生產l-異亮氨酸的工程菌及其應用的製作方法

2023-05-01 06:36:36

專利名稱：生產l-異亮氨酸的工程菌及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種生產L-異亮氨酸的工程菌及其應用。
背景技術：
L-異亮氨酸(L-Ile)是人體八種必需胺基酸之一，又是三種支鏈胺基酸之一，因其特殊的結構和功能，在人類生命代謝中具有特別重要的地位。L-異亮氨酸對維持成人、嬰兒、兒童的生長發育有重要作用，缺乏可導致骨骼肌萎縮和變形。L-異亮氨酸廣泛應用於醫藥和食品領域，如果人體缺乏L-異亮氨酸，將導致食欲不振、體質下降、貧血及其它功能障礙。在醫學領域，L-異亮氨酸主要用於一般營養型複合胺基酸輸液、要素膳，大量用於配製治療型特種胺基酸輸液(如肝安、腎安胺基酸輸液，特別是以L-異亮氨酸為主要原料生產的高支鏈胺基酸輸液、肝安糖漿、肝靈口服液)，對治療各種肝臟疾病具有顯著療效，其用量逐年增長。近年來L-異亮氨酸在運動食品行業也得到廣泛關注，將L-異亮氨酸作為運動食品的添加劑，有助於增進肌肉的生長發育。L-異亮氨酸的主要生產方法有提取法、化學合成法、發酵法。提取法和化學合成法由於原料來源受限制、生產成本高、汙染環境，難以實現工業化生產。微生物發酵法生產L-異亮氨酸具有原料成本低、反應條件溫和、容易實現大規模生產等優點，是目前生產 L-異亮氨酸最主要的方法。直接發酵法藉助微生物具有合成自身所需胺基酸的能力，通過菌株的選育，以解除代謝調節中的反饋抑制和阻遏，達到過量積累L-異亮氨酸的目的，也是微生物發酵法當中工業應用最為廣泛的。國際上，L-異亮氨酸目前合計年產量約達900 噸。鑑於生產的高難度，L-異亮氨酸一直是高價胺基酸。

發明內容
本發明的目的是提供一種生產L-異亮氨酸的工程菌及其應用。本發明保護將重組質粒導入黃色短桿菌得到的重組菌；所述重組質粒為將ilvBN 蛋白(乙醯羥酸合成酶)的編碼基因和11^^蛋白(抗終產物異亮氨酸反饋抑制的蘇氨酸脫水酶)的編碼基因的表達盒插入出發載體的多克隆位點得到的重組質粒；所述黃色短桿菌的CICC編號為23655 ;所述ilvBN蛋白由多肽甲和多肽乙組成；所述多肽甲如序列表的序列I自N末端第I至562位胺基酸殘基所示；所述多肽乙如序列表的序列I自N末端第 563至659位胺基酸殘基所示；所述ilvAK蛋白如序列表的序列3所示。所述ilvBN蛋白的編碼基因可如序列表的序列2自5』末端第I至1983位核苷酸所示；所述ilvAK蛋白的編碼基因可如序列表的序列4自5』末端第191至1501位核苷酸所示。所述丨1￥^蛋白的編碼基因的表達盒自上遊至下遊可依次包括T7啟動子、所述 ilvAE蛋白的編碼基因和T7終止子。所述T7啟動子可如序列表的序列4自5』末端第I至 118位核苷酸所示。所述T7終止子可如序列表的序列4自5』末端第1581至1654位核苷酸所示。所述ilvAK蛋白的編碼基因的表達盒具體可如序列表的序列4所示。
所述重組質粒中，自上遊至下遊可依次包括所述ilvBN蛋白的編碼基因和所述 ilvAK蛋白的編碼基因的表達盒。所述出發載體具體可為載體PXMJ19。所述重組質粒具體可為將所述iIvBN蛋白的編碼基因插入所述載體pXMJ19的Pst I和BamHI酶切位點之間，所述ilvAK蛋白的編碼基因的表達盒插入所述載體pXMJ19的 EcoRI酶切位點得到的重組質粒。所述重組菌為具體可為黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)MFBF_04。黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)MFBF_04簡稱黃色短桿菌MFBF-04,已於2012年3月2日保藏於中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC ;地址中國武漢，武漢大學；郵編430072)，保藏編號為 CCTCC NO M 2012050。以上任一所述重組菌均可用於生產L-異亮氨酸。本發明還保護一種生產L-異亮氨酸的方法，包括如下步驟將以上任一所述的重組菌進行發酵，得到L-異亮氨酸。所述發酵採用的發酵培養基的製備方法具體如下取150g葡萄糖、10g(NH4)2S04、
I.5g KH2PO4 3H20、3g K2HPO4 3H20、0. 5g MgSO4 7H20、0. 015g FeSO4 7H20、
0.015gMnS04 H20、130ug維生素H、lmg維生素BI、豆餅水解液和30g CaCO3用去離子水溶解並定容至IL ;所述豆餅水解液的製備方法為將20g豆餅磨粉，加SOOmL去離子水拌勻， 調PH值為4. 0，沸水浴煮6個小時，5000g離心lOmin，上清即為豆餅水解液。所述發酵培養基的pH具體可為7. 0-7. 2。所述發酵的條件可為30°C、溶氧50-70%、96小時。所述發酵過程中可通過補加葡萄糖控制發酵體系的葡萄糖含量為0. 7-1. 0g/100mL。所述發酵的條件還可為30°C振蕩培養96小時所述重組菌具體可以以種子液的方式接種至所述發酵培養基。所述種子液是將所述重組菌接種至種子培養基進行培養得到的。所述種子液的OD6tltol具體可為28。所述培養的條件可為30°C、溶氧50-70%、14小時。所述培養的條件還可為30°C振蕩培養。所述種子培養基的製備方法具體如下取30g蔗糖、2g尿素、3. 7g CH3COONH4^gKH2PO4 3H20、
0.4g MgSO4 7H20、0. Olg FeSO4 7H20、0. Olg MnSO4 H20、豆餅水解液、2mg 維生素 H 和 Img 維生素B2，用去離子水溶解並定容至IL ;所述豆餅水解液的製備方法為將16g豆餅磨粉， 加500mL去離子水拌勻，調pH值為4. 0，沸水浴煮6個小時，5000g離心lOmin，上清即為豆餅水解液。所述種子培養基的PH具體可為7. 0-7. 2。本發明的提供的工程菌可直接發酵得到L-異亮氨酸，發酵96小時後，發酵液中的 L-異亮氨酸含量高達45g/L，極具生產應用價值。


圖I為重組質粒pMDilvAK的結構示意圖。圖2為載體pET28a的結構示意圖。圖3為重組質粒pETilvAK28a的結構示意圖。圖4為重組質粒pXMJ19_ilvBN的結構示意圖。圖5為重組質粒pXMJ19-ilvAKilvBN的結構示意圖。
具體實施例方式以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重複實驗，結果取平均值。穀氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)獲自美國模式培養物集存庫 (http://www. atcc. org/,簡稱 ATCC), ATCC 編號為 13032,簡稱穀氨酸棒桿菌 13032。黃色短桿菌(Brevibacterium fIavum)獲自中國工業微生物菌種保藏管理中心 (www. china-cicc. org/,簡稱 CICC), CICC 編號為 23655,簡稱黃色短桿菌 23655。實施例I、重組表達載體的構建一、ilvA基因的克隆及定點突變I、以穀氨酸棒桿菌13032的基因組DNA為模板，用Fl和Rl組成的引物對進行PCR 擴增，得到PCR擴增產物(ilvA基因片段)。Fl :5，-ATGAGTGAAACATACGTG-3，；Rl :5，-TTAGGTCAAGTATTCGTAC-3，。PCR擴增條件95°C預變性5分鐘；94°C變性40秒、55°C退火I分鐘、72°C延伸2 分鐘，30個循環；72°C保溫10分鐘。2、回收步驟I的PCR擴增產物並插入載體pMD-18T (購自於寶生物工程(大連) 有限公司)，得到重組質粒pMDilvA。3、以步驟I的重組質粒pMDilvA為模板，用F2和R2組成的引物對進行PCR擴增 (將ilvA基因片段進行定點突變，將定點突變後的基因命名為iIvAk基因)，得到PCR擴增產物(模板與突變後的環狀質粒的混合物)。4、將步驟3的PCR擴增產物用DPN I酶處理I小時(去除模板)，得到重組質粒 pMDilvAE0根據測序結果，對重組質粒pMDilvAK進行結構描述如下在載體pMD_18T中插入了序列表的序列4自5』末端第191至1501位核苷酸所示的ilvAK基因。重組質粒pMDilvAK 的結構示意圖見圖I。ilvAK基因與野生型ilvA基因的差異僅在於第526位的核苷酸由G 突變為了 C(也就是序列4中的第716位核苷酸。)F2 :5，-GCAACACCGTCATC |丨 GTCAGGGCAC-3，；R2 :5， -GATGACGGTGTTGCGAGCATCGAAA-3，。二、重組質粒pETilvAK28a的構建I、用限制性內切酶BamH I和Hind III雙酶切重組質粒pMDilvAK，回收約1300bp 的小片段。2、用限制性內切酶BamH I和Hind III雙酶切載體pET28a(購自於寶生物工程 (大連)有限公司；結構示意圖見圖2)，回收約5300bp的載體骨架。3、將步驟I的小片段和步驟2的載體骨架連接，得到重組質粒pETilvAK28a。根據測序結果，對重組質粒pETilvAK28a進行結構描述如下在載體pET28a的BamH I和Hind III酶切位點之間中插入了序列表的序列4自5』末端第191至1501位核苷酸所示的ilvAK 基因(編碼序列表的序列3所不的ilvAR蛋白)。重組質粒pETilvAR28a的結構不意圖見圖3。三、重組質粒pXMJ19_ilvBN的構建I、以穀氨酸棒桿菌13032的基因組DNA為模板，用F3和R3組成的引物對進行PCR 擴增，得到PCR擴增產物。F3 :5_』 GCCTGCAG ATGGCAAGITCGGGCA-3』 (下劃線標註 Pst I 酶切識別序列)R3 :5_』 GGATCC TTACTGAAAAAACACCG-3』 (下劃線標註 BamHI 酶切識別序列)。F3和R3的革E序列如序列表的序列2所不(序列表的序列2所不基因即為ilvBN 基因，編碼序列表的序列I所不的ilvBN蛋白)。PCR擴增條件95°C預變性5分鐘；94°C變性40秒、55°C退火I分鐘、72°C延伸2 分鐘，循環30次；72°C保溫10分鐘。2、用限制性內切酶Pst I和BamH I雙酶切步驟I的PCR擴增產物，回收酶切產物。3、用限制性內切酶Pst I和BamH I雙酶切載體pXMJ19 (購自於Biovector Science Lab, Inc),回收約6600bp的載體骨架。4、將步驟2的酶切產物和步驟3的載體骨架連接，得到重組質粒pXMJ19_ilvBN。 根據測序結果，對重組質粒pXMJ19-ilvBN進行結構描述如下在載體PXMJ19的Pst I和 BamH I酶切位點之間中插入了序列表的序列2所示的ilvBN基因(編碼序列表的序列I所示的ilvBN蛋白)。重組質粒pXMJ19-ilvBN的結構示意圖見圖4。四、重組質粒pXMJ19-ilvAK_ilvBN 的構建I、以重組質粒pETilvAK28a為模板，用F4和R4組成的引物對進行PCR擴增，得到 PCR擴增產物。F4:5' -GAATTC TTA ATA CGA CTC ACT ATA-3'(下劃線標註 EcoR I 酶切識別序列)；R4 :5' -GAATTC CAA AAA ACC CCT CAA GAC CCG TTT AG~3/ (下劃線標註 EcoR I酶切識別序列)。F4和R4的靶序列如序列表的序列4所示(序列4中自5』末端第I至118位核苷酸為17啟動子、第191至1501位核苷酸為ilvAK基因、第1581至1654位核苷酸為17終止子。PCR擴增條件5°C預變性5分鐘；94°C變性40秒、57°C退火I分鐘、72°C延伸2分鐘，循環25次；72°C保溫10分鐘。2、用限制性內切酶EcoR I酶切步驟I的PCR擴增產物，回收酶切產物。3、用限制性內切酶EcoR I酶切重組質粒pXMJ19_ilvBN，回收約9000bp的載體骨架。4、將步驟2的酶切產物和步驟3的載體骨架連接，得到重組質粒 pXMJ19-i lvAE-i IvBN0根據測序結果，對重組質粒pXMJ19_ilvAK_ilvBN進行結構描述如下 在重組質粒pXMJ19-ilvBN的EcoR I酶切位點插入了序列表的序列4所示的DNA分子。重組質粒pXMJ19-ilvAK-ilvBN的結構示意圖見圖5。實施例2、工程菌的構建將重組質粒pXMJ19_iIvAk-HvBN電擊轉化黃色短桿菌23655原生質體，然後用F3 和R4組成的引物對進行PCR鑑定(顯示約4. Ikb的特異條帶的為PCR鑑定陽性)，得到重組菌。將一株重組菌命名為黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)MFBF_04。黃色短桿菌 (Brevibacterium flavum)MFBF-04簡稱黃色短桿菌MFBF-04,已於2012年3月2日保藏於中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC ;地址中國武漢，武漢大學；郵編430072)，保藏編號為 CCTCC NO M 2012050。實施例3、應用黃色短桿菌MFBF-04生產L-異亮氨酸一、培養基的製備種子培養基(pH= 7. 0-7. 2)取 30g 蔗糖、2g 尿素、3. 7g CH3COONH4'3g KH2PO4 · 3Η20、0· 4g MgSO4 · 7Η20、0· Olg FeSO4 · 7Η20、0· Olg MnSO4 ·Η20、豆餅水解液(將 16g 豆餅磨粉，加500mL去離子水拌勻，加入6mol/L的鹽酸調pH值為4. 0，沸水浴蒸煮6個小時，5000g離心lOmin，上清即為豆餅水解液)、2mg維生素H和Img維生素B2，用去離子水溶解並定容至IL ;115°C滅菌15min。發酵培養基(pH= 7. 0-7. 2):取 150g 葡萄糖、IOg (NH4) 2S04、I. 5g KH2PO4.3H20、3g K2HPO4 · 3Η20、0· 5g MgSO4 · 7Η20、0· 015g FeSO4 · 7Η20、0· 015g MnSO4 · H20、130ug 維生素 Η、 Img維生素BI、豆餅水解液(將20g豆餅磨粉，加800mL去離子水拌勻，加入6mol/L的鹽酸調PH值為4. O，沸水浴蒸煮6個小時，5000g離心lOmin，上清即為豆餅水解液)和30g CaCO3 用去離子水溶解並定容至IL ;115°C滅菌15min。二、搖瓶發酵生產L-異亮氨酸I、應用黃色短桿菌MFBF-04生產L-異亮氨酸(I)種子培養將一環黃色短桿菌MFBF-04斜面種子接種至裝有30mL種子培養基的250mL搖瓶中，8層紗布封口，30°C振蕩培養(200r/min)至對數生長中後期，得到種子液(種子液的 OD600rml = 28)。(2)發酵培養將3mL種子液接種至裝有27mL發酵培養基的500mL三角瓶中，8層紗布封口，30°C 振蕩培養(200r/min)96小時。(3)將步驟⑵的發酵體系離心(室溫25°C、5000g、15min)，收集上清液(發酵液)。2、對照液的製備將黃色短桿菌23655代替黃色短桿菌MFBF-04進行步驟I的實驗，收集上清液(對照液)。3、檢測L-異亮氨酸含量檢測發酵液或對照液中的L-異亮氨酸含量(採用日立L-8800型胺基酸自動分析儀進行測定)。發酵液中的L-異亮氨酸濃度為7g/L，對照液中的L-異亮氨酸濃度為O. 9g/L。三、工業發酵生產L-異亮氨酸將黃色短桿菌MFBF-04 (或黃色短桿菌23655)進行30L全自動發酵罐進行補料分批發酵，具體步驟如下I、第一階段培養
採用30L發酵罐，種子培養基的裝液量為20L，培養時間為14小時，溶氧 (DO) 50-70%，溫度300C ;得到種子液(種子液的OD600nm = 28)。2、第二階段培養採用30L發酵罐，發酵培養基的裝液量為20L，培養時間為96小時(通過控制流加75 %的葡萄糖水溶液，維持發酵罐中的葡萄糖含量為0. 7-1. 0g/100mL)，溶氧 (DO) 50-70%，溫度 30。。。3、將步驟2的發酵體系(4°C、5000g、15min)，收集上清液(發酵液)。黃色短桿菌MFBF-04發酵液中的L-異亮氨酸濃度為45g/L，黃色短桿菌23655發酵液中的L-異亮氨酸濃度為5g/L。
權利要求
1.將重組質粒導入黃色短桿菌得到的重組菌；所述重組質粒為將ilvBN蛋白的編碼基因和ilvAK蛋白的編碼基因的表達盒插入出發載體的多克隆位點得到的重組質粒；所述黃色短桿菌的CICC編號為23655 ;所述ilvBN蛋白由多肽甲和多肽乙組成；所述多肽甲如序列表的序列I自N末端第I至562位胺基酸殘基所示；所述多肽乙如序列表的序列I自N 末端第563至659位胺基酸殘基所示；所述ilvAK蛋白如序列表的序列3所示。
2.如權利要求I所述的重組菌，其特徵在於所述ilvBN蛋白的編碼基因如序列表的序列2所示；所述ilvAK蛋白的編碼基因如序列表的序列4自5』末端第191至1501位核苷酸所示。
3.如權利要求I或2所示的重組菌，其特徵在於所述ilvAK蛋白的編碼基因的表達盒自上遊至下遊依次包括T7啟動子、所述ilvAK蛋白的編碼基因和T7終止子。
4.如權利要求I至3中任一所述的方法，其特徵在於所述重組質粒中，自上遊至下遊依次包括所述ilvBN蛋白的編碼基因和所述ilvAK蛋白的編碼基因的表達盒。
5.如權利要求I所述的重組菌，其特徵在於所述出發載體為載體PXMJ19。
6.如權利要求5所述的重組菌，其特徵在於所述重組質粒為將所述ilvBN蛋白的編碼基因插入所述載體PXMJ19的Pst I和BamH I酶切位點之間，所述ilvAK蛋白的編碼基因的表達盒插入所述載體PXMJ19的EcoR I酶切位點得到的重組質粒。
7.如權利要求6所述的重組菌，其特徵在於所述重組菌為黃色短桿菌 (Brevibacterium f lavum) MFBF-04，它的保藏編號為 CCTCC NO M 2012050。
8.權利要求I至7中任一所述的重組菌在生產L-異亮氨酸中的應用。
9. 一種生產L-菌進行發酵，得到L-異亮氨酸的方法，包括如下步驟 -異亮氨酸。:將權利要求I至7中任一所述的重組
全文摘要
本發明公開了一種生產L-異亮氨酸的工程菌及其應用。本發明提供了將重組質粒導入黃色短桿菌得到的重組菌；所述重組質粒為將ilvBN蛋白的編碼基因和ilvAR蛋白的編碼基因的表達盒插入出發載體的多克隆位點得到的重組質粒；所述黃色短桿菌的CICC編號為23655；所述ilvBN蛋白如序列表的序列1所示；所述ilvAR蛋白如序列表的序列3所示。本發明的提供的工程菌可直接發酵得到L-異亮氨酸，發酵96小時後，發酵液中的L-異亮氨酸含量高達45g/L，極具生產應用價值。
文檔編號C12N1/21GK102604881SQ201210101460
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月31日 優先權日2012年3月31日
發明者吳偉斌, 吳松剛, 施巧琴, 林宜云, 翁雪清, 趙燕玉, 陳炳生, 黃欽耿 申請人:福建省麥丹生物集團有限公司