紅錐無菌外植體製備及初始芽誘導方法與流程

2023-04-29 02:10:41 3

本發明屬於植物組織培養技術領域，尤其是涉及一種紅錐無菌外植體製備及初始芽誘導方法。

背景技術：

紅錐( Castanopsis hystrix A .DC )隸屬殼鬥科( Fagaceae )栲屬( Castanopsis )，成年樹高可達30m，胸徑1m以上，是我國南亞熱帶和亞熱帶植被常綠闊葉林的優勢組成樹種，屬華南地區重要的鄉土闊葉珍貴用材和高效多用途生態公益林樹種。紅錐天然分布於東經95°20′～118°00′，北緯18°30′～25°00′，主產地集中於廣東、廣西、福建南部，其周邊分布在海南、雲南南部、貴州東南部以及湖南、江西等省南部。

紅錐具有生長快、材質優、適應廣、效益高等優良特性。其主幹通直，材質堅硬，呈紅色，色澤和紋理美觀，耐腐蝕性強，不開裂、不變形、易加工，是優質珍貴用材，可供建築、造船、高檔家具、木製地板、軍工用品、體育器材等用。種子富含澱粉，可用於炒食、飼料和釀酒，種實、殼鬥均富含單寧，可提制栲膠。紅錐林萌芽力強，萌條生長迅速，一次造林可採伐10次以上，合理經營可獲利上百年。紅錐枝葉濃密，較耐蔭蔽，混生性能好，可作為用材和水源涵養林進行純林種植，亦可為殘次林改造，生態公益林改造的混交造林。目前我國多個省如廣東、廣西、福建等將紅錐推選為當地區經濟價值高、發展前途大的優良樹種進行推廣，造林面積大，推廣應用前景廣。

目前紅錐人工林栽培所用苗木多採用混採種子育苗，導致苗木及其造林後的林分個體分化大，參差不齊，進而影響到人工林的造林質量、產量及經濟效益。通過科技工作者近十幾年的研究，已選育出一批紅錐優良單株，但由於所選優株數量有限，加之樹齡年輕，結實率低，所收穫種子遠不能滿足造林需求。前期研究表明，紅錐優樹無論採用嫁接還是扦插進行繁殖，繁殖率低，同時存在程度不同的偏冠現象，所繁育苗木難以用於生產。以紅錐優樹萌枝進行組培研究雖有報導，但仍存在出芽慢，無菌系建立困難等問題，難以用於生產。

技術實現要素：

本發明針對現有紅錐組織培養中外植體消毒困難、褐化、初始芽發生率低、芽苗活性差等的技術問題，提供一種紅錐無菌外植體製備及初始芽誘導的方法。

為了實現上述目的，本發明的技術方案如下

一種紅錐無菌外植體製備及初始芽誘導方法，包括外植體準備、外植體消毒處理以及初始芽誘導工序，採集紅錐當年生嫩枝作為外植體，進行消毒處理後，獲得的無菌外植體接種於初始芽誘導培養基中，在適宜環境中培養20-30天後，獲得生長快、活力旺盛的紅錐初始芽，其操作步驟如下：

（1）外植體準備：

在至少連續3天晴朗的氣候裡，採集紅錐的樹冠外圍生長健壯的當年生嫩枝作為外植體；

（2）外植體消毒處理：

將外植體用無菌水衝洗乾淨後，置於體積濃度為0.1-0.3 %的廣譜殺菌劑中浸泡20-30 min，取出外植體將其置於體積濃度為70 %酒精中浸泡1-2 min，再移入體積濃度為5-8 %的氯化汞溶液中浸泡10-20 min，取出放於體積濃度為10-25 %的雙氧水和2-5滴吐溫的混合液中攪拌浸泡20-30 min後，最後用無菌水洗3-4次，每次衝洗3-5 min；將外植體裁成帶至少1個腋芽，1.5-3cm長的莖段，視莖段木質化程度分類置放容器內，備用；

將步驟（2）得到的外植體接種於誘導培養基中；所述的誘導培養基為：改良1/2MS培養基 + IBA 0.5-1.5 mg·L-1 + MT 1.0-3.0 mg·L-1 + 6-BA 1.0-3.0 mg·L-1 + 葡萄糖30 g·L-1 + 瓊脂3.5 g·L-1 + 0.1-0.3 %廣譜殺菌劑；初始芽誘導培養周期為：20-30天，置於溫度：20±3℃，光照培養時間為：16 h，光照強度為：≤1000 lx的環境中進行初始芽誘導培養，獲得生長健壯、活力旺盛的紅錐初始芽。初始芽萌動率在90%以上。

以上所述的改良MS培養基的組成為：KNO3 1350 mg·L-1；NH4NO3 650 mg·L-1；CaCl2·2H2O 180 mg·L-1；MgSO4·7H2O 380 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 460 mg·L-1；KH2PO4220 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3 6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；維生素B1 1.5 mg·L-1；維生素B6 0.6 mg·L-1；煙酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 200 mg·L-1。

優選的，以上適宜條件為：溫度：20±3℃，光照培養時間為：12 h，光照強度為：≤1000 lx。

對比於現有技術，本發明的優點及積極效果如下：

1、本發明選取當年紅錐生嫩枝為組培繁殖材料，外植體的萌芽條幼態化程度高，極大地提高了外植體的有效性，從而成功建立一種紅錐莖段組培方法，本方法對加快紅錐優質壯苗的生產，促進國家硬木用材快速發展，調整林業品種結構具有重大意義。

2、本發明依次採用一定的濃度及消毒時間的廣譜殺菌劑、酒精、氯化汞、雙氧水和吐溫相配合的消毒處理的方式，無菌外植體獲取率高，達到90%以上。

3、本發明使用優化誘導培養基及培養方式，外植體褐化少，初始芽發生率高，芽苗伸長快、活力旺盛，具有較好的經濟效益和社會效益。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明進一步說明。

實施例1：

在至少連續3天晴朗的氣候裡，採集紅錐的樹冠外圍生長健壯的當年生嫩枝作為外植體。將外植體用無菌水衝洗乾淨後，置於體積濃度為0.1 %的廣譜殺菌劑中浸泡30 min，取出外植體將其置於體積濃度為70 %酒精中浸泡1 min，再移入體積濃度為5 %的氯化汞溶液中浸泡20 min，取出放於體積濃度為10 %的雙氧水和2滴吐溫的混合液中攪拌浸泡30 min後，最後用無菌水洗3次，每次衝洗5 min；將外植體裁成帶至少1個腋芽，1.5-2.0cm長的莖段，視莖段木質化程度分類置放容器內，備用；將消毒處理後得到的外植體接種於誘導培養基中；所述的誘導培養基為：改良1/2MS培養基 + IBA 0.5 mg·L-1 + MT 1.0 mg·L-1 + 6-BA 1.0mg·L-1 + 葡萄糖30 g·L-1 + 瓊脂3.5 g·L-1 + 0.1 %廣譜殺菌劑；初始芽誘導培養周期為：20-35天，置於溫度：20±3℃，光照培養時間為：12 h，光照強度為：≤1000 lx的環境中進行初始芽誘導培養，獲得生長健壯、活力旺盛的紅錐初始芽，初始芽萌動率95%。

所述的改良MS培養基的組成為：KNO3 1350 mg·L-1；NH4NO3 650 mg·L-1；CaCl2·2H2O 180 mg·L-1；MgSO4·7H2O 380 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 460 mg·L-1；KH2PO4 220 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3 6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；維生素B1 1.5 mg·L-1；維生素B6 0.6 mg·L-1；煙酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 200 mg·L-1。

實施例2：

在至少連續3天晴朗的氣候裡，採集紅錐的樹冠外圍生長健壯的當年生嫩枝作為外植體。將外植體用無菌水衝洗乾淨後，置於體積濃度為0.2 %的廣譜殺菌劑中浸泡25 min，取出外植體將其置於體積濃度為70 %酒精中浸泡2 min，再移入體積濃度為6 %的氯化汞溶液中浸泡15 min，取出放於體積濃度為15 %的雙氧水和4滴吐溫的混合液中攪拌浸泡25 min後，最後用無菌水洗3次，每次衝洗5 min；將外植體裁成帶至少1個腋芽，2.0-2.5 cm長的莖段，視莖段木質化程度分類置放容器內，備用；將消毒處理後得到的外植體接種於誘導培養基中；所述的誘導培養基為：改良1/2MS培養基 + IBA 1.5 mg·L-1 + MT 2.0 mg·L-1 + 6-BA 2.0 mg·L-1 + 葡萄糖30 g·L-1 + 瓊脂3.5 g·L-1 + 0.1-0.3 %廣譜殺菌劑；初始芽誘導培養周期為：20-25天，置於溫度：20±3℃，光照培養時間為：12 h，光照強度為：≤1000 lx的環境中進行初始芽誘導培養，獲得生長健壯、活力旺盛的紅錐初始芽，初始芽萌動率96%。

所述的改良MS培養基的組成為：KNO3 1350 mg·L-1；NH4NO3 650 mg·L-1；CaCl2·2H2O 180 mg·L-1；MgSO4·7H2O 380 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 460 mg·L-1；KH2PO4 220 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3 6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；維生素B1 1.5 mg·L-1；維生素B6 0.6 mg·L-1；煙酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 200 mg·L-1。

實施例3：

在至少連續3天晴朗的氣候裡，採集紅錐的樹冠外圍生長健壯的當年生嫩枝作為外植體。將外植體用無菌水衝洗乾淨後，置於體積濃度為0.3 %的廣譜殺菌劑中浸泡20 min，取出外植體將其置於體積濃度為70 %酒精中浸泡2 min，再移入體積濃度為8 %的氯化汞溶液中浸泡10 min，取出放於體積濃度為25 %的雙氧水和5滴吐溫的混合液中攪拌浸泡20 min後，最後用無菌水洗4次，每次衝洗3 min；將外植體裁成帶至少1個腋芽，2.5-3cm長的莖段，視莖段木質化程度分類置放容器內，備用；將消毒處理後得到的外植體接種於誘導培養基中；所述的誘導培養基為：改良1/2MS培養基 + IBA 1.0 mg·L-1 + MT 3.0 mg·L-1 + 6-BA 3.0 mg·L-1 + 葡萄糖30 g·L-1 + 瓊脂3.5 g·L-1 + 0.3 %廣譜殺菌劑；初始芽誘導培養周期為：25-30天，置於溫度：20±3℃，光照培養時間為：12 h，光照強度為：≤1000 lx的環境中進行初始芽誘導培養，獲得生長健壯、活力旺盛的紅錐初始芽，初始芽萌動率94%。

所述的改良MS培養基的組成為：KNO3 1350 mg·L-1；NH4NO3 650 mg·L-1；CaCl2·2H2O 180 mg·L-1；MgSO4·7H2O 380 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 460 mg·L-1；KH2PO4 220 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3 6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；維生素B1 1.5 mg·L-1；維生素B6 0.6 mg·L-1；煙酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 200 mg·L-1。