高親和力金屬鎳結合肽及其應用的製作方法

2023-05-17 02:12:41 2

專利名稱：高親和力金屬鎳結合肽及其應用的製作方法
所屬領域本發明涉及一組能夠特異結合金屬鎳的高親和力結合肽。本發明還涉及這些高親和力鎳結合肽在環境保護、生物開礦和蛋白質純化中的應用。
背景技術：
金屬鎳作為生產高科技電子產品的一種重要原料，在生產生活中起著重要的作用。但同時，鎳也成為這些產品的生產使用過程所產生的汙染物之一。它作為重金屬，是一種持久性微量毒害汙染物，在環境中日趨積累，並很容易通過食物鏈富集，對地球上生物的生存構成嚴重威脅，已成為一種全球性公害，而我國每年由此造成的經濟損失達數百億元。同時，在開採金屬礦藏過程中，傳統的、甚至簡單粗暴的開採方法，造成資源的極大浪費，並且嚴重的汙染環境、破壞生態平衡，與可持續發展策略相違背。
利用生物技術進行環境汙染修復、礦產的開發，有可能成為一條有效、生態的途徑，從而帶來巨大的生態效益、社會效益和經濟效益，已成為各國關注的領域。微生物吸附劑利用微生物特性，吸附溶液中的金屬，從而實現金屬汙染物的清除或目標金屬的富集。這一純生態過程，具有速度快、效率高、成本低、反應條件溫和，尤其是無二次汙染等顯著優點。
高親和力的金屬結合肽的獲得，對微生物吸附劑的製備至關重要。人們根據金屬結合蛋白或某些蛋白中結合金屬的結構域組成特點，設計合成了一些金屬結合肽，如小肽「HP」(GHHPHG)、「CP」(「GCGCPCGCG」)，但這些小肽的親和力還不能滿足要求。而生物文庫技術，則提供了一條快捷、高效的獲得高親和力金屬結合肽的方法。2003年，Teruhiko等人運用噬菌體隨機十二肽庫篩選出鋅特異性結合肽(Matsubara T，et al.Selection of novel structural zincsites from a random peptide library.FEBS Letters，2003，555317-321)。
但是隨機肽庫具有自身的局限性，如由於目前技術條件所限，細菌轉化效率低，實測庫容量(complexity)常常比理論多樣性(diversity)低幾個數量級，這樣肽庫本身存在一定的偏性，可能導致一些展示高親和力多肽的克隆丟失。為了克服這一不足，人們又基於完全隨機(初級肽庫)提出的「偏性隨機肽庫」這一概念。構建初級肽庫時，編碼外源肽的DNA片段各位置四種鹼基等頻率出現，理論上表達的多肽也是由各種胺基酸隨機組成。對於特定的研究對象，通過篩選初級肽庫，可獲得具有保守序列的結合肽，或通過分析與其作用的蛋白分子胺基酸組成特點，便可能發現其中起關鍵作用的胺基酸殘基。偏性肽庫的構建就是在設計外源片段時，將這些關鍵胺基酸固定於特定的位置，而其它位置上的胺基酸為隨機的。在初級文庫基礎上構建的偏性肽庫，也稱為二級/次級肽庫，進而引伸出三級甚至更高級肽庫。進一步篩選偏性肽庫就可能得到更高親和力、特異性的結合肽，從而實現親和力成熟的目的(Urbanelli L.，et al.「Affinity maturation」of ligands for HCV-specific serum antibodies.J ImmunolMethods，2000，236167-176)。
此外，目前蛋白親和純化中常用的固定金屬親和層析樹脂多使用鎳離子，因而與鎳高親和力結合的小肽可以作為蛋白表達產物的純化標籤，如6×His標籤。

發明內容
我們設計、構建了兩個細菌鞭毛展示的偏性隨機肽庫，從中篩選出特異的鎳結合肽，這些結合肽具有高親和力。
本發明的目的是提供一類能夠特異結合金屬鎳的高親和和力的小分子多肽。
本發明的另一目的是提供這些高親和力的鎳結合肽在環境保護、礦藏開採、蛋白純化領域中的用途。
本發明的高親和力的鎳結合肽，是具有以下通式結構的7肽X-R-H-B-H-R-X，其中，X代表任何天然L-型胺基酸殘基或D-型異構體，R代表精氨酸殘基，H代表組氨酸殘基，B代表組氨酸殘基或精氨酸殘基。
具有上述結構模式的多肽能夠與金屬鎳特異結合。具體表現為，具有上述結構的多肽無論以何種形式，如細菌表面展示、化學合成、或基因工程方法重組表達，都能夠與金屬鎳特異結合，吸附溶液中的鎳離子或結合固定於樹脂等介質上的鎳。
本發明的小分子多肽可通過本技術領域的常規方法，如化學合成、或基因工程方法重組表達的方法製得。
本發明對研製鎳的微生物吸附劑具有重要意義，並具有巨大的生態效益、社會效益和經濟效益。另外，高親和力的鎳結合肽在設計新的蛋白純化標籤中也具有應用前景。
本發明構建的肽庫是通過使用pFliTrx N載體(Invitrogen)，外源肽插入到大腸桿菌硫氧環蛋白(thioredoxin，Trx A)一個結構緻密的活性環區中，Trx A則插入鞭毛蛋白中，外源肽以相對穩定的構象展示於細菌表面。將片段退火補平形成具有平滑末端的雙鏈，經過Cpo I與Nco I的雙酶切，將其插入pFliTrx N表達載體。並通過電轉化的方法將重組子導入到宿主菌內獲得次級文庫。


圖1合成的偏性隨機肽的寡核苷酸序列
斜體示保護鹼基，下劃線示酶切位點，陰影示linker。SGL1、SGL2分別代表兩個偏性隨機肽庫，P代表合成的寡核苷酸正義鏈，N代表合成的寡核苷酸反義鏈。X代表隨機的胺基酸殘基，H代表固定的組氨酸殘基，腳註數字代表胺基酸殘基的個數。
圖2細菌克隆固定鎳結合實驗結果陰性對照為C(代表初級肽庫)、SGL1、SGL2(分別代表兩個偏性隨機肽庫)，陽性對照為SGL7H(代表鎳結合肽HHHHHHH)，**代表結合肽2022與克隆SGL7H對固定鎳的相對結合力有顯著性差異(P＜0.01)。
圖3細菌克隆的游離鎳離子競爭抑制實驗結果陰性對照為C(代表初級肽庫)、陽性對照為SGL7H(代表鎳結合肽HHHHHHH)。
具體實施例方式
下面結合附圖對本發明作進一步詳細地描述。
實施例1 偏性隨機肽庫的構建1.寡聚核苷酸的設計與合成。隨機區採用NNK(T/G)的簡併寡核苷酸的設計，固定的組氨酸依照大腸桿菌偏愛的密碼子翻譯成核酸序列，並在兩端加入酶切位點及保護鹼基。化學合成法獲得兩條寡核苷酸鏈(參見附圖1)。
2.肽庫基因的獲得。分為兩步(1)退火，反應體系為等摩爾兩條核苷酸鏈，10×退火緩衝液(500mM Tris，pH8.0，500mM NaCl，10mM EDTA)，加水補足50μl。水浴鍋中加熱至95℃，緩慢冷卻至室溫。(2)補平，在補平反應體系中進行，體系中包括10×klenow緩衝液，10mM dNTPs，klenow酶(NewEngland Biolab公司產品)和退火反應體系。將退火產物補平成平滑末端。
3.pFliTrx-SGL重組子的構建。分為三步(1)酶切，分別對載體與基因片段進行Cpo I和Nco I的雙酶切(TaKaRa公司產品)。30℃水浴6小時，再37℃水浴10小時，終產物用超濾管純化回收(Millpore公司產品)。(2)pFliTrx和基因片段以摩爾比1∶3混合，10×T4DNA連接緩衝液40μl，T4DNA連接酶(12u/μl)10μl，加水至總體積400μl，分裝後，16℃水浴過夜。
4.轉化。大腸桿菌GI826(Invitrogen公司產品)按照產品說明書的製備方法製備電轉化感受態細胞。取感受態細胞50μl，加入純化濃縮後的連接產物1μl，冰浴30分鐘後，用電轉儀(Bio-Rad公司產品)進行轉化，迅速加入1ml SOC培養基(室溫)，移入轉化管中冰浴，將其餘連接產物分幾次轉化。將含全部轉化產物的2～3ml SOC培養基，37℃200r/min振搖45min，取10μl菌液適當稀釋後塗布於RMG-Amp培養板，於30℃培養箱中倒置培養過夜，計數原始細菌克隆。其餘菌液加入到10ml IMC培養基中，25℃振蕩培養15～18h，取樣鋪平板計數，餘者加甘油至終濃度為25％，分裝成若干管，-70℃凍存。
5.肽庫的鑑定。兩個偏性肽庫的庫容量分別為5.05×105cfu，3.62×105cfu。經擴增，兩肽庫的細菌克隆數分別為4.0×107cfu/ml，1.8×107cfu/ml。對原始重組菌克隆進行序列測定，各位置鹼基出現頻率與理論值接近。因而，所構建的兩個肽庫隨機核苷酸出現的頻率均滿足設計要求。分析推導出的胺基酸序列，85％以上的胺基酸出現頻率與理論頻率較為一致，達到建庫的要求。
實施例2偏性隨機肽庫的篩選1.親和篩選過程，分為步(1)擴增取肽庫50μl加入到2ml IMC中，25℃225-250r/min振蕩培養12-16h，測定OD600(1OD約1×109個細菌)。(2)誘導將擴增後的細菌以2×108cfu/ml的濃度接種至5ml IMC培養基中，加入終濃度100μg/ml色氨酸誘導，25℃225-250r/min振蕩培養6h。(3)孵育用無菌PBS洗滌鎳螯合酶聯條(QIAGEN公司產品)2次；取誘導後菌液(含4×108個細菌)與1％BSA、1％α-甲基甘露糖苷充分混勻後，室溫孵育30min，然後加入酶聯孔中，每孔200μl；室溫輕輕搖動孵育60min。(4)洗滌移去未結合的菌體，用無菌PBS洗滌4次，每次1min。(5)洗脫每孔加入150μl IMC培養基，室溫劇烈振蕩1min，洗脫結合的菌體。
2.塗板計數用IMC培養基適當稀釋洗脫液，取適量塗布於RMG-Amp培養板，待菌液幹後，於30℃培養箱中倒置培養過夜，計數細菌克隆數。
3.擴增洗脫產物洗脫產物除塗板計數部分外，其餘均擴增用於下一輪篩選。擴增的具體步驟同實施例2中1。
4.結果分別通過四輪富集，從兩個肽庫獲得的序列中共挑出37個克隆測序，分析這些序列，得到保守序列「X-R-H-B-H-R-X」(X代表任何天然胺基酸殘基，R代表精氨酸殘基，H代表組氨酸殘基，B代表組氨酸殘基或精氨酸殘基。)實施例3鎳結合肽與固定鎳的結合能力1.結合實驗，分別5步(1)清洗用無菌PBS洗滌鎳螯合的酶聯孔2次。(2)結合用IMC培養基稀釋誘導後的菌體，每孔加入200μl稀釋菌液(含2×108個細菌)，室溫輕輕搖動孵育60min。(3)清洗移去未結合的菌體，用無菌0.5％PBST洗滌4次，每次1min。(4)洗脫每孔加入150μl IMC培養基，室溫劇烈振蕩1min，洗脫結合的菌體；重複一次，將兩次洗脫液合併。(5)塗板計數。
2.實驗結果以結合肽2022(LRHRHRR)為例，以公認的多聚組氨酸(7×His)為陽性對照。二者的結合固定鎳的相對結合力統計學上有顯著性差異(2022＞7×His)(參見附圖2)。
實施例4游離鎳離子競爭鎳結合肽與固定鎳的結合1.結合實驗，分別5步(1)清洗用0.85％NaCl(5mmol/L HEPES，pH 7.1)洗滌鎳螯合的酶聯孔2次。(2)競爭結合將誘導後的菌體4,000r/min離心5min，用無菌0.85％NaCl(5mmol/L HEPES，pH 7.1)輕柔重懸，將菌液與不同濃度NiCl2溶液混和，每孔加入200μl二者的混和物(含2×108個細菌)，室溫輕輕搖動孵育60min。(3)清洗移去未結合的菌體，用無菌0.85％NaCl(5mmol/L HEPES，pH 7.1)洗滌2次；再用無菌0.5％PBST洗滌4次，每次1min。(4)洗脫每孔加入150μl IMC培養基，室溫劇烈振蕩1min，洗脫結合的菌體。(5)塗板計數。
實驗結果結合肽SGL7H、2022與固定鎳的結合均可被溶液中的鎳離子所抑制，且隨著鎳離子的濃度提高，競爭抑制作用明顯增強，最大抑制率均在95％以上(參見附圖3)。
權利要求
1.高親和力的鎳結合肽，具有以下通式結構的胺基酸組成X-R-H-B-H-R-X，其中，X代表任何天然L-型胺基酸殘基或D-型異構體，R代表精氨酸殘基，H代表組氨酸殘基，B代表鹼性胺基酸殘基。
2.如權力要求1所述的高親和力的鎳結合肽，其特徵在於B代表組氨酸殘基。
3.如權力要求1所述的高親和力的鎳結合肽，其特徵在於B代表精氨酸殘基。
4.如權力要求3所述的高親和力的鎳結合肽，其特徵在於胺基酸組成為L-R-H-R-H-R-R。
5.如權力要求1至4中的任意一項所述的高親和力的鎳結合肽在製備鎳的微生物吸附劑中的應用。
6.如權力要求1至4中的任意一項所述的高親和力的鎳結合肽在設蛋白質純化標籤中的應用。
全文摘要
本發明涉及一組能夠特異結合金屬鎳的高親和力結合肽。該結合肽的胺基酸組成為X－R－H－B－H－R－X，其中，X代表任何天然L－型胺基酸殘基或D－型異構體，R代表精氨酸殘基，H代表組氨酸殘基，B代表組氨酸殘基或精氨酸殘基。本發明的結合肽可應用於製備鎳的微生物吸附劑和設計蛋白質純化標籤。
文檔編號B01J20/22GK1911956SQ20051009028
公開日2007年2月14日 申請日期2005年8月12日 優先權日2005年8月12日
發明者董潔, 薛沿寧, 柳川, 邵寧生, 張 傑, 劉農樂, 王芳, 高波, 範明 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所