一種慈姑原生質體的製備方法
2023-09-20 16:51:55
一種慈姑原生質體的製備方法
【專利摘要】本發明涉及一種慈姑原生質體的製備方法。本發明將慈姑經過慈姑莖尖培養、試管苗水培預處理、原生質體的酶解、原生質體的純化、原生質體的懸浮得到慈姑原生質體。本發明克服了現有慈姑的常規育種非常困難，易造成栽培品種遺傳基礎單一，阻礙慈姑品種改良等缺陷。本發明利用了莖尖組織培養技術獲得了無菌的慈姑壯苗，為原生質體的分離提供了最佳的外植體，其次採用酶解法分離出高質量的慈姑原生質體，且其產量在2×106個/克以上，活力超過80％，絕大多數為球形的，其細胞膜完整且富含葉綠體，具有較高活力，能滿足後續各種研究需要。
【專利說明】一種慈姑原生質體的製備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物【技術領域】，特別涉及一種慈姑原生質體的製備方法。
【背景技術】
[0002]慈姑為多年生水生草本植物，生產上常作為一年生作物栽培，原產中國。在中國華南地區和長江流域普遍栽培，江蘇太湖地區和裡下河地區及珠江三角洲為主產區。慈姑常規育種困難，易造成栽培品種遺傳基礎單一，阻礙慈姑品種改良。
[0003]在本發明作出之前，慈姑的常規育種非常困難，易造成栽培品種遺傳基礎單一，阻礙慈姑品種改良。
【發明內容】
[0004]本發明的目的就在於克服上述缺陷，研製一種慈姑原生質體的製備方法。
[0005]本發明的技術方案是:
[0006]一種慈姑原生質體的製備方法，其主要技術特徵在於步驟:
[0007](I)慈姑莖尖培養:將慈姑莖尖接種在莖尖培養基上培養；
[0008](2)試管苗水培預處理:將步驟(I)的試管苗移入裝有無菌水的廣口瓶中培養；
[0009](3)原生質體的酶解:剪取步驟(2)的試管苗新長出的葉片，切成條狀，加入酶液進行酶解；
[0010](4)原生質體的純化:用篩網過濾步驟⑶的酶液,並用洗液中洗,離心去上清液，再加入洗液，然後用吸管輕輕注入到蔗糖溶液界面上，離心吸取中間部分的原生質體。
[0011](5)原生質體的懸浮:將步驟(4)純化的原生質體懸浮於原生質體液體培養基中。
[0012]所述步驟⑴中，在25°C培養30天。
[0013]所述步驟⑵中，在25 °C培養15天。
[0014]所述步驟(3)中在28 °C暗條件下酶解12h。
[0015]本發明利用了莖尖組織培養技術獲得了無菌的慈姑壯苗，為原生質體的分離提供了最佳的外植體，其次採用酶解法分離出高質量的慈姑原生質體，且其產量在2X 16個/克以上，活力超過80%，能滿足後續各種研究需要。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]圖1——本發明所獲得的慈姑原生質體示意圖。
【具體實施方式】
[0017]本發明的技術思路是:
[0018]原生質體指去掉細胞壁的裸露活細胞，是進行各種細胞及遺傳操作的理想材料，已廣泛地應用於體細胞雜交、遺傳轉化、種質資源保存、基因瞬時表達、蛋白質互作、信號轉導等方面。因此，原生質體技術可為慈姑的種質資源創新和遺傳改良提供新的技術途徑。而實現上述應用的前提是製備高產量和高活力的原生質體。
[0019]本發明所採用的技術方案主要包括以下5個步驟:
[0020](I)慈姑莖尖培養:將一定大小的慈姑莖尖接種在莖尖培養基上，25°C培養30天。
[0021](2)試管苗水培預處理:將步驟(I)的試管苗移入裝有無菌水的廣口瓶中，25°C培養15天。
[0022](3)原生質體的酶解:剪取步驟(2)的試管苗新長出的葉片，用手術刀片將葉片切成l-2mm寬的條狀，加入酶液，28°C暗條件下酶解12h。
[0023](4)原生質體的純化:用孔徑為45 μ m的不鏽鋼篩網過濾步驟(3)的酶液，並用洗液衝洗，濾液離心去上清液，再加入洗液，然後用吸管輕輕注入到蔗糖溶液界面上，離心吸取中間部分的原生質體。
[0024](5)原生質體的懸浮:將步驟(4)純化的原生質體懸浮於原生質體液體培養基中，用於產量和活力的檢測。
[0025]實施例:
[0026]1、慈姑莖尖培養:取0.5-lcm長度的慈姑莖尖接種在莖尖培養基(MS+0.5mg/L6-BA+0.4mg/L NAA)上，置於組織培養室(溫度25°C，光照強度25001x，光照時間16h/d)培養30天。
[0027]2、試管苗水培預處理:將步驟(I)的試管苗移入裝有無菌水的廣口瓶中，同步驟(I)的培養條件下培養15天。
[0028]3、原生質體的酶解:剪取步驟(2)的試管苗新長出的葉片，置於鋪有濾紙的無菌培養皿中，用手術刀片將葉片切成l_2mm寬的條狀，加入酶液，用封口膜封口後，28°C暗條件下酶解12h。其中酶液組成為:MS+0.25%纖維素酶+0.25%離析酶+0.25%半纖維素酶+0.0055% NaH2P04+0.06 % 2-嗎啉乙磺酸 +0.18% CaCl2.2H20+0.65M 甘露醇 +250mg/L 麥芽提取物。
[0029]4、原生質體的純化:用孔徑為45μπι的不鏽鋼篩網過濾步驟(3)的酶液，並用13%甘露醇洗液衝洗，濾液轉移到1mL的離心管中，950rpm離心lOmin，去上清。原生質體沉澱與1.0mL 13%甘露醇洗液混勻，之後用吸管輕輕轉移到預先加入了 3mL 28%蔗糖的離心管中，950rpm離心2mi n，用吸管將兩液面間的原生質體帶吸出，轉移到新的離心管中，930rpm離心4mi η,去上清。
[0030]5、原生質體的懸浮:將步驟(4)純化的原生質體懸浮於原生質體液體培養基中(MS+0.65Μ甘露醇+40mg/L腺嘌呤，pH 5.6)，用於產量和活力的檢測。
[0031]慈姑原生質體如圖1所示，絕大多數為球形的，其細胞膜完整且富含葉綠體，具有較高活力，可用於慈姑的體細胞雜交、遺傳轉化、基因瞬時表達等研究。
【權利要求】
1.一種慈姑原生質體的製備方法，其特徵在於步驟: (1)慈姑莖尖培養:將慈姑莖尖接種在莖尖培養基上培養； (2)試管苗水培預處理:將步驟(I)的試管苗移入裝有無菌水的廣口瓶中培養； (3)原生質體的酶解:剪取步驟(2)的試管苗新長出的葉片，切成條狀，加入酶液進行酶解； (4)原生質體的純化:用篩網過濾步驟(3)的酶液，並用洗液衝洗，離心去上清液，再加入洗液，然後用吸管輕輕注入到蔗糖溶液界面上，離心吸取中間部分的原生質體。 (5)原生質體的懸浮:將步驟(4)純化的原生質體懸浮於原生質體液體培養基中。
2.根據權利要求1所述的一種慈姑原生質體的製備方法，其特徵在於步驟(I)中，在25°C培養30天。
3.根據權利要求1所述的一種慈姑原生質體的製備方法，其特徵在於步驟(2)中，在25°C培養15天。
4.根據權利要求1所述的一種慈姑原生質體的製備方法，其特徵在於步驟(3)中在28°C暗條件下酶解12h。
【文檔編號】C12N5/04GK104278007SQ201410591784
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年10月27日 優先權日:2014年10月27日
【發明者】徐小勇, 錢榮, 陳學好, 李良俊, 程立寶, 徐強, 高紅勝, 齊曉花 申請人:揚州大學