一種黃芪藥材分子鑑定方法和試劑盒與流程

2023-05-06 23:37:41 3

本發明涉及中藥材分子鑑定的
技術領域：
，具體地說是一種黃芪藥材分子鑑定方法和試劑盒。
背景技術：
：黃芪是多年生草本植物，豆科，黃芪屬，入藥部位為黃芪的根部。黃芪主要分布在內蒙古，陝西，山西，甘肅，寧夏，東北，黑龍江，新疆等地。近年來，由於大量採挖，野生黃芪數量急劇減少，因此定為漸危物種，屬國家三級保護植物。主要栽培品種是蒙古黃芪和莢膜黃芪。主產區為內蒙古，山西。黃芪的藥用迄今已有2000多年的歷史，在中醫上認為其有補氣昇陽，固表止汗，利水消腫，生津養血，行滯通痺，託毒排膿，斂創生肌之效。近年研究表明，黃芪有增強機體免疫功能，降壓，利尿消腫，保護心肌，抗壓等功效。目前市場上黃芪出現偽劣品、混淆品的原因很多，有的是商販有意偽造或摻偽牟利，有的是以地方習用藥材充藥典正品藥材，或是有的地區用藥材名稱與正品藥材相近而造成誤用，有點以相對廉價的他種藥材冒充貴重藥材，有的藥材因其形狀相似而造成誤用。因此對於黃芪中藥材品種的鑑別有著重要意義。現有的中藥材品種鑑別技術包括：1)傳統經驗法，該方法利用感覺器官來觀察中藥的形狀、大小、色澤、質地、斷面以及氣味等特徵來確定中藥品種；2)顯微鑑別法，該方法利用顯微鏡來觀察中藥粉末所具有的器官構造，阻止構造碎片及細胞形狀來鑑別真偽；3)一般理化鑑別法，該方法包括螢光法、顯色法、沉澱法、升華法、結晶法等。現代方法包括：色譜鑑別，使用薄層色譜，氣相色譜，高效液相色譜等方法來確定中藥材的成分。光譜法是利用中藥光譜學行為的不同進行鑑定。目前已有的檢測方法檢測過程複雜，對檢測人員的技術要求高，如檢測人員缺乏豐富的dna測序知識和經驗很容易導致檢測失敗，而且測序法所用儀器設備昂貴，廣泛應用推廣困難。隨著中藥材的推廣以及黃芪的廣泛應用，一般鑑別方法以不能滿足對黃芪品種鑑別的需求，因此，發明一種黃芪藥材分子鑑定方法和試劑盒已成了急需解決的技術問題。技術實現要素：本發明的目的則是克服了現有技術的不足，提供一種黃芪藥材分子鑑定方法和試劑盒，通過選用一個或少數幾個基因片段即可對黃芪藥材分子進行準確鑑定，鑑定過程更加快速，在短時間內可以鑑定大量樣本，重複性和穩定性高，實驗過程標準、操作簡便、更易實現藥材分子鑑別的自動化，可以有效緩解分類鑑定人才缺乏的現狀，此外還可以通過網際網路和信息平臺對數據統一管理，從而實現數據信息的共享。為了解決上述技術問題，本發明是通過以下技術方案實現的：一種黃芪藥材分子鑑定試劑盒，其特徵在於：所述試劑盒包括包裝盒體(1)、襯墊(2)、多個裝有檢測螢光定量pcr反應混合液的試管(3)、一個裝有陽性對照品的試管(4)、一個裝有陰性對照品的試管(5)、96反應孔檢測引物探針板封墊(6)和96反應孔基因檢測引物探針板(7),所述襯墊位於所述包裝盒體中，多個所述反應混合液的試管位於所述襯墊的一側，所述裝有陽性對照品的試管和所述裝有陰性對照品的試管位於所述襯墊的另一側，所述引物探針板封墊位於所述引物探針板上方。進一步的，所述96反應孔基因檢測引物探針板的引物探針的一端連接有第一螢光發射基團，另一端連接有螢光淬滅基團。進一步的，所述螢光定量pcr反應混合液的成分包括：pcr緩衝液、mgcl2、dntps。進一步的，所述96反應孔基因檢測引物探針板包括：引物位點檢測用上遊引物、引物位點檢測用下遊引物、引物位點基因型一螢光探針、引物位點基因型二螢光探針、taqdna聚合酶，其中，引物探針的比例為1：20。進一步的，所述螢光發射基團自選fam。進一步的，所述96反應孔中總體積10μl，其中包括8μlpcr反應混合液，2μl檢測樣品，該檢測樣品包括基因組dna、陽性對照品或陰性對照品。進一步的，所述引物的序列為：一種黃芪藥材分子鑑定方法，其特徵在於：在每次檢測前均設立陽性對照品和陰性對照品；在螢光定量pcr儀上進行擴增檢測，分別在96反應孔檢測引物探針板進行引物位點檢測，每一個引物位點檢測使用1個反應孔，一組共計4個反應孔；加入被檢測樣品和螢光定量pcr反應混合液，再分別加入陽性對照品和陰性對照品進行質控；在預設的反應條件下進行反應，待反應完成後，在螢光定量pcr儀上進行終點螢光讀取，根據得到的二維螢光圖和實時擴增曲線讀取被檢測樣品的檢測位點基因型。進一步的，所述引物探針板的探針的一端連接有第一螢光發射基團，另一端連接有螢光淬滅基團。進一步的，所述螢光發射基團自選fam。進一步的，所述螢光定量pcr反應混合液的成分包括：pcr緩衝液、mgcl2、dntps。進一步的，每個反應孔中總體積10μl，其中包括8μlpcr反應混合液，2μl檢測樣品，所述檢測樣品包括基因組dna、陽性對照品或陰性對照品。進一步的，所述反應條件為，在50℃環境下反應2分鐘，在95℃環境下反應10分鐘，再在95℃環境下反應30秒、在60℃環境下反應1分鐘，並將這兩次反應循環60次。進一步的，所述引物的序列為：本檢測方法和試劑盒主要用於檢測黃芪dna特異性位點，從而判斷黃芪中藥材的產地及道地性，進而推進中藥材市場標準化。與現有技術相比，本發明的有益效果是：該試劑盒運用螢光定量pcr技術,實現了同時對十個黃芪dna位點基因型進行檢測的目的，相對於現有的螢光定量pcr試劑盒只能檢測單個引物位點，本發明的試劑盒將針對同一黃芪dna的十個基因位點檢測整合到了一個試劑盒中，使用更方便且成本更低。附圖說明通過閱讀下文優選實施方式的詳細描述，各種其他的優點和益處對於本領域普通技術人員將變得清楚明了。附圖僅用於示出優選實施方式的目的，而並不認為是對本發明的限制。而且在整個附圖中，用相同的參考符號表示相同的部件。在附圖中：附圖1示出了該試劑盒的結構示意圖；附圖2示出了被檢測樣品的二維螢光圖；附圖3示出了所有位點實時擴增曲線圖。具體實施方式下面結合具體實施方式對本發明作進一步詳細描述：圖1示出了該試劑盒的結構示意圖。所述試劑盒包括包裝盒體(1)、襯墊(2)、多個裝有檢測螢光定量pcr反應混合液的試管(3)、一個裝有陽性對照品的試管(4)、一個裝有陰性對照品的試管(5)、96反應孔檢測引物探針板封墊(6)和96反應孔基因檢測引物探針板(7)。所述探針板的探針的一端連接有第一螢光發射基團，另一端連接有螢光淬滅基團。所述引物探針板包括：引物位點檢測用上遊引物、引物位點檢測用下遊引物、引物位點基因型一螢光探針、引物位點基因型二螢光探針、taqdna聚合酶。其中螢光定量pcr反應液的成分包含：pcr緩衝液、mgcl2、dntps，是為使用taqman、mgb探針等序列特異性螢光標記探針檢測體系的realtimepcr而研製的2×濃度的預混液。該試劑將除樣本dna&cdna、探針及primers外的其他pcr成分預先混合，使反應液配製更簡便化，同時添加特殊的增強劑能將樣品間的螢光強度散亂控制在最小範圍內，從而使得實驗結果的可重複性大大提高。dna聚合酶採用了genecoretaqgoldhsdnapolymaras，能靈敏檢測較低拷貝目的基因的表達水平並有效降低引物二聚體和非特異性擴增。所述反應孔中總體積10μl，其中包括8μlpcr反應混合液，2μl檢測樣品，該檢測樣品包括基因組dna、陽性對照品或陰性對照品。本鑑定方法基本原理是taqman螢光技術，即以taqman螢光探針為基礎。實施例11.材料：植物總dna提取試劑盒購於天根公司，taqdna聚合酶、dntps等pcr相關試劑購於美國promega公司，7900型螢光定量pcr儀為美國abi公司生產的產品。2.引物及探針：根據黃芪品種特定的dna序列來設計taqman螢光檢測的引物和探針。引物序列如下：forwardprimer1(5'-3')reverseprimer1(5'-3')ccaacaccacctcaaatgcagggaagattcttgcatccttgaccccactcctgttaagcacaacctaaggaaggttacctgctaatcccgcataatactgataaatctcagagccgttttgctgcttagaatcccatgttgtataaacttgtacgaacgatttggtccgaactggtccattgaagacagccgcaaggcatcatcgatggcttggttccctaccgcgatcttcttgcctgaagtgtaggaacctgttgcaccagcacgaaaactccaggagggtcgatccatgtctcgtcccctttgaaggtgactcccaagggacttgcactccaatattcaccctacataacacatcacattgtctacctgattcttcaactgcaggtcctgctatcccttccaatgtagatgcgcctcttatcagcttgt本發明檢測的樣本獲自植物黃芪的根部組織。從藥材組織中提取出基因組dna，作為模板，與前述設計的引物和探針組合相混合，進行螢光pcf反應，通過檢測pcr反應體系中形成的螢光情況來判斷所測藥材組織樣品的dna是否發生螢光反應，是則為黃芪藥材，否則為非黃芪以此來判斷黃芪真偽；探針為獨立研發特異性探針，已經通過資料庫比對只為黃芪藥材特有dna序列，不在任何其他植物中共有，且在不同種植地黃芪都共有該探針。3.樣本檢測：選取50例黃芪樣本，其中已確定檢測效低的為12例。樣本用植物總dna提取試劑盒提取總dna。每一例檢測為4個反應孔，每管中總體積10μl，其中8μpcr反應液，加入2μl被檢測dna，另外2個反應孔中加入2μl陽性對照和陰性對照，在abi7900螢光定量pcr儀上進行擴增。所述反應條件為，在50℃環境下反應2分鐘，在95℃環境下反應10分鐘，再在95℃環境下反應30秒、在60℃環境下反應1分鐘，並將這兩次反應循環60次。預設的反應條件下進行反應，待反應完成後，在螢光定量pcr儀上進行終點螢光讀取，根據得到的二維螢光圖和實時擴增曲線讀取被檢測樣品的檢測位點基因型。4.結果：被檢測樣本的特異性位點檢測位點被檢測樣品的二維螢光圖參見圖2,所有位點實時擴增曲線參見圖3。實施例2:1.待檢測基因位點確定根據有關的研究報導黃芪基因組及本人研究關於黃芪基因組研究明確了黃芪dna與其他藥材植物之間的dna區別，並根據黃芪特有dna的區別，本發明人將代表黃芪dna的基因片段作為目標位點，確定了本發明的檢測目標。2.檢測方法設計及引物和探針的合成針對選定的(10)個檢測位點，運用引物設計軟體(primer5.0)，設計出(10)對引物及taqman探針。所有的引物及探針由takara公司合成。引物序列如下：3.待檢測基因位點各基因標準品的構建和製備以道地黃芪藥材dna序列為模板，針對各個特異性基因位點分別設計一對能擴增外顯子區域的外側引物和一對待測引物，運用pcr擴增。4.基因型標準品的測試與驗證5.待測樣本的測試(1)取待測黃芪根部組織樣本，提取從待測黃芪根部組織樣本中提取的基因組dna。(2)按照如下反應條件進行pcr反應：反應條件為，在50℃環境下反應2分鐘，在95℃環境下反應10分鐘，再在95℃環境下反應30秒、在60℃環境下反應1分鐘，並將這兩次反應循環60次。預設的反應條件下進行反應，待反應完成後，在螢光定量pcr儀上進行終點螢光讀取，根據得到的二維螢光圖和實時擴增曲線讀取被檢測樣品的檢測位點基因型。(3)在pcrdna序列檢測儀中讀取螢光信號，並判讀基因型。因此可見，採用本發明的方法非常便捷快速，從而更加符合樣本檢測實效性便捷性的要求。本發明採用常規用於基因定量及核酸多態性檢測的taqman方法，設計了一套taqman引物和探針，並構建待測基因位點各種基因型的對照，建立螢光定量pcr方法，在螢光定量pcr儀上快速準確檢測出與黃芪品種相關的特定位點的基因型。該方法經過100例驗證，其檢測結果與其他方法所得結果完全一致，準確率超過99％。以上所述，僅為本發明較佳的具體實施方式，但本發明的保護範圍並不局限於此，任何熟悉本
技術領域：
的技術人員在本發明揭露的技術範圍內，可輕易想到的變化或替換，都應涵蓋在本發明的保護範圍之內。因此，本發明的保護範圍應以所述權利要求的保護範圍為準。當前第1頁12