一種高效發酵生產l-異亮氨酸的方法
2023-05-01 06:43:36
專利名稱：一種高效發酵生產l-異亮氨酸的方法
一種高效發酵生產L-異亮氨酸的方法技術領域：
本發明涉及一種高效發酵生產L-異亮氨酸的方法，屬於發酵法生產 胺基酸的技術領域。背景技術：
=L-異亮氨酸是人體八種必需胺基酸之一，同時又是三種分支鏈氨基 酸之一，能治療神經障礙、食慾減退和貧血，在人類生命代謝中佔有特別重要的地位。但由 於目前L-異亮氨酸價格昂貴，因此主要用於配製複合胺基酸製劑，特別應用於高支鏈氨基 酸輸液(如3H輸液等)及口服液(肝安幹糖漿等)。故而，異亮氨酸在醫藥、食品方面都有 著廣泛的應用。目前國際上日本在生產L-異亮氨酸方面佔壟斷地位，合計年產量400-500 噸。鑑於L-異亮氨酸生產的高難度，L-異亮氨酸一直是高價胺基酸，國際市場醫藥級價格 高達60-80美元/kg。國內由於菌種產酸性能差、工藝落後，L-異亮氨酸產量低，絕大部分 依靠進口，尤其是醫藥級異亮氨酸，每年消耗大量外匯。與日本相比較，我國的L-異亮氨酸 生產水平還很低下，而且異亮氨酸的生產能力與我國巨大的市場需求也很不相稱。異亮氨 酸發酵是典型的代謝控制發酵，L-異亮氨酸生產方法有提取法、化學合成法和發酵法三類， 但目前在工業生產上實施的只有發酵法。由於化學合成法生產的L-異亮氨酸與其它異構 體分離困難，因而未能實現工業化生產。發酵法就是利用微生物的代謝作用，生物合成並過 量積累L-異亮氨酸，包括添加前體物發酵法和直接發酵法兩類。目前，異亮氨酸發酵的生 產技術還不成熟。人們都在為提高異亮氨酸產量和轉化率方面做努力，主要集中在基因工 程手段定向選育異亮氨酸高產菌株、發酵過程控制與優化等方面。在異亮氨酸發酵過程中，發酵條件如生物素、碳源、氮源、無機鹽、pH、溫度及溶氧 等對異亮氨酸的合成都具有重要影響。其中，底物(如葡萄糖)濃度是控制菌體代謝過程 的一個重要參數，主要通過控制相關酶的合成或活性影響菌體的代謝途徑。葡萄糖可通過 「葡萄糖效應」阻遏、抑制多種酶的合成，如胺基酸合成酶等，這種阻遏作用主要是其分解代 謝物引起的。在以葡萄糖為碳源的異亮氨酸發酵中，葡萄糖的分解代謝物阻遏會引起多種 副產物如乳酸的積累，從而影響糖酸轉化率。此外，溶氧也是一個至關重要的因素，雜酸的 產生和碳架的浪費與溶解氧濃度密切相關。因此在發酵過程中必須控制合適溶氧，以改變 代謝流分布，增大L-異亮氨酸產率，減少雜酸的生成。目前，我國異亮氨酸發酵行業主要採用補料分批發酵模式。在這種生產模式中，維 持一定的底物(如葡萄糖)濃度對於異亮氨酸的發酵非常重要。為達到經濟技術的要求，要 提高單批次發酵過程中的穀氨酸產量就要提高初始培養基中的底物(如葡萄糖)濃度，但 底物(如葡萄糖)濃度過高引起滲透壓過大，影響菌體的正常代謝及異亮氨酸的產量。反 之，初始葡萄糖濃度較低有利於菌體的生長，但後期發酵液中的殘糖迅速耗盡，其生產能力 不能得到最大限度的發揮。與此同時，在目前的生產模式中，溶氧濃度往往不能得到很好的 控制，不是供氧不足就是供氧過量，而且溶氧水平浮動很大，不能長時間穩定的維持在一個 恰當的水平上。在溶氧過低的條件下，TCA循環代謝流量減小，不足以平衡葡萄糖酵解速率， 從而刺激了乳酸脫氫酶的酶活，使代謝流轉向乳酸生成，造成乳酸積累；而溶氧過高時，TCA 循環流量加大，生成大量CO2，造成碳源損失，兩種情況均不利於異亮氨酸生成。此外，現有 的很多L-異亮氨酸發酵培養基配方都不能很好的最大限度去滿足其相應生產菌株的生長代謝和產酸要求。
發明內容本發明的目的在於克服現有的異亮氨酸生產方法發酵產酸量較低、 糖酸轉化率低等缺陷，提供一種高效發酵生產L-異亮氨酸的方法。在不增加額外設備和人 力投入的情況下，實現了整個發酵周期的縮短和L-異亮氨酸產量和轉化率的提高。本發明的目的是通過如下技術方案實現的本發明提供的一種高效發酵生產L-異亮氨酸的方法，包括種子培養和進行好氧 發酵，其特徵是發酵過程中，通過調節發酵罐攪拌轉速和風量將溶氧控制在適當的水平 上，使整個發酵過程既不產生較多乳酸，也不導致由於TCA循環流量加大生成大量CO2而造 成碳源大量流失，通過流加液氨控制PH，通過流加適量泡敵消泡，並通過流加一定濃度的葡 萄糖溶液將殘糖控制在一定水平，使整個發酵過程中既不產生葡萄糖抑制，也不構成底物 限制，發酵至60h停止。該方法的具體步驟如下(1)培養種子配製種子培養基[葡萄糖3%、酵母粉0.5%、硫酸銨0.5%豆餅水 解液 2. 5%、玉米菜 3%, KH2PO4 · 3H20 0. 2%, MgSO4 · 7H20 0. 08% ]，121°C滅菌 15min ；將 菌種接入種子培養基中，接種量一般為5%;在適宜的溫度、pH和溶氧條件下於5L自動控制 發酵罐中培養至對數期。(2)好氧發酵將步驟(1)製得的種液以10% 20%接種量接種發酵，分段控制 發酵液溫度0 45h為31°C，46 60h為28V ；通入適當空氣，調節適當攪拌轉速，採用 分階段供氧模式控制溶氧0 20h為25%，20 60h為15% ；通過自動流加液氨控制pH 在7. 0 7. 2 ；通過流加適量泡敵消泡；並通過流加濃度為500 800g/L的葡萄糖溶液將 殘糖控制在0. 8 2. 0%，發酵至60h停止。本發明的優點和積極效果與現有工藝相比，本發明的方法具有以下特點1、本發明通過適當流加較高濃度的葡萄糖溶液將殘糖濃度控制在恰當水平，使整 個發酵過程中既不因葡萄糖濃度過高而引起滲透壓過大且產生「葡萄糖效應」阻遏分解代 謝物，也不因葡萄糖濃度過低而構成底物限制，使發酵液中的殘糖迅速耗盡，導致菌種生產 能力不能得到最大限度的發揮；2、本發明通過適當調節發酵罐攪拌轉速和風量將溶氧濃度控制在恰當的水平上， 使整個發酵過程中既不因溶氧濃度過低導致TCA循環代謝流量減小，不足以平衡葡萄糖酵 解速率，從而刺激了乳酸脫氫酶的酶活，使代謝流轉向乳酸生成，造成乳酸積累，也不因溶 氧濃度過高導致TCA循環流量加大生成大量C02而造成碳源的大量流失；3、本發明在與現有生產工藝相比不增加任何額外設備和人力投入的情況下，縮短 了整個發酵周期，發酵周期培養縮短至56 60h，並大幅提高了 L-異亮氨酸的產量(28g/L 以上)和轉化率(18%以上)，整個工藝過程操作簡便，生產成本較低，經濟效益顯著，十分 適合於工業化生產。
具體實施方式實施例1 使用的微生物菌種為現有異亮氨酸生產菌。將菌種接入種子培養基[葡萄糖3 %、酵母粉0.5%、硫酸銨0.5%、豆餅水解液2.5%、玉米漿3 %、KH2PO4 · 3H20 0.2%、 MgSO4 『 7H20 0.08%。用NaOH和鹽酸調pH至7.0 7. 2，121 °C滅菌15min]中，接種量為 5%;在31°C、pH為7.0和溶氧為20%條件下於5L自動控制發酵罐中培養15h至對數生長中 後期，按10%的接種量接入含有發酵培養基[葡萄糖8%、硫酸銨0. 4%、玉米漿1%、豆餅 水解液 3%、MgSO4 · 7H20 0.1%,FeSO4 · 7H20 0. 002%、MnSO4 · H2O 0. 002%、KH2PO4 0.1%, Vbi 0. 00001%,Vh 0.00001%。用 NaOH 和鹽酸調 pH 至 7. 0 7. 2，115°C滅菌 15min]的 5L 自動控制發酵罐中，分段控制發酵液溫度0 45h為31°C，46 60h為28 °C，通入適當空 氣，調節適當攪拌轉速，採用分階段供氧模式控制溶氧0 20h為25%，20 60h為15%， 通過自動流加液氨控制pH在7. 0 7. 2，通過流加適量泡敵消泡，並通過流加濃度為500g/ L的葡萄糖溶液將殘糖控制在0. 8 %，發酵至60h停止。L-異亮氨酸的產量為28. 9g/L，糖 酸轉化率為18.3%。實施例2:使用的微生物菌種為現有異亮氨酸生產菌。將菌種接入種子培養基(同實施例1) 中，接種量為5%;在31°C、pH為7.0和溶氧為20%條件下於5L自動控制發酵罐中培養15h 至對數生長中後期，按15%的接種量接入含有發酵培養基[葡萄糖10%、硫酸銨0.6%、 玉米漿 1. 2%、豆餅水解液 3. 3%, MgSO4 · 7H20 0. 15%, FeSO4 · 7H20 0. 0025%, MnSO4 · H2O 0. 0025%, KH2PO4O. 15%, Vbi 0. 000015%, Vh 0. 000015% 用 NaOH 和鹽酸調 pH 至 7· 0 了^，丨巧！滅菌巧!^!!]的5L自動控制發酵罐中，控制發酵液溫度31°C，通入適當空氣，調節 適當攪拌轉速，採用分階段供氧模式控制溶氧0 20h為25%，20 60h為15%，通過自 動流加液氨控制pH在7. 0 7. 2，通過流加適量泡敵消泡，並通過流加濃度為800g/L的葡 萄糖溶液將殘糖控制在0. 8 2. 0%，發酵至60h停止。L-異亮氨酸的產量為29. 6g/L，糖 酸轉化率為19.4%。實施例3 使用的微生物菌種為現有異亮氨酸生產菌。將菌種接入種子培養基(同實施例1) 中，接種量為5%;在31°C、pH為7.0和溶氧為20%條件下於5L自動控制發酵罐中培養15h 至對數生長中後期，按20%的接種量接入含有發酵培養基[葡萄糖12%、硫酸銨0. 8%、 玉米漿 1. 5%、豆餅水解液 3. 5%, MgSO4 · 7H20 0. 2%, FeSO4 · 7H20 0. 003%, MnSO4 · H2O 0. 003%,KH2PO4 0. 2%,Vbi 0. 00002%,Vh 0. 00002% 用 NaOH 和鹽酸調 pH 至 7· 0 7· 2， 115°C滅菌15min]的5L自動控制發酵罐中，分段控制發酵溫度0 45h為31 °C，46 60h為28°C，通入適當空氣，調節適當攪拌轉速，採用分階段供氧模式控制溶氧0 20h為 25%，20 60h為15%，通過自動流加液氨控制pH在7. 0 7. 2，通過流加適量泡敵消泡， 並通過流加濃度為800g/L的葡萄糖溶液將殘糖控制在2. 0%，發酵至60h停止。L-異亮氨 酸的產量為31. 8g/L，糖酸轉化率為20.5%。
權利要求
一種高效發酵生產L 異亮氨酸的方法，包括種子培養和進行好氧發酵，其特徵是發酵過程中，通過調節發酵罐攪拌轉速和風量將溶氧控制在適當的水平上，使整個發酵過程既不產生較多乳酸，也不導致由於TCA循環流量加大生成大量CO2而造成碳源大量流失，通過流加液氨控制pH，通過流加適量泡敵消泡，並通過流加一定濃度的葡萄糖溶液將殘糖控制在較低水平，使整個發酵過程中既不產生葡萄糖抑制，也不構成底物限制，發酵至60h停止。
2.根據權利要求1所述的方法，採用的溫度為28-32°C。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵是所述的發酵液的溶氧濃度為分階段控制 0 23h 為 10-30%，23 60h 為 5-20%。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵是所述發酵液中各組分佔總量的百分比為 接種量10 20%，葡萄糖8 12%，(NH4)2SO 0. 4 0. 8%，玉米漿1 1. 5%，豆餅水解 液 3 3. 5 %，MgSO4 · 7Η20 0. 1 0. 2 %，FeSO4 · 7Η200· 002 0. 003 %，MnSO4 0. 002 0. 003%, KH2PO4 0. 1 0. 2%, VbiOOOOI 0. 00002%, Vh 0. 00001 0. 00002%。
全文摘要
一種高效發酵生產L-異亮氨酸的方法。解決現有生產工藝產酸量較低且糖酸轉化率低等問題。本發明包括利用本實驗室產異亮氨酸的菌株，以一些營養組分按一定比例配製成營養豐富且均衡的培養基作為發酵培養基，發酵過程中，通過調節發酵罐攪拌轉速和風量將溶氧控制在適當的水平上，通過流加液氨控制pH，並通過流加一定濃度的葡萄糖溶液將殘糖控制在較低水平，發酵至60h停止。本發明在不增加任何額外設備和人力投入的情況下，縮短了整個發酵周期，並大幅提高了L-異亮氨酸的產量(28g/L以上)和轉化率(18％以上)，整個工藝過程操作簡便，生產成本較低，十分適合於工業化生產。
文檔編號C12P13/06GK101962663SQ20101052746
公開日2011年2月2日 申請日期2010年11月2日 優先權日2010年11月2日 公開號201010527464.X
發明者劉淑雲, 徐慶陽, 白亞磊, 謝希賢, 陳寧 申請人:天津科技大學