一種鑑定微生物肥料中沼澤紅假單胞菌的方法

2023-04-29 14:57:06 1

專利名稱：一種鑑定微生物肥料中沼澤紅假單胞菌的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體而言，涉及利用適當的引物通過PCR反應，檢測微生物肥料中沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris(Molish)van Niel)的方法，以及在該方法中所用的引物。

背景技術：
光合細菌(Photosynthetic Bacteria，簡稱PSB)是地球上最早出現的一大類能以光作為能源，以CO2和有機物作為光合作用碳源，以有機物、氫氣或硫化物為供氫體而營養繁殖的原核生物的總稱。它廣泛分布在海洋、河川、沼澤、水溝、活性汙泥、土壤、極地、溫泉和高鹽水體等各種生境中。光合細菌因具有複雜多樣的代謝功能、豐富的營養及生理活性物質等特性，使之在種植業、養殖業以及環境廢水處理等方面得到了廣泛應用。以光合細菌為菌種生產的微生物肥料產品在水稻、蔬菜、果樹和菸草等作物上都取得了較好效果，研究表明光合細菌具有改善土壤的結構和營養狀況、提高土壤肥力、增強作物抗病防病能力、提高作物的光合作用能力、提高作物品質等等方面功效。
鑑於光合細菌多功能性，人們希望將其應用於微生物肥料以提高肥效。為確保含光合細菌的微生物肥料產品的使用效果，需要明確肥料產品中的光合細菌的種類和質量。因而需要一種使用簡便，結果準確的質量檢測技術應用於產品質量監督環節。目前使用的傳統光合細菌菌種鑑定是以形態特徵和各項生理生化方法為主，操作步驟煩瑣，檢測時間較長，並且特異性差。因此，迫切需要研究建立快速、準確、靈敏的光合細菌檢測新方法，以滿足光合細菌產品的質量檢測的準確性和時效性。
PCR方法有著快速、準確和靈敏的特點，已經在醫學和衛生檢測方面得到了廣泛的應用，有報導稱目前已對多種病毒和病源菌，例如B肝病毒、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等建立了基於PCR技術的檢測方法。為將PCR技術應用於微生物肥料檢測領域，本發明人通過反覆摸索實踐建立了一種基於PCR技術的、快速、準確、靈敏地檢測微生物肥料生產中常用的光合細菌的方法。該方法特別適用於沼澤紅假單胞菌的鑑定。本發明是通過下述的技術方案實現的。


發明內容
本發明的目的在於提供一種應用特異引物PCR技術對微生物肥料中常見的光合細菌進行鑑定的方法。在本發明的一個優選的實施方案中提供了通過特異引物PCR技術鑑定沼澤紅假單胞菌和其產品菌種的鑑定方法。在進一步優選的實施方案中，所述的沼澤紅假單胞菌純菌種。本發明的另一目的在於提供上述鑑定方法中所用的特異引物。
具體而言，本發明基於已知的沼澤紅假單胞菌16S rDNA核酸序列，設計了上述菌種的特異引物。通過優化PCR反應中的鎂離子濃度和退火溫度等條件來提高PCR方法的特異性，並根據優化結果建立了沼澤紅假單胞菌的PCR鑑定方法，用於檢測微生物肥料中光合細菌產品的沼澤紅假單胞菌。
本專利發明的鑑定沼澤紅假單胞菌的PCR方法為 上遊引物15』-GCGGGAAGATAATGACGGT； 下遊引物25』TGGTAGCAACTAAGGACGG. PCR反應體系110×buffer2μL dNTPs(10mmol/L) 1.6μL 引物1(10μmol/L)0.5μL 引物2(10μmol/L)0.5μL Taq E(2.5U/μL) 0.2μL 模板DNA 2.0μL 鎂離子(25mmol/L)0.8μL 補足ddH2O 20μL PCR擴增參數195℃5min
72℃ 30s 72℃ 10min


圖1為應用沼澤紅假單胞菌特異引物對標準菌株進行PCR的實驗結果(照片)如所示。其中，各泳道的具體說明如下 泳道1多粘類芽孢桿菌(Paenibacillu polymyxa) 泳道2短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis) 泳道3枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 泳道4蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis) 泳道5膠腖樣芽孢桿菌(Bacillus mucilaginosus) 泳道6側孢短芽孢桿菌(Brevibibacillus laterosporus) 泳道7大腸桿菌(Escherichia coli) 泳道8地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) 泳道9短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus) 泳道10巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium) 泳道11固氮類芽孢桿菌(Paenibacillus azotofixans) 泳道12解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) 泳道13施氏假單胞(Pseudomonas stutzeri) 泳道14嗜酸紅假單胞菌(Rhodopseudomonas acidophila) 泳道15莢膜紅細菌(Rhodobacter capsulatus1.2359) 泳道16類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides1.2182) 泳道17類球紅細菌(Rhodobacter phaeroides1.1737) 泳道18類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides 1.2174) 泳道19沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris1.2180) 泳道20沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris1.2349) 泳道21沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris1.2352) 泳道22沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris HN1) 泳道23沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris ACCC981) 泳道24100bp標準分子量。
圖2為沼澤紅假單胞菌PCR鑑定方法對5光合細菌產品鑑定結果。各泳道的具體說明如下 泳道11號樣品； 泳道22號樣品； 泳道33號樣品； 泳道44號樣品； 泳道55號樣品。
泳道6100bp標準分子量； 實施例 下面結合附圖對本發明具體實施方案進一步說明。本領域的技術人員應當了解，下述的實施例方案是示例性的技術方案以說明本發明， 實施例1 通過應用沼澤紅假單胞菌特異性引物的PCR方法對標準菌株的檢測 (1)材料 測試菌下面表1所列菌株為待測標準菌株 表1 (2)引物的設計和合成 根據沼澤紅假單胞菌的16S rDNA核酸序列序列設計沼澤紅假單胞菌特異性引物。所述引物如表2所示。所述引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。
表2 (3)DNA提取取1.5mL菌液於Eppendorf管中，9000r/min離心4min收集菌體，-20℃保存。將收集到的菌體用1×TE緩衝液洗滌菌體2次，再加入500μL GUTC緩衝液，混合均勻，靜置20min後，每管加入20μL～30μL硅藻土吸附液，振蕩均勻後室溫放置15min。再13000r/min離心30s，棄上清液後，加入20mLGUTC緩衝液，混合均勻後室溫放置10min，再13000r/min離心30s。洗滌緩衝液洗滌上述硅藻土沉澱3次，每次300μL。再用200μL 70％的酒精洗滌硅藻土沉澱1次，13000r/min離心2min，棄上清液，真空抽乾。最後根據每管加入硅藻土的量，向每管加入20μL～30μL 1XTE緩衝液，在渦旋振蕩器上充分混合均勻，65℃保溫30min後，13000r/min離心5min，然後小心將上清液移至另一支已編號的Eppendorf管，該溶液即為從菌株中提取的DNA樣品。DNA樣品貯藏於-20℃。
(4)PCR檢測 (4.1)PCR混合物製備 按表3所示配方，在100uLPCR管中加入試劑和DNA溶液，製備成PCR混合液。
表3 (4.2)把含有由4.1製備的混合液的100uLPCR管放入PCR儀中進行PCR反應。具體步驟是，95℃進行熱變性5min後，完成如下30個循環95℃熱變性40s，60℃退火/復性40s，72℃延長反應30s。最後72℃延長反應10min。
(4.3)電泳 完成PCR擴增後，取5μL反應混合液，與1μL上樣緩衝液混合均勻後，在EB染色30min的1％瓊脂糖凝膠上進行電泳，140V穩壓電泳50min。
(4.4)觀察 完成電泳後，通過凝膠圖像分析儀下觀察結果。
(4.5)結果 該實驗結果(照片)如圖1所示。
根據照片所示結果，5株沼澤紅假單胞菌均出現了一條大小為646bp的特異條帶，而其他測試菌則條帶產生，這說明本發明的特異引物能夠可靠地檢測和鑑定沼澤紅假單胞菌。
實施例2 PCR鑑定方法的應用 (1)材料 5個光合細菌菌劑產品。其中4個產品使用的菌種為沼澤紅假單胞菌，1個產品使用的菌種為類球紅細菌。
(2)DNA提取 按實施例1(3)方法提取上述5個光合細菌菌劑產品的DNA。
(3)PCR方法鑑定樣品 分別按實施例1和實施例2中的步驟(4)進行。
(4)傳統方法鑑定樣品 將樣品在R培養基瓊脂平板上劃線，在厭氧條件下，28℃～30℃光照培養4～7天。挑出典型菌落，重新劃線培養，直到菌落一致為止。對已純化好的光合細菌做一下幾項生理生化實驗檸檬酸鹽、硫代硫酸鈉、乙醇、甘露醇和酒石酸鹽利用實驗(參照東秀珠《常見細菌系統鑑定手冊》，科學出版社，2001年)。
(5)結果 沼澤紅假單胞菌PCR鑑定方法對5個光合細菌產品鑑定結果如圖2所示。PCR鑑定方法與傳統方法鑑定結果比較如表5所示。 表5 +表示檢測到，-表示未檢測到。
對比PCR鑑定方法和傳統鑑定方法測定結果可知，5個樣品的菌種PCR鑑定結果與傳統方法鑑定結果相吻合。這表明本發明的引物和方法能夠可靠地鑑定光合細菌產品中的沼澤紅假單胞菌。
權利要求
1.一種沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas.palustris(Molish)vanNiel)的鑑定方法，其包括應用沼澤紅假單胞菌特異性引物，通過PCR反應進行檢測的步驟。
2.根據權利要求1所述的核酸引物及鑑定方法，其中所述的沼澤紅假單胞菌特異性引物對為
引物15』-GCGGGAAGATAATGACGGT；
引物25』TGGTAGCAACTAAGGACGG.
3.根據權利要求1所述的核酸引物及鑑定方法，其特徵是PCR反應體系包括
10×buffer 2μL
dNTPs(10mmol/L)1.6μL
引物(10μmol/L)各0.5μL
Taq E(2.5U/μL)0.2μL
模板DNA2.0μL
鎂離子(25mmol/L) 0.8μL
補足ddH2O 20μL
PCR擴增參數95℃ 5min
72℃ 30s
72℃ 10min。
4.沼澤紅假單胞菌特異鑑定用引物，其特異性引物對為
引物15』-GCGGGAAGATAATGACGGT；
引物25』TGGTAGCAACTAAGGACGG.
5.權利要求4中的引物在沼澤紅假單胞菌鑑定中的用途。
6.權利要求4中的引物在微生物肥料菌種鑑定中的用途。
全文摘要
本發明提供了一種簡單、快速檢測和鑑定微生物肥料中沼澤紅假單胞菌的技術。本技術設計了沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris(Molish)van Niel)的特異引物，建立了沼澤紅假單胞菌的PCR鑑定方法，可以根據樣品基因組DNA的PCR擴增結果，對微生物肥料光合細菌產品中的沼澤紅假單胞菌進行檢測和鑑定。
文檔編號C12Q1/04GK101195841SQ20071030432
公開日2008年6月11日 申請日期2007年12月27日 優先權日2007年12月27日
發明者關大偉, 俊 李, 沈德龍, 昕 姜, 曹鳳明, 力 李, 陳慧君 申請人:中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所