規水-有機溶劑兩相系統基本一致，工業化基礎好。本發明所述方法可實現PAA反萃和表面活性劑的循環利用，降低成本。
本發明的方法通過調節初始PH來控制青黴素萃取、水解和結晶的順序進行，在每一步具體反應過程中不需要調節PH，操作簡便。


圖1青黴素酶法水解新老工藝的比較濁點系統兩相分配生物反應器技術可直接從發酵液中萃取青黴素，而且水解過程不需添加酸鹼控制過程的pH，同時實現6-APA的直接結晶圖2濁點系統萃取青黴素的效果青黴素原始濃度為2g/100ml時不同pH時濁點萃取的效率圖3苯乙酸在濁點系統中的分配37℃條件下表面活性劑與水溶液的體積比為2∶10，苯乙酸原始濃度為0.5g/100m時PAA的分配係數圖4 6-APA的飽和溶解度和在濁點系統中的分配37℃條件下，6-APA的飽和溶解度和表面活性劑與6-APA飽和水溶液的體積比為2∶10時濁點萃取後稀相的6-APA濃度圖5青黴素在濁點系統中反應的原理示意6固定化酶在濁點系統中的穩定性37℃條件下，固定化青黴素醯化酶在緩衝溶液(上方曲線)和濁點系統(表面活性劑與緩衝液的體積比為2∶10，下方曲線)的酶殘留活性的水解曲線。
圖7不同pH下濁點系統中的青黴素水解固定化酶為0.2g±0.01g，表面活性劑與緩衝液的體積比為2∶10，青黴素原始濃度為2g/100ml的緩衝液10ml反應兩小時的結果。
圖8低pH時不同表面活性劑加量的青黴素水解效果pH為5.2，固定化酶為0.2g±0.01g，青黴素原始濃度為2g/100ml的緩衝液10ml反應兩小時，不同表面活性劑與緩衝液體積比時青黴素的水解結果。(包括6-APA結晶部分)具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1.萃取水解例子將青黴素濃度為8g/100ml的溶液按表面活性劑Tergitol TMN-3與青黴素溶液體積比為1∶5混合，調節pH至2.5以下，在室溫下靜置1小時以上後取出凝聚層相。在固定化酶為0.8±0.01g，初始pH7.8的磷酸鹽緩衝液15ml，凝聚層相與緩衝液的體積比為1∶4，在反應3小時後，溶液的pH穩定於平衡值6.3，溶液相產物6-APA濃度(不包括結晶部分)達到114.1mM，而包括結晶部分的6-APA總濃度達到138.2mM。(這表明在高產物濃度和較高pH條件下6-APA也存在反應結晶過程)2.萃取水解例子將青黴素濃度為2g/100ml的溶液按表面活性劑Brij 30與青黴素溶液體積比為1∶5混合，調節pH至3以下，在室溫下靜置2小時以上後取出凝聚層相。在固定化酶為0.29±0.01g，初始pH5.2的磷酸鹽緩衝液10ml，凝聚層相與緩衝液的體積比為1∶5，在反應4小時後，溶液的pH穩定於平衡值5.1，產物6-APA濃度(包括結晶部分)達到37mM。(表明Brij 30，在低pH下的結晶過程)3.萃取水解例子將青黴素濃度為8g/100ml的溶液按表面活性劑(Tergitol TMN-3Brij30＝1∶0.5~1∶2)與青黴素溶液體積比為1∶5混合，調節pH至2以下，在室溫下靜置1.5小時以上後取出凝聚層相。在固定化酶為0.8±0.01g，初始pH6.2的磷酸鹽緩衝液15ml，凝聚層相與緩衝液的體積比為1∶4，在反應3小時後，溶液的pH穩定於平衡值5.7，溶液相產物6-APA濃度(不包括結晶部分)達到43.4mM，而包括結晶部分的6-APA總濃度達到65.2mM。(表明混合表面活性劑也有濁點系統的效果)取出濁點系統的凝聚層相，加入等體積的水並調節pH到8以上，如圖3所示，PAA基本分配於稀相，可實現PAA反萃和表面活性劑的循環利用。
4.萃取水解例子將青黴素濃度為8g/100ml的溶液按表面活性劑與青黴素溶液體積比為1∶5混合，調節pH至2.5左右，在室溫下靜置1小時以上後取出凝聚層相。在固定化酶為0.8±0.01g，初始pH7的磷酸鹽緩衝液15ml，凝聚層相與緩衝液的體積比為1∶4，在反應3小時後，溶液的pH穩定於平衡值6.1，溶液相產物6-APA濃度(包括結晶部分)達到113.6mM。取出反應液的凝聚層相，按凝聚層相與水體積比為1∶4混合後調節至pH8。在室溫下靜置1小時以上後取出凝聚層相作為回收的表面活性劑重複青黴素萃取、濁點系統中水解過程，反應3小時後，產物濃度(包括結晶部分)為115mM。(表明表面活性劑可以重複利用)5.離散式半連續萃取水解例子在固定化酶為0.8±0.01g，初始pH7.8，底物濃度為8g/100ml的緩衝液15ml，表面活性劑與緩衝液的體積比為1∶4，在反應3小時過程中三次更換濁點系統的凝聚層相，每次產物6-APA的濃度分別為140mM、160mM和170mM。將凝聚層相更換為新鮮的表面活性劑溶液強化了濁點系統的萃取功能，使產物濃度進一步提高。這一離散式半連續操作模式表明採用半連續、連續對流等操作模式可進一步提高濁點系統中青黴素的水解效率。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
權利要求
1.濁點系統兩相分配反應器技術在用酶法水解青黴素製備6-APA中的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其特徵在於所述濁點系統是指非離子表面活性劑溶液形成的兩相系統；所述的非離子表面活性劑選自聚氧乙烯型非離子表面活性劑，多元醇系非離子表面活性劑，聚醚型非離子表面活性劑或烷醇醯胺系非離子表面活性劑中的一種或二種非離子表面活性劑。
3.如權利要求2所述的應用，其特徵在於所述的非離子表面活性劑是聚氧乙烯醇類非離子表面活性劑。
4.一種採用濁點系統兩相分配生物反應器技術，用酶法水解青黴素製備6-APA的方法，所述方法包括以下步驟(a)調節pH為2-3，採用濁點萃取技術萃取青黴素髮酵液中的青黴素；(b)調節pH為5-6，實現青黴素的酶法水解；(c)調節pH為3.9，實現6-APA的結晶分離。
5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於步驟(a)中萃取青黴素時不經過結晶過程。
6.如權利要求4或5所述的方法，其特徵在於所述的濁點系統中青黴素水解技術採取常規的批式操作模式、半連續對流操作模式或者連續對流操作模式。
7.如權利要求4或5所述的方法，其特徵在於所述的濁點系統是指非離子表面活性劑溶液形成的兩相系統；所述的非離子表面活性劑選自聚氧乙烯型非離子表面活性劑，多元醇系非離子表面活性劑，聚醚型非離子表面活性劑或烷醇醯胺系非離子表面活性劑中的一種或二種非離子表面活性劑。
8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於所述的非離子表面活性劑是聚氧乙烯醇類非離子表面活性劑。
9.如權利要求7所述的方法，其特徵在於所述的濁點系統中青黴素水解技術採取常規的批式操作模式、半連續對流操作模式或者連續對流操作模式。
10.如權利要求8所述的方法，其特徵在於所述的非離子表面活性劑是Tergrtiol TMN-3和/或Brij30。
全文摘要
本發明公開了濁點系統在酶法水解青黴素製備6－氨基頭孢烷酸(6－APA)中的應用。具體是採用濁點系統兩相分配生物反應器技術，用青黴素醯化酶酶法水解青黴素G製備半合成β－內醯胺抗生素的關鍵中間體6－APA。所述方法直接萃取發酵液中的青黴素而刪除了青黴素的結晶過程，同時在水解過程中實現了苯乙酸(PAA)的直接萃取，不需添加酸鹼來控制過程的pH，減少了廢物的產生。本發明還公開了一種採用濁點系統兩相分配生物反應器技術，用酶法水解青黴素製備6－APA的方法。
文檔編號C12P37/06GK1928110SQ20051002944
公開日2007年3月14日 申請日期2005年9月7日 優先權日2005年9月7日
發明者包達, 吳海橋, 王志龍 申請人:上海海湃生物科技有限公司